高产杆状病毒的福寿螺精巢细胞系及其构建方法和用途与流程

本发明属于淡水生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种高产杆状病毒的福寿螺精巢细胞系及其构建方法和用途。

背景技术：

自从上世纪初harrison和carrel创立动物组织和细胞的体外培养方法以来,细胞培养技术得到了长足的发展,在基础理论研究和应用研究中都起到了不可替代的重要作用。然而,到目前为止,对于细胞培养技术本身的研究主要集中于脊椎动物(特别是哺乳动物)和昆虫,对于水生无脊椎动物细胞培养的关注却相对较少。在公开刊物发表的有关细胞培养问题的论文中,绝大多数是脊椎动物和昆虫的.

从20世纪60年代开始,研究者开始关注水生无脊椎动物的细胞培养问题,水生无脊椎动物的多种组织和细胞被尝试进行体外培养,包括上皮细胞,血细胞,消化腺,幼体和胚胎组织等。在20世纪70年代便建立了水生无脊椎动物双脐螺胚胎(biomphalariaglabrataembryonie,bge)细胞系(hansen,1976)。bge细胞系是hansen为了研究血吸虫胞坳感染细胞机制于1976年从淡水双脐螺胚胎建立的,后由bayne等完善了冻存方法并提交给atcc(crl-1494)。

细胞系作为研究材料，一直是生理学、分子生物学和发育生物学等科学研究的重要工具，而昆虫细胞系作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义的外源蛋白质，同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。尽管有许多利用昆虫细胞系扩增杆状病毒的报道，然而到目前为止，还未见利用淡水软体动物细胞系生产杆状病毒的报道

福寿螺又名大瓶螺、苹果螺，原产于南美洲亚马逊河流域。1980年前后，因其蛋白质含量丰富，营养成分高且繁殖能力强，而被作为一种水生经济动物被引入菲律宾和日本，并迅速扩散到东亚和东南亚其余国家(halwart，1994)。后来由于市场化失败，福寿螺遭弃养并迅速扩散结果暴发成灾，严重危害作物生产(naylor，1996)。2000年，世界自然保护联盟(worldconservationunion；internationalunionforconservationofnatureandnaturalresources；iucn)外来入侵物种专家委员会将福寿螺列为世界100种恶性外来入侵物种之一(loweetal.，2000),也是其中唯一的一种淡水螺。在我国大陆，福寿螺于1981年引入到广东养殖,1984年后在广东、广西、福建等地开始广泛养殖，随后推广到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成为长江以南大部分省区的严重农业害虫(俞晓平等，2001)。2003年，国家环保总局和中国科学院(2003)将福寿螺列入了首批入侵中国的16种外来物种的“黑名单”

在福寿螺的防治过程中，除农业防治和物理防治外，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活性生物测定需要大量发育一致的福寿螺，对饲养场地有严格的要求，工作量大，而若有离体培养的福寿螺细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对福寿螺的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对福寿螺的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。因此，通过本发明，建立福寿螺细胞系，不仅能增加我国细胞系的数量及种类，还能为日后该类生物细胞系的建立提供借鉴经验。目前，关于福寿螺细胞的体外培养技术及福寿螺细胞系，相关报道较少，国内外仅有福寿螺足组织和外套膜组织细胞的培养(南京师范大学，姜德勋，淡水渔业，2008，38，2：54-59)报道以及福寿螺肌肉、外套膜、肾脏及脑组织的原代培养(韩山师范学院，李绪杰，广东农业科学，2017，44，8：127-132)和申请人所在实验室建立的福寿螺心组织细胞系(授权号：zl2014108388759)。目前，未见有福寿螺精巢组织细胞系建立的报道，也未见有利用淡水软体动物组织细胞系生产杆状病毒的报道。精巢是福寿螺重要的性腺，通过本发明，构建对杆状病毒敏感的福寿螺精巢细胞系将为研究福寿螺性别有关基因功能、性别分化及病害防治提供重要的研究平台。为利用淡水软体动物细胞系分离鉴定水生病毒提供基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种福寿螺精巢组织来源的并具有高度病毒敏感性的细胞系，该细胞系名称为biq-pc-ii。

本发明的另一目的在于提供该细胞系的构建方法。

本发明的又一目的在于提供该细胞系在杆状病毒的大规模生产及使用杆状病毒表达载体表达重组蛋白上的用途。

本发明建立一种高产杆状病毒的福寿螺精巢细胞系的具体步骤如下：

(1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；

(2)选取体重20-30克雄性福寿螺在无菌水中饲养12小时；

(3)将螺浸没在质量百分比浓度为0.1％kmno4水溶液溶液中，进行表面消毒10-15分钟；

(4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺3～5次，用无菌滤纸吸干螺体表面水分；

(5)将福寿螺置于用体积分数70％或75％乙醇消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺，取出福寿螺精巢组织，将精巢组织用生理盐水清洗3-5次，再用pbs清洗2-3次，用灭菌剪刀将精巢组织剪成0.5mm³-1mm³的小组织块；

(6)将(5)处理的小组织块，置于预先盛有1ml-1.5ml细胞原代培养液的t-25cm²细胞培养瓶中，加入胰蛋白酶消化，而后用细胞原代培养液充分悬浮，离心收集沉淀；

(7)向沉淀中加入细胞原代培养液，将培养瓶置于培养箱内,28℃恒温培养；

(8)过夜后，待组织贴壁后，再加入2ml-2.5ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；

(9)每隔5-7天吸出50％～70％量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。

(10)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞传代培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞传代培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功。

整个过程都是在无菌条件下进行的。

本发明所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素b、庆大霉素和动物血清的混合物，ph值为7.0-7.8；所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，ph值为7.0-7.8；所述的昆虫细胞培养液选自商品化的df12培养基，所述的动物血清为胎牛血清；所述的青霉素含量为400u/ml,链霉素含量为400μg/ml,两性霉素b含量为500μg/ml，庆大霉素含量为100μg/ml；所述细胞原代培养液中的动物血清含量为10％～20％(体积比)；所述细胞传代培养液中的动物血清含量为10％-20％(体积比)；所述高产杆状病毒的福寿螺精巢细胞系在杆状病毒的大规模生产上的用途。所述的杆状病毒是对虾杆状病毒。

本发明的有益效果是：采用上述方案，对福寿螺精巢细胞进行了原代培养和传代培养，取得了较好的培养效果。通过接种杆状病毒，发现本发明对杆状病毒敏感，本发明首次证实杆状病毒对淡水软体动物细胞系有感染能力。本发明快速、有效、重复性强，是对淡水软体动物细胞系的重要补充。福寿螺为重要入侵害虫，本发明有助于在离体条件下研究福寿螺，为其防治途径的研究和新型生物农药的开发提供帮助。

本发明中福寿螺精巢细胞系的生物学特征观察和测定

1.经实验观察，该细胞系大部分贴壁生长，细胞的形状大部分圆形，少部分梭形，较少似巨噬细胞形(图1)。

2.以2x10⁵细胞/ml的浓度接种到t-25cm²培养瓶中，27℃无光照培养，每天取一瓶测定细胞浓度，绘制生长曲线(图2)，并按照公式t＝tlg2/[lg(n/n0)]计算群体倍增时间，经过计算第八代的细胞群体倍增时间为86小时。其中

t＝在对数期平均增长一倍所需的时间

t＝接种到测定细胞数的时间

n0＝接种时的细胞数

n＝时刻t所测定的细胞总数

3.用白细胞介素-1β引物，利用daf-pcr的方法鉴定了本发明建立的细胞系的确来源于福寿螺的精巢组织，而非其他细胞系的污染(图3)。由细胞系提供的dna条带与福寿螺dna扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同。

3.本发明所建细胞系对对虾杆状病毒敏感，可以观察到典型的细胞核增大，内含有大量的多角体病毒(图4)。

附图说明

图1培养30天后细胞系的培养形态；

图2细胞系的生长曲线；

图3细胞系的daf-pcr鉴定图谱；

图4细胞系感染核型多角体病毒后获得大量的病毒多角体。

具体实施方式

实施例1.福寿螺精巢细胞系的建立

(1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；

(2)选取体重20-30克雄性福寿螺在无菌水中饲养12小时；

(3)将螺浸没在0.1％kmno4溶液中，进行表面消毒10分钟；

(4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺3次，用无菌滤纸吸干螺体表面水分；

(5)将福寿螺置于用70％醇消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺，取出福寿螺精巢组织，将精巢组织用生理盐水清洗3次，再用pbs清洗2次，用灭菌剪刀将精巢组织剪成0.5mm³的小组织块；

(6)将(5)处理的小组织块，置于预先盛有1ml细胞原代培养液的t-25cm²细胞培养瓶中，加入胰蛋白酶消化，而后用细胞原代培养液充分悬浮，离心收集沉淀；

(7)向沉淀中加入细胞原代培养液，将培养瓶置于培养箱内,28℃恒温培养；

(8)过夜后，待组织贴壁后，再加入2ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；

(9)每隔5-7天吸出50％量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。

(10)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞传代培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞传代培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功。

整个过程都是在无菌条件下进行的。

实施例2福寿螺精巢细胞系的建立

(1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；

(2)选取体重20-30克雄性福寿螺在无菌水中饲养12小时；

(3)将螺浸没在0.1％kmno4溶液中，进行表面消毒15分钟；

(4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺3～5次，用无菌滤纸吸干螺体表面水分；

(5)将福寿螺置于用75％乙醇消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺，取出福寿螺精巢组织，将精巢组织用生理盐水清洗5次，再用pbs清洗3次，用灭菌剪刀将精巢组织剪成1mm³的小组织块；

(6)将(5)处理的小组织块，置于预先盛有1.5ml细胞原代培养液的t-25cm²细胞培养瓶中，加入胰蛋白酶消化，而后用细胞原代培养液充分悬浮，离心收集沉淀；

(7)向沉淀中加入细胞原代培养液，将培养瓶置于培养箱内,28℃恒温培养；

(8)过夜后，待组织贴壁后，再加入2.5ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；

(9)每隔5-7天吸出70％量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。

(10)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞传代培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞传代培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功。

整个过程都是在无菌条件下进行的。

实施例3细胞系的生物学特性观察和测定

(1)形态特征：经显微镜观察，该细胞系贴壁生长，主要有三种细胞形状：大部分圆形，少部分梭形，较少似巨噬细胞形(图1)。圆形细胞占90％，平均直径11.45±1.10μm；梭形细胞长约22.0--38μm，宽平均约11μm；巨噬细胞直径20-21μm之间。

(2)细胞的生长：生长曲线呈典型的“s”，群体倍增时间为86小时(图2)。

(3)daf-pcr鉴定：用白细胞介素-1β设计引物，利用daf-pcr的方法鉴定了本发明建立的细胞系的确来源于福寿螺的精巢细胞，而非其他细胞系的污染(图3)。由细胞系提供的dna条带与福寿螺精巢组织dna扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同

实施例4病毒敏感性和产量的测定

细胞系对对虾杆状病毒多角体病毒敏感性测定：取对数生长期细胞，调配成1x10⁶/ml浓度，接种到培养瓶中，每瓶10ml。培养3小时后，弃去培养基，留下贴壁细胞，将制备好的病毒液接种于该细胞，每瓶100ul。培养7天后，收获细胞及病毒多角体，用血球计数板在显微镜下计数病毒多角体数目，结果本发明所建细胞系所产多角体浓度达16.5x10⁶/pib/ml。同时，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含有大量的多角体颗粒(图4)。说明本发明所建细胞系对杆状病毒敏感。