小球藻多糖的制备方法与流程

本发明涉及藻类技术领域。更具体地说，本发明涉及一种小球藻多糖的制备方法。

背景技术：

小球藻(chlorellasp.)是一类普生性单细胞绿藻，生态类型多样，分布广泛，在海水、淡水中均有分布。小球藻体内含有丰富的高价值生物活性物质，因此在医药、食品饲料添加剂、化妆品、能源等领域具有广泛的应用价值。并有“药物藻类”的美称。多糖是小球藻活性提取物中重要组成部分之一，大量研究表明小球藻多糖具有调节机体免疫活性、抗肿瘤、减轻重金属离子对机体的毒害等作用。此外小球藻多糖还可以清除各种自由基以保护机体，起到一定的抗氧化作用。

现有的小球藻多糖的提取技术大多存在工艺复杂、产糖效率、收率纯度低、得到的小球藻多糖的活性较低等缺陷，需对工艺进行进一步地改进。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种小球藻多糖的制备方法，其通过优化培养基中各种营养盐的配比，达到提高球藻多糖产率、增强球藻多糖抗氧化活性、提升球藻多糖对自由基的清除能力，且本发明的制备方法简单，可操作性较强。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种小球藻多糖的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、将对数期球藻种接种至培养基中，进行培养；培养基为bg-11培养基，培养基中mgso4·7h2o的浓度为112.5mg/l，k2hpo4浓度为60mg/l，nano3浓度为1.2g/l；

步骤二、培养至稳定期后，将培养液进行离心分离，收集沉淀，得藻泥；

步骤三、向步骤二得到的藻泥中加入3倍重量的无水乙醇，随后置于4℃冰箱中过夜，然后进行离心分离，收集沉淀，并置于60℃的烘箱中烘干，得藻粉；

步骤四、取步骤三得到的藻粉，提取小球藻多糖。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，步骤四具体为：向步骤三得到的藻粉中加入提取液，超声振荡处理20min，然后将藻粉和提取液的混合物置于80℃的水浴中加热，2h后取出，冷却至室温后离心分离，取上层清液，向上层清液中加入3倍体积的无水乙醇，并置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并向该沉淀中加入质量分数为3％的三氯乙酸溶液，充分搅匀至沉淀不再溶解，于4℃下离心，取上清液，得多糖提取物，将多糖提取物过0.45um的微孔过滤膜，收集滤液，向滤液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并冷冻干燥，即得小球藻多糖。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，培养基中加入有浓度分别为0.5mg/l和0.1μg/l的维生素b1和维生素b12。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，步骤一中，接种培养条件为：光照强度2000lux，暗光比：12/12，温度为24±1℃。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，步骤四中的提取液为体积分数为4％的naoh水溶液，干藻粉与naoh的物料比为1:25。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，步骤四中，超声振荡的功率为80w。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，步骤一～步骤四中的离心处理的转速均为4800r/min。

优选的是，所述的小球藻多糖的制备方法，球藻种为小球藻ec04或小球藻dc01。

本发明至少包括以下有益效果：本发明通过优化培养基中各种营养盐的配比，达到提高球藻多糖产率、增强球藻多糖抗氧化活性、提升球藻多糖对自由基的清除能力，且本发明的制备方法简单，可操作性较强。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为葡萄糖浓度的标准曲线；

图2为营养盐mgso4·7h20单因素实验结果；

图3为营养盐k2hpo4单因素实验结果；

图4为营养盐nano3单因素实验结果；

图5为维生素b1单因素优化结果；

图6为维生素b12单因素优化结果；

图7为小球藻多糖的紫外扫描结果；

图8为小球藻多糖的红外光谱分析结果；

图9为小球藻多糖对dpph·的清除率；

图10为小球藻多糖对·oh的清除率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>

本发明提供一种小球藻多糖的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、将对数期球藻种接种至培养基中，进行培养；培养基为bg-11培养基，培养基中mgso4·7h2o的浓度为112.5mg/l，k2hpo4浓度为60mg/l，nano3浓度为1.2g/l；培养基中加入有浓度分别为0.5mg/l和0.1μg/l的维生素b1和维生素b12；接种培养条件为：光照强度2000lux，暗光比：12/12，温度为24±1℃；

步骤二、培养至稳定期后，将培养液进行离心分离，收集沉淀，得藻泥；

步骤三、向步骤二得到的藻泥中加入3倍重量的无水乙醇，随后置于4℃冰箱中过夜，然后进行离心分离，收集沉淀，并置于60℃的烘箱中烘干，得藻粉；

步骤四、取步骤三得到的藻粉，提取小球藻多糖，具体为：向步骤三得到的藻粉中加入提取液，超声振荡处理20min，然后将藻粉和提取液的混合物置于80℃的水浴中加热，2h后取出，冷却至室温后离心分离，取上层清液，向上层清液中加入3倍体积的无水乙醇，并置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并向该沉淀中加入质量分数为3％的三氯乙酸溶液，充分搅匀至沉淀不再溶解，于4℃下离心，取上清液，得多糖提取物，将多糖提取物过0.45um的微孔过滤膜，收集滤液，向滤液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并冷冻干燥，即得小球藻多糖；

其中，球藻种为小球藻ec04；

步骤一～步骤四中的离心处理的转速均为4800r/min；

步骤四中，提取液为体积分数为4％的naoh水溶液，干藻粉与naoh的物料比为1:25；超声振荡的功率为80w。

<实施例2>

本发明提供一种小球藻多糖的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、将对数期球藻种接种至培养基中，进行培养；培养基为bg-11培养基，培养基中mgso4·7h2o的浓度为112.5mg/l，k2hpo4浓度为60mg/l，nano3浓度为1.2g/l；培养基中加入有浓度分别为0.5mg/l和0.1μg/l的维生素b1和维生素b12；接种培养条件为：光照强度2000lux，暗光比：12/12，温度为24±1℃；

步骤二、培养至稳定期后，将培养液进行离心分离，收集沉淀，得藻泥；

步骤三、向步骤二得到的藻泥中加入3倍重量的无水乙醇，随后置于4℃冰箱中过夜，然后进行离心分离，收集沉淀，并置于60℃的烘箱中烘干，得藻粉；

步骤四、取步骤三得到的藻粉，提取小球藻多糖，具体为：向步骤三得到的藻粉中加入提取液，超声振荡处理20min，然后将藻粉和提取液的混合物置于80℃的水浴中加热，2h后取出，冷却至室温后离心分离，取上层清液，向上层清液中加入3倍体积的无水乙醇，并置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并向该沉淀中加入质量分数为3％的三氯乙酸溶液，充分搅匀至沉淀不再溶解，于4℃下离心，取上清液，得多糖提取物，将多糖提取物过0.45um的微孔过滤膜，收集滤液，向滤液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃的冰箱中，静置一夜后取出并离心收集沉淀，并冷冻干燥，即得小球藻多糖；

其中，球藻种为小球藻dc01；

步骤一～步骤四中的离心处理的转速均为4800r/min；

步骤四中，提取液为体积分数为4％的naoh水溶液，干藻粉与naoh的物料比为1:25；超声振荡的功率为80w。

1.材料与方法

1.1材料

藻种：以小球藻ec04为例进行说明，本实验室诱变藻种。

1.2培养条件优化

1.2.1营养盐优化

以bg-11基础培养基为对照，调整营养盐浓度：

mgso4·7h20浓度分别设置为：37.5mg/l、75mg/l、112.5mg/l、150mg/l、187.5mg/l；

k2hpo4浓度分别设置为：20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l；

nano3浓度分别设置为：0.4g/l、0.8g/l、1.2g/l、1.6g/l、2.0g/l。

营养盐的正交实验选用最佳单因素优化值以及其邻值进行四因素三水平正交试验优化。如表1所示：

表1营养盐优化正交实验表

1.2.2维生素优化

在最佳营养盐条件下设置

vb1的浓度值分别为0.2mg/l、0.4mg/l、0.6mg/l、0.8mg/l、1.0mg/l；

vb12的浓度值分别为：0μg/l、0.05μg/l、0.1μg/l、0.15μg/l、0.2μg/l；

1.2.3小球藻生物量测定

采用血球计数板进行统计。

1.2.4多糖含量的测定及葡萄糖标准曲线的绘制

1.2.4.1多糖测定方法

苯酚-硫酸法，单位为mg/g干重。

1.2.4.2葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖为标准品绘制标准曲线如图1所示，线性回归方程为y＝0.0068x-0.0408r²＝0.9978

1.2.5紫外光谱分析

将多糖样品配置成0.1％浓度的水溶液，在tu-1901双光束紫外可见分光光度计上对200-400nm进行波谱扫描。

1.2.6红外光谱分析

取1mg干燥多糖样品，与100mg干燥kbr粉末混合，红外灯下于玛瑙体中均匀研磨后经压片机压成薄片，上机测定。

1.2.7胞内多糖的抗氧化活性初探

1.2.7.1胞内多糖对dpph·的清除作用

取2ml不同浓度(0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml)的多糖样品溶液，加入2ml现配的0.16mmol/l的dpph甲醇溶液中，振荡混匀，避光室温下保存30min，以甲醇溶剂^[9]做空白对照，用紫外分光光度计测量其在517nm处吸光度(ai)，2mldpph甲醇溶液与2ml甲醇混合后在517nm处吸光度(a0)以及2ml甲醇溶液与2ml样品溶液在517nm处的吸光度(aj)。按下列公式计算dpph·清除率。

dpph·清除率％＝[1-(ai-aj)/a0]×100

另取去离子水作为阴性对照。

1.2.7.2胞内多糖对·oh的清除作用

采用邻二氮菲法^[10]进行实验，吸取7.5mmol/l的邻二氮菲0.15ml，加入ph7.4的pbs溶液0.4ml，0.25ml去离子水以及0.75mmol/l硫酸亚铁溶液0.1ml振荡混匀。加入0.1ml不同待测样品和0.1ml1％的双氧水(现配)的反应管记作a0；二者均不加记作a1，只加入0.1ml不同待测样品的反应管记作a；加入0.1ml去离子水和0.1ml1％双氧水(现配)的反应管记作a2。a0a1a2a均在37℃恒温箱中保温60min，去离子水调零，用紫外分光光度计测定其在536nm处吸光度，根据下列公式计算·oh清除率。

·oh清除率＝[1-(a-a0)/(a1-a2)]×100

另取去离子水作为阴性对照。

1.2.3数据处理

实验数据采用spss19.0软件包进行数据分析，p<0.05为差异性显著，p<0.01为差异极显著。

2、结果和分析

2.1培养条件优化实验结果

2.1.1营养盐单因素优化实验结果

如图2～4所示，以基础培养基作为原始对照组，其中ec04的多糖产率和细胞密度分别为137.6mg/g和35.6×10⁶个/ml。由图2可知逐渐加大mgso4·7h20浓度时，多糖产率也逐渐增大，当浓度增大到112.5mg/l时，多糖产率达到最大值；然后mgso4·7h20继续升高，ec04多糖产率反而下降。由图3可知当k2hpo4浓度在20-60mg/l时，ec04多糖产率随之增加，随着k2hpo4浓度的持续增加，多糖产率迅速降低。改变nano3浓度时,ec04多糖产率变化十分显著。由图4可知当nano3浓度低于1.2g/l时，多糖产率呈上升趋势，在nano3浓度为1.2g/l时达到最大；随后nano3浓度继续增加，小球藻多糖产率显著下降。此时ec04胞内多糖产率为原始对照组的1.71倍。

以细胞密度为考察主体时，增大mgso4·7h20浓度，细胞密度改变不大，影响不显著。随着k2hpo4和nano3浓度的增大，细胞密度也随之增大。当k2hpo4和nano3浓度分别为100mg/l和2.0g/l时，细胞密度最大。

2.1.2营养盐正交优化实验结果

表3营养盐对多糖产率和生物量的正交实验结果及直观分析

表4营养盐正交试验l9(3⁴)的方差分析表

(a)

(b)

由表3、表4(a)和(b)可知，营养盐单因素优化结果显示单独增加适量的mgso4·7h2o、k2hpo4都能提高ec04胞内多糖的产率，相比于原始对照组产率分别增加了23.82％、48.98％。nano3的降低使ec04胞内多糖的产率增多，当其浓度降为1.2g/l时，ec04的胞内多糖产率到达最大，比原始对照组增加了75.07％。正交实验表(表3)显示影响ec04胞内多糖产率的最主要因素是nano3，其次是mgso4·7h2o和k2hpo4。表4(a)显示三种营养盐对ec04的胞内多糖产率影响均显著(p<0.05)，其中nano3影响极显著(p<0.01)。ec04胞内多糖产率最高实验组的组合应为mgso4·7h2o112.5mg/l，k2hpo460mg/l，nano31.2g/l。经检验，在此条件下ec04的多糖产率为238.03mg/g，与原始对照组相比提高了81.71％。此时小球藻ec04的细胞密度为47.98×10⁶个/ml。

正交实验中，小球藻细胞密度也有显著提高，由极差看出影响小球藻细胞密度的最主要因素是k2hpo4，其次为nano3和mgso4·7h2o。表4(b)显示nano3和k2hpo4对小球藻细胞密度影响显著(p<0.05),其中k2hpo4的影响极显著(p<0.01)。mgso4·7h20对小球藻ec04细胞密度的影响不显著(p>0.05)。

2.1.3维生素单因素优化结果

以营养盐优化后的培养基作为二次对照组，向培养基中添加vb1和vb12。由图5和图6可知随着vb1、vb12浓度的升高，ec04胞内多糖产率均为先上升而后下降的趋势。达到最高值时的浓度分别为vb10.5mg/l，vb120.1μg/l，多糖产率分别为250.93mg/g和271.74mg/g。ec04细胞密度随vb1，vb12的浓度的改变影响不显著(p>0.05)。加入vb10.5mg/l，vb120.1ug/l后的细胞密度为48.027×10⁶个/ml

2.2小球藻多糖紫外光谱扫描结果

提取胞内多糖进行紫外光谱扫描，结果如图7所示，在260nm和280nm处均无吸收峰，表明多糖样品中无核酸及蛋白质。

2.3小球藻多糖红外光谱分析结果

如图8所示，红外分析结果表明，多糖在3731.81cm^-1和3453.93cm^-1处有吸收峰，此为-oh伸缩振动引起的吸收；2992.59cm^-1处吸收峰为糖类饱和c-h振动吸收；1693.99cm^-1处吸收峰为糖醛酸吸收峰，说明多糖中具有糖醛酸基团。1454.37cm^-1处吸收峰为＝ch2的变形吸收峰。1250～950cm^-1之间的吸收峰是吡喃糖环的醚键(c-o-c)和羟基的吸收峰。863.95cm^-1是吡喃糖环上次甲基的横摇振动，证明此多糖为吡喃糖。说明小球藻多糖含有带糖醛酸基团的吡喃糖。

2.4小球藻多糖的抗氧化活性结果

2.4.1小球藻多糖对dpph·的清除能力

如图9所示，当有自由基清除剂存在时，dpph·的单电子会与之配对从而吸收逐渐消失，且褪色程度取决于抗氧化剂的供氢能力^[11]。由图6可知，在0.5～3mg/ml内，多糖对dpph·清除能力随着浓度的增加而增强，其ic50为1.445mg/ml。当样品浓度为3mg/ml时，对dpph·的清除率可以达到82.32％。

2.4.2小球藻多糖对·oh的清除能力

如图10所示，·oh化学性质特别活泼，也是毒性最大的自由基，几乎与细胞内各类有机物反应^[12]，实验结果表明随着多糖浓度的升高，在浓度达到3mg/ml时，羟基清除率达到64.27％。其ic50为2.152mg/ml。

3、讨论

营养盐浓度是微藻细胞合成代谢产物的主要限制因素^[13]。在一定程度上改变n源和p源均影响小球藻ec04细胞内总糖的合成，浓度过大则会抑制胞内多糖的产生。

so4^2-浓度的提高能促进多糖的合成，mg²⁺参与叶绿素和菌绿素等光合色素，同时也是一些酶作用的激活剂或调节剂，对某些重金属产生的生物细胞毒害还具有一定的拮抗作用。因此，适量提高mgso4·7h2o浓度有利于微藻光合作用以及碳水化合物的积累，但是浓度过大反而会有抑制效果。

p是遗传物质核酸和生物膜的重要组成部分，在核酸、蛋白及磷脂等代谢中有重要作用，微藻进行光合作用的暗反应时需利用atp和nadph的化学能将co2固定并还原成糖或者其他有机物，atp和nadph的形成也需要大量p。因此适量的提高p源有利于微藻光合作用暗反应的进行和多糖的积累。

n是蛋白质等大分子物质的重要组成部分，而蛋白质是生命活动的执行者。n限制时会引起蛋白质含量丰富的色素体的生成减少，从而影响光合效率。伴随着n胁迫，微藻内多糖等碳水化合物会快速降解为脂肪酸合成提供代谢物，n浓度过高也会对多糖的合成起抑制作用。本实验结果表明适量降低nano3浓度ec04胞内多糖产率增高，此后随着nano3浓度的继续降低，ec04胞内多糖显著降低。

维生素作为生长因子维持微藻的基本生长需求，在本实验中vb1、vb12也在不同程度上影响小球藻ec04胞内多糖含量。vb1、vb12对小球藻多糖产率有影响的机理可能是它们作为各类辅酶的组成成分，参与到微藻的代谢中。

微藻多糖具有良好的成膜性能，可以作为良好的抗氧化剂，多糖的抗氧化活性一般与其所带硫酸根含量有关。本实验显示小球藻多糖中无硫酸根可能是因为培养基成分不同导致多糖的组成成分及所带基团不同。抗氧化实验表明小球藻胞内多糖仍具有清除dpph﹒和·oh的能力，且效果略低于vc。我们推断自由基清除能力也许跟多糖所含糖醛酸含量有关，且糖醛酸含量越高，抗自由基能力越强。其作用机制可能是由于自由基引起糖醛酸链断裂从而达到清除自由基的效果。

最终确定本发明制备方法中，球藻种(ec04)接种培养的优化条件为：在暗光比12/12、温度24±1℃、2000lux光照条件下，培养基中各营养盐的浓度：mgso4·7h20浓度为112.5mg/l，k2hpo4浓度为60mg/l，nano3浓度为1.2g/l；培养基中加入了维生素：维生素b1的浓度为0.5mg/l，维生素b12的浓度为0.1μg/l。在上述优化条件下，ec04产糖率为271.74mg/g，细胞密度为48.027×10⁶个/ml，与基础培养基相比分别提高了97.49％和34.91％。添加vb1、vb12等也在不同程度上影响小球藻胞内多糖产率。对所提取胞内多糖进行抗氧化活性初探，结果表明其具有一定的dpph·、·oh等自由基的清除能力，dpph·和·oh最大清除率分别达到了82.32％和64.27％。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。