活体植物保存方法与流程

本发明涉及农业技术领域，具体地说，涉及活体植物保存方法。

背景技术：

玉米是重要的粮、经、饲兼用作物，同时也是制药、油料、酒精工业的主要原料，在世界经济生活中具有非常重要的作用。然而，随着植物科学向分子水平的不断发展，玉米品种在选育和改良过程中经常需要高质量的dna样品。幼嫩且新鲜的玉米叶片提取的基因组dna样品浓度均一、产率高、质量好；但随着叶片的不断生长，玉米叶片中初次生代谢产物如酚类、多糖类、脂类等物质不断的积累，所含dna相对减少，再加上远距离运输，使得dna提取难度增大，纯度降低，质量下降。因此，排除dna提取方法的干扰，玉米叶片的取样方法和保存方法对dna样品的质量也至关重要。

dna是生物体内的遗传物质，是分子生物学研究的主要内容。在分子生物学中为了进行dna测序，利用kasp分子标记进行基因分型，基因杂交以及基因的表达，获得高质量、高纯度的dna是进行玉米分子育种的重要前提。确保玉米基因组dna结构的完整性，并降低dna中金属离子、有机溶剂、蛋白质、多糖等的污染，是进行全基因组测序和分析的重要前提。

目前提取dna的玉米材料多采用新鲜或冷冻材料，对于野外远距离采样或海南冬季种植材料的异地取样，大多采用低温保鲜贮存方式；新鲜离体叶片在运输过程中可能会失水枯萎，或由于细胞破裂，其内容物流出受到dna酶的作用，使得dna降解而质量下降。因此，开发一种新型高效的取样及保存方法对于提高叶片质量和减少检测成本至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供活体植物保存方法。

本发明的另一目的是提供玉米叶片取样及保存方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供活体植物保存方法，将采集的活体植物或活体植物部位放入样品管中，然后将样品管置于带盖样品架中，将海绵板置于样品管上方，并盖好样品架的盖子，将盖好盖子的样品架装入放有干燥剂的自封袋内，封袋存放。

优选地，所述海绵板的尺寸与样品架的尺寸大小相同。所述海绵板的材质优选聚氨酯，颜色优选黑色。所述海绵板的厚度为5-7mm，优选5mm。

所述样品架及其盖子之间设有锁扣结构，可将盖子固定在样品架上。

可选地，用弹性皮筋(橡皮筋)固定好加盖的样品架，防止样品倒出混样。

本发明中，所述植物部位包括根、茎、叶、花、果实、种子，优选叶。

所述植物包括但不限于水稻、玉米，优选玉米。

优选地，所述干燥剂为二氧化硅干燥剂。

本发明中，必须保证自封袋完整，不能出现封口不严或自封袋本身破损的现象。

第二方面，本发明提供玉米叶片取样及保存方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜玉米叶片取样于样品架上的空白样品管中；

(2)当一个样品架完成取样后，将海绵板置于样品管上方，并盖好样品架的盖子；

(3)将盖好盖子的样品架置于放有冰袋的容器(如泡沫盒)中(冰袋在田间取样时能够保证叶片凉爽和干燥)，短期存放；或者，

将盖好盖子的样品架装入放有干燥剂的自封袋内，封袋后长期存放。

所述短期是指存放时间1-7天。

所述长期是指存放时间80-100天(一般3个月左右)。

所述干燥剂的用量取决于样品重量。优选地，每5g样品需二氧化硅干燥剂40g左右。

进一步地，可利用育种软件prism自动生成96孔板样品顺序编号以及二维码，将样品顺序编号和二维码粘贴在样品架上。取样者可根据样品顺序编号和二维码信息在玉米田中精确采样。

对于样品dna提取来说，如果现取现提，采集玉米苗期幼嫩叶片最好，此时叶片代谢物少，提取dna较容易；如果是异地取样，一般建议采集拔节期后，授粉前的叶片。

第三方面，本发明提供活体植物保存装置，所述装置的本体为带盖样品架，还包括可插入样品架的样品管，以及至少一块海绵板。

优选地，所述海绵板的尺寸与样品架的尺寸大小相同。

所述样品架及其盖子之间设有锁扣结构，可将盖子固定在样品架上。

使用时，将采集的活体植物或活体植物部位放入样品管中，然后将样品管置于带盖样品架中，将海绵板置于样品管上方，然后盖好样品架的盖子，防止样品倒出混样。

可与上述装置配套使用的材料还包括自封袋、弹性皮筋(橡皮筋)、干燥剂包、运输箱等。

将盖好盖子的样品架装入放有干燥剂的自封袋内，封袋后装箱，特别适合于样品的常温长途运输。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的活体植物保存方法，能够有效提高长途常温运输植物(特别是叶片)的保鲜度及质量。

(二)本方法可用于实验室分子标记及其他分子生物学实验取样，提取的dna浓度比现有的方法可提高2-3倍，且dna主带清晰，适用于测序及各类分子检测。

(三)本方法采用二氧化硅干燥剂使植物(特别是叶片)在运输途中处于干燥的环境中。

(四)完好无损的自封袋保证植物(特别是叶片)在运输途中不会吸入空气中的水分及氧气，保证叶片的新鲜度。

(五)本发明提供一种玉米叶片取样新方法，使用打孔器将叶片取样于空白样品管中，然后将样品管置于96孔样品架上，可直接进行dna提取，提高检测效率达50％及以上。

(六)采用本发明的取样方法可使玉米叶片在常温下保存长达3个月，并且不会影响高质量dna的提取。

(七)本发明提供一套玉米叶片取样和保存的标准化方法及流程，可在分子标记检测中广泛应用。

(八)本发明在样品架内放置海绵板(海绵板置于样品管上方)，取代常规的给每个样品管加上盖子的做法，更有利于叶片的水分散失，在运输过程中避免叶片dna损失或降解。利用海绵板既起到封口作用，又能够透气使试管中的水分散发出来(防止因局部温度升高不透气导致叶片发霉)，通过干燥剂对水分进行吸附。采用本方法保存的叶片，常温条件下可以保存3个月。

(九)本发明利用打孔器在田间按照实验目的和样品架上的顺序标号以及二维码信息进行准确和定量的玉米叶片取样，在田间即可完成96孔样品架的取样，送至实验室后可直接进行dna提取。相比目前普遍采用的方法，既能够提高叶片的质量，又可以节约大量的人力成本和降低取样错误率。

附图说明

图1为本发明带盖样品架照片。

图2为本发明样品管插入样品架的示意图。

图3为本发明玉米叶片取样器照片。

图4为本发明样品架储存箱照片。

图5为本发明冰袋照片。

图6显示本发明实施例1中所取叶片大小。

图7为本发明实施例1中新鲜玉米叶片取样过程。

图8为本发明海绵板照片。

图9为本发明干燥剂包照片。

图10显示本发明实施例1中将样品架与盖子用锁扣锁好。其中，1和2：门闩穿过盖子上的孔，3：锁扣被推到锁定的位置，4：确保盖子在正确的位置，即当从样品架正面观时，盖子上“thermo”的标志是正确的。

图11显示本发明实施例1中使用橡皮筋固定样品架。

图12显示本发明实施例1中将样品架置于放有冰袋的泡沫盒中。

图13显示本发明实施例1中将样品架置于塑料自封袋中。

图14显示本发明实施例1中将准备好的样品置于邮寄纸箱中进行邮寄。

图15显示本发明实施例1中实验室样品处理。

图16显示本发明实施例1中烘箱中干燥干燥剂(左)以及样品保存(右)。

图17为本发明实施例1中两种保存方法下所提取的玉米叶片dna的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，a：常规保存方法，b：本发明方法。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1快速、高效、高质量的玉米叶片取样及保存方法

1、实验耗材及仪器

带盖样品架(图1)、样品管、玉米叶片取样器、样品架储存箱(泡沫盒，图4)、生物冰袋(图5)、海绵板(图8)、二氧化硅干燥剂包(图9)。

4ml空白样品管插入样品架的示意图见图2。

所述海绵板为黑色，其材质为pu(聚氨酯)海绵，厚度为5mm。

2、玉米叶片的取样及保存

(1)取样：根据样品的取样顺序，使用取样器(图3)将新鲜玉米叶片取样(图7)于样品架上的空白样品管中。所取叶片大小见图6。

(2)样品架处理：当一个样品架完成取样后，将海绵板置于样品管上方，并盖好样品架的盖子。如果已经将样品架与盖子使用锁扣锁好，则无需使用橡皮筋进行固定(图10)；如果没有，应使用橡皮筋固定样品架，防止样品倒出混样(图11)。

(3)取样期间样品保存：在收集样品时保持叶片凉爽和干燥，如果需要，可将样品架置于放有冰袋的泡沫盒中(图12)。

(4)样品处理：在工作间或室内将锁好的样品架置于塑料自封袋中(确保自封袋完好无损)。为了保证叶片等的干燥环境，每个自封袋仅可放入一个样品架。封袋之前加入适量的干燥剂包。1-8片叶加入1g的二氧化硅干燥剂包30-40个，9-15片叶加入60-70个干燥剂包，干燥剂可重复使用，无需精确地规定干燥剂的使用量。(图13)

(5)邮寄：将准备好的样品置于邮寄纸箱中进行邮寄，无需放置冰袋(图14)。

(6)实验室样品处理：将样品邮寄至实验室之后，取出样品架并将样品架置于4℃备用。收集干燥剂并将干燥剂包置于65℃的烘箱中干燥3小时，然后保存可反复使用(图15和图16)。

采用本方法可使玉米叶片保存3个月左右，且叶片中初次生代谢产物如酚类、多糖类、脂类等物质含量低，所提取的玉米基因组dna质量高。

分别利用本发明方法和常规低温贮藏的方法采集相同数量和质量的样品。

常规方法为：人工采集玉米叶片置于硫酸授粉袋中，置于泡沫盒中添加生物冰袋邮寄。本发明采集的样品常温就可以邮寄。将普通方法所采集的样品抵达实验室后，仍需要分别取样于96孔板中，方能够进行dna提取。而本发明方法在田间已经分装到96孔样品架中，回到实验室直接就可以进行dna提取。采用ctab法提取两种方法保存的叶片dna，同时对样品dna进行质量检测。

比较两种保存方法下提取的dna，发现常规保存方法下的样品在dna样品管底部常会出现黑色沉淀，而本发明保存方法下提取的叶片dna则没有。使用2.0测定dna浓度，发现两种方法提取的dna浓度存在明显差异，本发明方法采集样品的dna浓度是普通方法的2-3倍。使用1％琼脂糖凝胶，120v，20min电泳检测玉米基因组dna结构的完整性，图17结果显示，常规保存方法所提取的dna出现明显的降解，甚至看不到主带，而本发明保存方法下提取的叶片dna则主带清晰明显，说明dna完整性较好并无降解，这与2.0测定的dna浓度结果相一致。

本发明提供的玉米叶片取样的高效化操作流程，能够有效提高常温下长途运输叶片的质量，该流程可用于实验室分子标记及其他分子生物学实验取样，为各类检测提供高质量的玉米基因组dna样品。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。