AXMI115变体灭虫基因及其使用方法与流程

文档序号：18265708发布日期：2019-07-27 09:07阅读：477来源：国知局

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发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫(pesticidal)蛋白的新基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列可以用于制备杀虫制剂以及生产抗害虫转基因植物。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensi)是革兰氏阳性产孢子土壤细菌，其特征在于能够产生针对某些昆虫目和种具有特异性毒性，但是对植物和其它非靶标有机体却无害的晶状包涵体。由此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其灭虫(insecticidal)蛋白的组合物可用作环境可接受的灭虫剂，以控制农业害虫或引起多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自于苏云金芽孢杆菌的晶体(cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目(lepidopteran)、半翅目(hemipteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)幼虫的强效灭虫活性。这些蛋白还显示出针对膜翅目(hymenoptera)、同翅目(homoptera)、虱毛目(phthiraptera)、食毛目(mallophaga)和蜱螨目(acari)害虫以及其它无脊椎动物(例如线形动物门(nemathelminthes)、扁形动物门(platyhelminthes)和sarcomastigorphora的活性(feitelson(1993)thebacillusthuringiensisfamilytree.inadvancedengineeredpesticides,marceldekker,inc.,newyork,n.y.)。该晶体蛋白直到被摄取并且溶解于昆虫中肠内才表现出灭虫活性。摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成具有活性的毒素分子(andwhiteley(1989)microbiol.rev.53:242-255)。该毒素在靶标幼虫的中肠内结合到顶端刷状缘受体上，并插入到顶膜中，产生离子通道或孔道，从而导致幼虫死亡。

除了内毒素之外，苏云金芽孢杆菌在其营养生长期还产生分泌的灭虫蛋白，即营养期杀虫蛋白(vip)。自从发现第一种vip毒素以来，在苏云金芽孢杆菌中已经鉴定出了两个主要类型的vip毒素。一类vip毒素由毒素双体组成，所述毒素双体由两种组分vip1和vip2构成(warren(1997)inn.b.carozziandm.g.koziel(ed.),advancesininsectcontrol:theroleoftransgenicplants.taylor&francis,london,unitedkingdom)。vip1和vip2的组合对农业上重要的昆虫西部玉米根虫(diabroticavirgifera)具有高度的灭虫活性，但是对任何鳞翅目昆虫却未表现出任何杀虫活性(hanetal.(1999)nat.struct.biol.6:932-936)。另一类由vip3毒素组成，其与vip1或vip2没有序列相似性。首个被鉴定的vip3毒素vip3aa1对玉米和棉花的几种主要鳞翅目害虫，包括秋天行军虫草地夜蛾(spodopterafrugiperda)和棉铃虫谷实夜蛾(helicoverpazea)，具有高度的灭虫活性，但对玉米的一种主要害虫欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)却未显示出活性(estruchetal.(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:5389-5394)。从苏云金芽孢杆菌菌株中删除vip3aa1基因导致该苏云金芽孢杆菌菌株的灭虫活性显著降低，表明vip3贡献了苏云金芽孢杆菌菌株总体毒性(donovanetal.(2001)j.invertebr.pathol.78:45-51)。还观察到vip3aal通过形成细胞膜孔(leeetal.(2003)appl.environ.microbiol.69:4648-4657)使昆虫中肠细胞裂解(yuetal.(1997)appl.environ.microbiol.63:532-536)而杀死昆虫。

基于苏云金芽孢杆菌的灭虫剂的集中使用已经使小菜蛾(plutellaxylostella)的田间种群的抗性增强(ferréandvanrie(2002)annu.rev.entomol.47:501-533)。最常见的抗性机制是毒素与其特异性中肠受体的结合减少。这可能也会赋予对共用相同受体的其它毒素的交叉抗性(ferréandvanrie(2002))。

发明概述

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和灭虫多肽序列的核酸分子、含有该些核酸分子的载体，以及含有该些载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列和该些多肽的抗体。核苷酸序列可用于dna构建体和表达盒中，以进行转化和在有机体(包括微生物和植物)中表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在有机体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含含有本发明核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

具体地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。此外，还包括对应于杀虫蛋白的氨基酸序列。具体地，本发明提供了包含编码融合蛋白的核苷酸序列的分离或重组的核酸分子及其生物学活性变体和片段，其中所述融合蛋白包含seqidno:43的c末端部分。在多个实施方案式中，融合蛋白包含seqidno:45的n末端部分。在特定的实施方案中，本发明所包括的核酸分子(包括含有核酸分子的载体、宿主细胞、植物和种子)包括seqidno:47和1-14中所示的核苷酸序列，或编码seqidno:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物学活性变体和片段。还包括与本发明核苷酸序列互补的，或与本发明序列或其互补序列相杂交的核苷酸序列。本文中还包括由本发明核酸分子编码的分离或重组的融合蛋白。

提供了产生本发明的多肽的方法，以及利用那些多肽控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类(nematode)或双翅目害虫的方法。还包括用于检测样品中本发明核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的组合物和方法有利于生产具有增强的抗虫性或耐虫性的有机体。这些有机体以及包含有机体的组合物期望用于农业。本发明的组合物还有利于生产具有杀虫活性的经改变或改良的蛋白，或者用于检测产品或有机体中杀虫蛋白或核酸的存在。

附图简述

图1显示融合构建体的图示

图2显示体外叶盘(leafdisk)生物测定的结果。pag6585含有optaxmi115v01(n＝14)，pag6141含有optaxmi115v02.01.01(n＝8)。

详细描述

本发明涉及用于调控有机体特别是植物或植物细胞中害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”意指害虫(例如昆虫)在摄取或与本发明多肽进行其它接触之后被杀死。“耐受性”意指害虫的移动、采食、生殖或其它功能受损或减少。所述方法涉及用编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列转化有机体。具体地，本发明的核苷酸序列有利于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是芽孢杆菌或其它物种的杀虫核酸和蛋白。该序列可以用于构建随后转化到目标有机体中的表达载体、用作分离其它同源(或部分同源)基因的探针，以及用于通过本领域已知方法产生改变的杀虫蛋白，例如与vip1、vip2或vip3毒素家族的成员发生结构域交换或dna改组。该蛋白可以用于控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目和线虫类害虫群体以及生产具有杀虫活性的组合物。

“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指针对一种或多种害虫(包括但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或线虫动物门的成员)具有毒性活性的毒素，或与这种蛋白具有同源性的蛋白。已经从如下有机体中分离出了杀虫蛋白，包括例如芽孢杆菌属，双酶梭菌(clostridiumbifermentans)和日本甲虫类芽孢杆菌(paenibacilluspopilliae)。杀虫蛋白包括由本文所公开的全长核苷酸序列推论得到的氨基酸序列，以及短于全长序列的氨基酸序列(其由于使用了位于下游的任意起始位点或者是由于产生具有杀虫活性的较短蛋白的加工过程所造成)。加工过程可发生在表达蛋白的有机体中，或摄食蛋白后的害虫中。

因此，本文提供了赋予杀虫活性的新的分离或重组核苷酸序列。这些核苷酸序列编码与已知毒素具有同源性的多肽。还提供了杀虫蛋白的氨基酸序列。此基因翻译得到的蛋白使得细胞能够控制或杀死摄食该蛋白的害虫。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及包含编码杀虫蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针的核酸分子，其以识别编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子。本文还包括能够在本文中别处所定义的严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。如本文所使用，术语“核酸分子”意在包括dna分子(例如，重组dna、cdna或基因组dna)和rna分子(例如mrna)以及使用核苷酸类似物所产生的dna或rna类似物。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链dna。

本文所使用的“分离的”或“重组的”核酸序列(或dna)是指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者处于重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或dna)。在一些实施方案中，分离或重组的核酸(优选蛋白编码序列)不含在该核酸所来源的有机体基因组dna中天然位于该核酸侧翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。出于本发明的目的，当使用“分离的”描述核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在多个实施方案中，编码δ-内毒素的分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在该核酸所来源的细胞基因组dna中天然位于该核酸分子侧翼。在多个实施方案中，基本上不含细胞物质的δ-内毒素蛋白包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重量)非δ-内毒素蛋白(在本文中也被称为“污染蛋白”)的蛋白制剂。

编码本发明蛋白的核苷酸序列包括如seqidno:47和1-14所示的序列及其变体、片段和互补序列。“互补序列”意指与给定核苷酸序列充分互补以使其能与给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定双链的核苷酸序列。由这些核苷酸序列所编码的杀虫蛋白的相应氨基酸序列如seqidno:48和15-31所示。

本发明还包括编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或者其可以是使用下面所公开的方法能够用作杂交探针或pcr引物的片段。根据预期的用途，编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续的核苷酸，或直至编码本文中所公开的杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数量。“连续的”核苷酸意指相互之间紧密相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段会编码保留杀虫蛋白生物学活性并且因此保留杀虫活性的蛋白片段。因此，还包括本文中所公开的多肽的生物学活性片段。“保留活性”意指片段会具有杀虫蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀虫活性。在多个实施方案中，活性相对于本文中别处所定义的参考杀虫蛋白可以被改进或扩大(例如相对于seqidno:43或45的活性被改进或扩大)。在一个实施方案中，杀虫活性是杀灭鞘翅目的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭鳞翅目的活性。在另一个实施方案式中，杀虫活性是杀灭线虫类的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭双翅目的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭半翅目的活性。测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83:2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252:199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293；以及no.5,743,477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。

编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段(所述杀虫蛋白编码本发明蛋白的生物学活性部分)会编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续的氨基酸，或直至本发明全长杀虫蛋白中存在的氨基酸总数量。在一些实施方案中，该片段是蛋白酶水解切割(proteolyticcleavage)片段。例如，蛋酶质水解切割片段可以具有相对于seqidno:48和15-31至少约100个氨基酸、约120个、约130个、约140个、约150个或约160个氨基酸的n末端或c末端截短。在一些实施方案中，本文中所包括的片段源于c末端结晶结构域的去除，例如，通过蛋白酶水解或通过在编码序列中插入终止密码子。在其它实施方案中，融合蛋白包含seqidno:43的c末端结构域片段和/或seqidno:45的n末端结构域片段。

本发明优选的杀虫蛋白由与seqidno:47和1-14的核苷酸序列充分一致的核苷酸序列所编码，或者杀虫蛋白与seqidno:48和15-31所示的氨基酸序列充分一致。在另一个实施方案中，核苷酸序列编码融合蛋白，其中n末端部分与seqidno:45的n末端部分充分一致，或者其中n末端部分与seqidno:45的n末端部分充分一致并且c末端部分与seqidno:43充分一致。“充分一致”意指利用标准参数通过本文中描述的一种比对程序而与参考序列相比具有至少约60％或65％序列一致性、约70％或75％序列一致性、约80％或85％序列一致性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将会认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等，可以对这些数值适当地进行调整，以确定由两条核苷酸序列所编码蛋白的相应的一致性。

为了确定两条氨基酸序列或两条核酸的一致性百分比，出于最佳对比的目的对序列进行比对。两条序列之间的一致性百分比是序列所共有的一致位点的数量的函数(即，一致性百分比＝相同位点的数量/位点总数量(例如重叠位点)×100)。在一个实施方案中，两条序列具有相同的长度。在另一个实施方案中，贯穿整条参考序列(即本文所公开的如seqidno:1-31、47或48任意一条所示的序列)来计算一致性百分比。可以使用与下面描述的那些类似的技术，在允许或不允许空缺的情况下确定两条序列之间的一致性百分比。在一致性百分比的计算中，通常对精确匹配进行计数。空缺，即在比对中在一条序列中存在但在另一条中并不存在的残基所处的位点，被认为是非一致性残基的位点。

两条序列之间一致性百分比的确定可以使用数学算法来完成。可以用于比对两条序列的数学算法的非限制性示例是karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264的算法，在karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877中所改进。此算法并入到altschul等，(1990)j.mol.biol.215:403的blastn和blastx程序中。可以用blastn程序，得分＝100，字段长度＝12实施blast核苷酸搜索，以获得与本发明的类杀虫核酸分子同源的核苷酸序列。可以用blastx程序得分＝50，字段长度＝3实施blast蛋白质搜索，以获得与本发明的杀虫蛋白同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空缺比对，可以利用如altschul等，(1997)nucleicacidsres.25:3389.中所述的gappedblast(在blast2.0中)。另外，psi-blast可以用于实施检测分子之间远源关系的重复搜索。参见altschul等，(1997)，同上。当利用blast、gappedblast和psi-blast程序时，可以使用各个程序(例如blastx和blastn)的默认参数。还可通过目测人工实施比对。

用于序列比较的数学算法的另一个非限制性示例是clustalw算法(higgins等，(1994)nucleicacidsres.22:4673-4680)。clustalw算法比较序列和比对整条氨基酸或dna序列，因此能够提供关于整条氨基酸序列的序列保守性的数据。clustalw算法用于几种市售的dna/氨基酸分析软件包中，例如vectorntiprogramsuite(invitrogencorporation,carlsbad,ca)的alignx模块。用clustalw对氨基酸序列进行比对后，可以估算出氨基酸一致性百分比。用于分析clustalw比对的软件程序的非限制示例是genedoc^tm。genedoc^tm(karlnicholas)允许估算多个蛋白之间的氨基酸(或dna)相似性和一致性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性示例是myerstmiller(1988)cabios4:11-17的算法。此算法并入到align程序(2.0版本)中，所述align程序是gcgwisconsingeneticssoftware,version10(可从accelrys,inc.,9685scrantonrd.,sandiego,ca,usa获得)的一部分。当利用align程序比较氨基酸序列时，可以使用pam120权重残基表，空缺长度罚分为12，空缺罚分为4。

除非另有说明，将利用使用needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48(3):443-453算法的gapversion10，利用以下参数确定一致性或相似性：对于核苷酸序列的一致性％和相似性％，使用gap权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的一致性％和相似性％，使用gap权重8和长度权重2以及blosum62评分程序。还可以使用等同的程序。“等同的程序”意指对于所研究的任意两条序列而言，当与由gapversion10所产生的相应比对结果相比时，产生具有一致的核苷酸残基匹配以及一致的序列一致性百分比比对结果的任意序列比对程序。

本发明还包括变体核酸分子。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码本文中公开的杀虫蛋白，但是却由于遗传密码的简并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所讨论的充分一致的那些序列。天然存在的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如下文概述的的聚合酶链式反应(pcr)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，其例如通过利用位点定向诱变法制备，但是如下文所讨论仍然编码本发明公开的杀虫蛋白。本发明所包括的变体蛋白是具有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即杀虫活性。“保留活性”意指变体将具有天然蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的杀虫活性。在一些实施方案中，活性相对于本文中别处所定义的参考杀虫蛋白可以被改进或扩大。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83:2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252:199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293；以及美国专利no.5,743,477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。

技术人员将进一步领会到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入改变，从而导致编码杀虫蛋白的氨基酸序列发生变化，而不会改变蛋白的生物学活性。因此，可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入本文中公开的相应核苷酸序列中而产生分离的变体核酸分子，以将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白中。可以通过标准技术，例如位点定点突变和pcr介导的突变来引入突变。这种变体核苷酸序列也包括在本发明中。

例如，可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守性氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可以由杀虫蛋白的野生型序列中改变而不会改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基则是生物学活性所需的。“保守性氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸所替换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

可以在保留功能的非保守性区域中进行氨基酸置换。一般来讲，不会对保守性氨基酸残基或存在于保守性基序(其中这些残基对于蛋白活性而言是必需的)内的氨基酸残基进行这种置换。保守的以及可能对于蛋白活性而言是必需的残基的示例包括例如在与本发明序列相似或相关的毒素的比对中所含的所有蛋白之间相一致的残基(例如在同源蛋白的比对中一致的残基)。保守的但是可以允许保守性氨基酸置换并且仍然保留活性的残基的示例包括例如在与本发明序列相似或相关的毒素的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守性置换的残基(例如，在同源蛋白比对中所含的所有蛋白质之间仅具有保守性置换的残基)。然而，本领域技术人员将会理解，功能性变体可以在保守性残基中具有微小的保守性或非保守性改变。

另外，可通过沿全部或部分编码序列随机引入突变而产生变体核苷酸序列，例如通过饱和突变法，并且针对赋予杀虫活性的能力对所得的突变体进行筛选，以鉴定保留活性的突变体。突变之后，可以使所编码的蛋白重组表达，并且利用标准测定技术确定蛋白活性。

利用例如pcr、杂交等的方法，可以鉴定相应的杀虫序列，此序列与本发明的序列具有基本一致性。参见例如sambrook和russell(2001)molecularcloning:alaboratorymanual.(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny)和innis等，(1990)pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(academicpress,ny).

在杂交方法中，可以利用全部或部分杀虫核苷酸序列对cdna或基因组文库进行筛选。构建这些cdna和基因组文库的方法一般是本领域已知的，并且公开于同上的sambrook和russell,2001中。所谓的杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团例如³²p或其它可检测标记例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子进行标记。可以对基于本文中所公开编码已知杀虫蛋白的核苷酸序列的合成性寡核苷酸进行标记而制备杂交探针。额外地，可以利用基于核苷酸序列或所编码氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针通常包含在严格条件下与编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列或者其片段或变体的至少约12、至少约25、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续性核苷酸杂交的核苷酸序列区域。制备杂交探针的方法一般是本领域已知的，并且公开于同上通过引用并入本文的sambrook和russell,2001中。

例如，本文所公开的整条杀虫序列或者其一个或多个部分，可以用作能够与相应的杀虫蛋白类似序列和信使rnas特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这些探针包含独特的并且优选长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。这些探针可用于通过pcr从所选的有机体中扩增相应的杀虫序列。该技术可以用于从期望的有机体中分离额外的编码序列或作为诊断测定法以确定有机体中编码序列的存在。杂交技术包括平板dna文库的杂交筛选(蚀菌斑或菌落，参见例如sambrook等，(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(2ded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)。

因此，本发明包括杂交探针，以及能够与本发明核苷酸序列的全部或部分(例如至少约300个核苷酸、至少约400个、至少约500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500个，或直至本文中公开的核苷酸序列的全长)杂交的核苷酸序列。这种序列的杂交可以在严格条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指在该条件下探针与其靶标序列杂交的可检测程度高于与其它序列的杂交(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。另外，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般来讲，探针的长度少于1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。

通常，严格条件将是其中盐浓度为小于约1.5mna离子，通常约0.01至1.0mna离子浓度(或其它盐类)，ph为7.0-8.3，以及对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃的那些。还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现严格条件。示例性的低严格条件包括用30至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基磺酸钠)的溶液于37℃杂交，并且在1x至2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中于50至55℃洗涤。示例性的中等严格条件包括在40至45％甲酰胺、1mnacl、1％sds的溶液中于37℃杂交，并且在0.5x至1xssc中于55至650℃洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds的溶液中于37℃杂交，并且在0.1xssc中于60至65℃洗涤。可选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％的sds。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常约4至12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于dna-dna杂交，tm可以从meinkoth和wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的公式中估算得到：tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m是一价阳离子的摩尔浓度，％gc是dna中鸟苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，l是碱基对中杂交体的长度。tm是这样的温度(在限定的离子强度和ph下)，在该温度下50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。每1％的错配，tm降低约1℃；因此，可以调整tm、杂交和/或洗涤条件，以与期望一致性的序列杂交。例如，如果要找寻具有>90％一致性的序列，tm可以降低10℃。一般来讲，所选择的严格条件比特定离子强度和ph下特异性序列及其互补物的热熔解点(tm)低约5℃。然而，非常严格条件可以利用比热熔解点(tm)低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热熔解点(tm)低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔解点(tm)低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。利用该等式、杂交和洗涤组合物以及期望的tm，本领域普通技术人员将会理解，隐含描述了杂交严格性和/或洗涤溶液的变化形式。如果错配的期望程度导致tm小于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选提高ssc的浓度以使能够使用较高的温度。对于核酸杂交的延伸性指导出现于tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology—hybridizationwithnucleicacidprobes,parti,chapter2(elsevier,newyork)；和ausubel等，eds.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,chapter2(greenepublishingandwiley-interscience,newyork)中。参见seesambrook等，(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(2ded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)。

分离的蛋白及其变体和片段

本发明中还包括杀虫蛋白。“杀虫蛋白”意指具有seqidno:48和15-31所示氨基酸序列的蛋白。还提供了其片段、生物学活性部分和变体，其可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白”或“重组蛋白”用于指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。

“片段”或“生物学活性部分”包括包含与seqidno:48和15-31所示氨基酸序列充分一致的氨基酸序列并且表现出杀虫活性的多肽片段。杀虫蛋白的生物学活性部分可以是例如长度为10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多氨基酸的多肽。可以通过重组技术来制备这种生物学活性部分，并且评估其杀虫活性。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83:2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252:199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293；和美国专利no.5,743,477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。如本文所使用，片段包含seqidno:48和15-31的至少8个连续的氨基酸。然而，本发明包括其它片段，例如蛋白中长度大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多氨基酸的任意片段。

“变体”意指具有与seqidno:48和15-31任一项的氨基酸序列至少约60％，约70％、75％，约80％、85％，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的蛋白或多肽。变体还包括在严格条件下与seqidno:47和1-14所示的核酸分子或其互补物杂交的核酸分子所编码的多肽。变体包括因突变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明所包括的变体蛋白是具有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即保留杀虫活性。在一些实施方案中，变体相对于天然蛋白具有改进的活性。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83:2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252:199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293和美国专利no.5,743,477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。

细菌基因，例如本发明的axmi基因，在开放阅读框的起始点附近常常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致产生功能性蛋白。这些起始密码子可以包括atg密码子。然而，细菌例如芽孢杆菌属还会将密码子gtg识别为起始密码子，在gtg密码子处起始翻译的蛋白在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。在极少数情况下，细菌系统中的翻译可以在ttg密码子处起始，不过在这种情况下ttg编码甲硫氨酸。此外，通常不能先验地确定这些密码子中的哪些在细菌中是天然使用的。因此，可以理解的是，使用替代性甲硫氨酸密码子之一也可以导致产生杀虫蛋白。这些杀虫蛋白包括在本发明中，并且可以用于本发明的方法中。将要理解的是，当在植物中表达时，将替代性起始密码子改变成atg以正确翻译是必需的。

还包括本发明多肽或者其变体或片段的抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的(参见例如harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny；美国专利no.4,196,265)。

改变或改进的变体

已认识到可以通过多种方法改变杀虫蛋白的dna序列，并且这些改变可能导致dna序列编码具有与由本发明杀虫蛋白所编码不同的氨基酸序列的蛋白。该蛋白可以用多种方式改变，包括seqidno:48和15-31的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插入，包括在c末端部分或n末端部分或者二者中多至约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155个或更多个氨基酸的置换、缺失或插入。用于这些操作的方法一般是本领域已知的。例如，可以通过dna中的突变制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过突变的几种形式之一和/或定向进化来完成。在一些方面中，氨基酸序列中编码的改变将基本上不会影响蛋白的功能。这些变体将拥有期望的杀虫活性。然而，可以理解的是，可以通过对本发明的组合物上使用这些技术来改进杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力。例如，可以在dna复制期间表现出高碱基错误掺入率的宿主细胞(例如xl-1red(stratagene,lajolla,ca))中表达杀虫蛋白。在这些菌株中增殖之后，可以分离dna(例如通过制备质粒dna，或通过pcr扩增并将所得pcr片段克隆入载体中)，在未突变菌株中培养杀虫蛋白突变体，并例如通过进行测试杀虫活性的测定从而鉴定具有杀虫活性的已突变基因。一般来讲，将蛋白混合并用于饲喂测定中。参见例如marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293。这种测定可以包括使植物与一种或多种害虫接触，并确定植物存活和/或造成害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的示例存在于schnepf等，(1998)microbiol.mol.biol.rev.62:775-806中。

另外，可以在氨基或羧基末端处改变许多蛋白的蛋白序列，而基本上不会影响活性。这可以包括通过现代分子学方法例如pcr引入的插入、缺失或改变，包括由于pcr扩增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白编码序列的pcr扩增。另外，所添加的蛋白序列可以包括整个蛋白编码序列，例如本领域常用的用于产生蛋白融合体的那些。这种融合蛋白通常用于(1)增加目的蛋白的表达(2)引入结合结构域、酶活性或便于蛋白纯化、蛋白检测的表位或本领域已知的其它实验用途(3)将蛋白靶向分泌或翻译至亚细胞器官，例如革兰氏阴性细菌的周质间隙或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白的糖基化。

本发明的核苷酸和氨基酸序列变体还包括突变和重组方法例如dna改组衍生的序列。利用此种方法，可以利用一个或多个不同的杀虫蛋白编码区域产生拥有期望特性的新杀虫蛋白。以这种方式，由一群相关序列的多聚核苷酸制备重组多聚核苷酸文库，所述相关序列的多聚核苷酸包含基本上序列一致并且能够在体外或体内同源重组的序列区。例如，利用该方法，可以在本发明的杀虫基因和其它已知的杀虫基因之间对编码目的结构域的序列基序进行改组，以获得编码具有改进的目的特性(例如增加的灭虫活性)的蛋白的新基因。用于这种dna改组的方案是本领域已知的。参见例如stemmer(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:10747-10751；stemmer(1994)nature370:389-391；crameri等，(1997)naturebiotech.15:436-438；moore等，(1997)j.mol.biol.272:336-347；zhang等，(1997)proc.natl.acad.sci.usa94:4504-4509；crameri等，(1998)nature391:288-291以及美国专利no.5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是产生改变的杀虫蛋白的另一种机制。可以在灭虫蛋白之间交换结构域，产生具有改进的杀虫活性或靶标谱的杂合体或嵌合体毒素。产生重组蛋白以及对它们进行杀虫活性测试的方法是本领域已知的(参见例如naimov等，(2001)appl.environ.microbiol.67:5328-5330；demaagd等，(1996)appl.environ.microbiol.62:1537-1543；ge等，(1991)j.biol.chem.266:17954-17958；schnepf等，(1990)j.biol.chem.265:20923-20930；rang等，(1999)appl.environ.microbiol.65:2918-2925)。

因此，在本发明的多种实施方案中，本文中包括的核酸序列(以及包含核酸序列的组合物、载体、宿主细胞、植物和种子)包含一种或多种毒素的一部分和一种或多种不同毒素的一部分。在一个实施方案中，核酸序列包含编码axmi005(seqidno:45中所示)n末端部分和axmi115(seqidno:43中所示)c末端部分的核苷酸序列。在特定的实施方案中，axmi005的n末端部分包含axmi005的约第1位至第173位氨基酸残基，或从约第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50位至约150、155、160、165、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325或350位氨基酸残基，axmi115的c末端部分包含从axmi115的约第174位氨基酸残基至约第803位氨基酸残基，或从约第174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325或350位氨基酸残基至约第600、650、700、750、760、770、780、790、795、796、797、798、799、800、801、802或803位氨基酸残基。本领域技术人员将认识到，可以在每条氨基酸序列中进行细微的变异和缺失并且仍然保持(或改进)融合蛋白的活性。在一些实施方案中，本发明的核酸序列编码axmi005/axmi115融合蛋白，所述融合蛋白在对应于seqidno：43的第584、588和771位氨基酸残基的一个或多个位点处具有突变(相对于亲本axmi005或axmi115蛋白的相应区域)(参见例如seqidno:18-22中的变体融合序列)。在其它实施方式中，本文中包括的核苷酸序列如seqidno:47和1-14中任一项所示，氨基酸序列如seqidno:48和15-31中任一项所示。

在多种实施方案中，axmi005与axmi115的融合导致氨基酸序列与单独的axmi005或axmi115相比具有改进的或扩大的活性。“改进的”活性意指与天然蛋白相比使至少一种害虫的死亡增加或使害虫生长、进食或正常生理发育的明显降低增加。“扩大的”活性意指axmi005和axmi115二者均未显示针对一种害虫的活性。例如，axmi005的一部分与axmi115的一部分融合可以产生具有axmi005和axmi115二者的活性谱的蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白针对单个害虫的活性相对于axmi005和/或axmi115之一或二者得到了改进。

载体

本发明的杀虫序列可以提供于用于在目的植物中表达的表达盒中。“植物表达盒”意指能够使得在植物细胞中由开放阅读框表达蛋白的dna构建体。通常这些含有启动子和编码序列。这种构建体常常还含有3’非翻译区。这种构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以便于肽共翻译或翻译后转运至特定的胞内结构，例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。

“信号序列”意指已知的或疑似导致肽共翻译或翻译后跨细胞膜转运的序列。在真核生物中，这通常包括分泌进入高尔基体，伴随一些因此而发生的糖基化。细菌的灭虫毒素常常合成为原毒素，其在靶标害虫的肠道内被蛋白水解活化(chang(1987)methodsenzymol.153:507-516)。在本发明的一些实施方案中，信号序列位于天然序列中，或可以由本发明的序列衍生得到。“前导序列”意指当翻译时产生足以引发肽链共翻译转运至亚细胞器官的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过穿入内质网、穿过囊泡、质体(包括叶绿体、线粒体等)等引导转运和/或糖基化的前导序列。

“植物转化载体”意指有效转化植物细胞所必需的dna分子。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成多于一个“载体”dna分子。例如，双元载体是利用两个非连续性编码用于植物细胞转化的所有必要的顺式或反式作用功能的植物转化载体(hellens和mullineaux(2000)trendsinplantscience5:446-451)。“载体”是指设计用于在不同宿主细胞间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中并入、整合和表达异源dna序列或片段的能力的载体。表达盒将包含与本发明的序列可操作连接的5’和/或3’调控序列。“可操作连接”意指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的dna序列的转录。一般来讲，可操作连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且有必要连接两个蛋白编码区域时是连续的并且处于相同的读码框中。表达盒可以额外地含有待共转化入有机体的至少一种额外的基因。另外，可以在多个表达盒上提供额外的基因。

在多种实施方案中，本发明的核苷酸序列可操作连接到启动子上，例如植物启动子。“启动子”是指功能为指导下游编码序列进行转录的核酸序列。启动子连同其它转录和翻译调控核酸序列(也被称为“控制序列”)是目的dna序列的表达所必需的。

这种表达盒提供有用于插入处于调控区转录调控之下的杀虫序列的多个限制性位点。

表达盒将在5’-3’转录方向包括在植物中行使功能的转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的dna序列以及翻译和转录终止区(即终止区)。启动子相对于植物宿主和/或本发明的dna序列可以是天然的或类似物，或者是外来的或异源的。额外地，启动子可以是天然序列或另外地合成序列。当启动子相对于植物宿主是“天然的”或“同源的”时，其意指启动子存在于引入该启动子的天然植物中。当启动子相对于本发明的dna序列是“外来的”或“异源的”时，其意指该启动子对于本发明可操作性连接的dna序列而言不是天然或天然存在的启动子。

终止区相对于转录起始区可以是天然的，相对于可操作性连接的目的dna序列可以是天然的，相对于植物宿主可以是天然的，或者可以衍生自另一种来源(即相对于启动子、目的dna序列、植物宿主或其任意组合是外来的或异源的)。常规的终止区可以从农杆菌(a.tumefaciens)ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。还参见guerineau等，(1991)mol.gen.genet.262:141-144；proudfoot(1991)cell64:671-674；sanfacon等，(1991)genesdev.5:141-149；mogen等，(1990)plantcell2:1261-1272；munroe等，(1990)gene91:151-158；ballas等，(1989)nucleicacidsres.17:7891-7903；和joshi等，(1987)nucleicacidres.15:9627-9639。

适当时，可以对基因进行优化，以增加在转化的宿主细胞中的表达。即，基因可以使用宿主细胞偏好的密码子合成以提高表达，或者基因可以以宿主偏好的密码子使用频率利用密码子合成。一般来讲，基因的gc含量将会增加。对于宿主编好的密码子使用的讨论，参见例如campbell和gowri(1990)plantphysiol.92:1-11。用于合成植物偏好的基因的方法是本领域可获得的。参见例如通过引用并入本文的美国专利nos.5,380,831和5,436,391、美国公开no.20090137409以及murray等，(1989)nucleicacidsres.17:477-498。

在一个实施方案中，杀虫蛋白靶向叶绿体中表达。以这种方式，当杀虫蛋白不是直接插入叶绿体中时，表达盒将额外地含有编码引导杀虫蛋白至叶绿体的转运肽的核酸。这种转运肽是本领域已知的。参见例如vonheijne等，(1991)plantmol.biol.rep.9:104-126；clark等，(1989)j.biol.chem.264:17544-17550；della-cioppa等，(1987)plantphysiol.84:965-968；romer等，(1993)biochem.biophys.res.commun.196:1414-1421和shah等，(1986)science233:478-481.

可以对待靶向叶绿体的杀虫基因进行优化以在叶绿体中表达，以解决植物细胞核和该细胞器之间密码子使用的差异。以这种方式，目的核酸可以利用叶绿体偏好的密码子合成。参见例如通过引用并入本文的美国专利no.5,380,831。

植物转化

本发明的方法包括将核苷酸构建体引入植物中。“引入”意指以构建体能够进入植物细胞内部的方式将核苷酸构建体呈递至植物中。本发明的方法不需要使用特定方法将核苷酸构建体引入植物中，只要核苷酸构建体能够进入植物的至少一个细胞的内部即可。将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“植物”意指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质、叶片细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指植物细胞中已经并入或整合入外源核酸序列的植物。这些核酸序列包括外源的或未转化植物细胞中不存在的那些，以及内源的或培养开发部化的植物细胞中存在的那些。“异源的”一般是指对于所存在其中的细胞或天然基因组部分而言不是内源并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔等添加至细胞中的核酸序列。

本发明的转基因植物表达本文中公开的一种或多种新的毒素序列。在多个实施方案中，转基因植物进一步包含一个或多个额外的昆虫抗性基因(例如cry1，例如cry1a、cry1b、cry1c、cry1d、cry1e和cry1f家族的成员；cry2，例如cry2a家族的成员；cry9，例如cry9a、cry9b、cry9c、cry9d、cry9e和cry9f家族的成员，等)。本领域技术人员将理解的是，转基因植物可以包含赋予目标农学性状的任意基因。

植物细胞的转化可以通过本领域已知的几项技术之一完成。可以对本发明的杀虫基因进行修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。通常表达这种蛋白的构建体将含有驱动基因转录的启动子以及允许转录终止和多聚腺苷酸化的3’非翻译区。此类构建体的构造是本领域熟知的。在一些情况下，可能有用的是使基因工程化以使所得到的肽分泌或另外靶向植物细胞内部。例如，可以使基因工程化，以含有促进肽转移至内质网的信号肽。还优选使植物表达盒工程化以含有内含子，以使对于表达而言需要进行内含子的mrna加工。

通常这种“植物表达盒”将插入“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以包含实现植物转化所需的一个或多个dna载体。例如，本领域常见的实践是利用包含多于一个连续性dna节段的植物转化载体。这些载体在本领域也被称为“双元载体”。双元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现充分转化所需的dna节段的大小和复杂性相当大，并且将功能分配至独立的dna分子是有利的。双元载体通常含有质粒载体，所述质粒载体含有t-dna转移所需的顺式作用序列、工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记和“目的基因”(工程化以能够在对于产生转基因植物所需要的植物细胞中表达的基因)。这种质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移至植物细胞中并且在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和杀虫基因位于左边界和右边界之间。一般第二质粒载体含有介导t-dna从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。如本领域所理解，这种质粒一般含有允许农杆菌感染植物细胞的毒力功能(vir基因)，以及通过在边界序列处切割的dna转移和vir介导的dna转移(hellens和mullineaux(2000)trendsinplantscience5:446-451)。可以使用几种类型的农杆菌菌株(例如lba4404、gv3101、eha101、eha105)进行植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法例如显微投射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇法等转化植物而言不是必需的。

一般来讲，植物转化方法涉及将异源dna转移至靶植物细胞(例如不成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后施加最大阈值水平的适宜选择(取决于选择标记基因)，以从一组未分化的细胞团中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物中并且例行培养。随后，在放置于添加了最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，转化的细胞分化成苗。接着将苗转移至选择性生根培养基中，以回收生根的苗或小植株。转基因的小植株接着生长成成熟植物并且产生可育性种子(例如hiei等，(1994)theplantjournal6:271-282；ishidaetal.(1996)naturebiotechnology14:745-750)。通常将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物中并且例行培养。对用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见于ayres和park(1994)criticalreviewsinplantscience13:219-239以及bommineni和jauhar(1997)maydica42:107-120中。由于转化的材料含有许多细胞，转化和未转化的细胞均存在于任何一片经处理的靶愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化细胞并且允许转化的细胞增殖的能力导致产生转化的植物培养物。一般去除未转化细胞的能力是快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制因素。

转化步骤以及将核苷酸序列引入植物中的步骤可以根据转化所靶向的植物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而变化。可以通过几种方法之一进行转基因植物的产生，包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源dna引入植物细胞中(农杆菌介导的转化)、用粘附至粒子的异源外来dna轰击植物细胞、射弹粒子加速、气溶胶束转化(美国公开申请no.20010026941；美国专利no.4,945,050；国际公开no.wo91/00915；美国公开申请no.2002015066)、lec1转化以及转移dna的多种其他非粒子直接介导的方法。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如svab等，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:8526-8530；svab和maliga(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:913-917；svab和maliga(1993)emboj.12:601-606。该方法依赖于粒子枪递送含有选择标记的dna以及通过同源重组使dna靶向至质体基因组。额外地，质体转化可以通过利用细胞核编码且导向质体的rna聚合酶的组织优选性表达将质体携带的沉默转基因反式激活而实现。这种系统已经报道于mcbride等，(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:7301-7305中。

将异源外来dna整合入植物细胞中后，接着在培养中施加最大阈值水平的适宜选择，以通过定期转移至新鲜培养基从而杀死未转化的细胞以及将在这种选择处理中存活的推定转化的细胞分离和增殖。通过连续传代和用适宜的选择攻击，鉴定转化了质粒载体的细胞并使其增殖。接着可以利用分子和生化方法确认存在整合入转基因植物基因组中的目标外源基因。

已经转化的细胞可以根据常规方法生长成植物。参见例如mccormick等，(1986)plantcellreports5:81-84。接着这些植物可以生长，用相同的转化株系或不同的株系授粉，并鉴定期望表型特性组成型表达的所得杂交体。可以培育两个或多个世代，以确保期望表型特性的表达稳定维持并且遗传，并且接着收获种子，以确保已经实现期望表型特性的表达。利用这种方法，本发明提供了转化的种子(也被称为“转基因种子”)，其使得本发明的核苷酸构建体例如本发明的表达盒稳定并入其基因组中。

植物转化的评价

将异源外来dna引入植物细胞中后，通过多种方法确认异源基因转化或整合入植物基因组中，例如对与所整合基因相关的核酸、蛋白和代谢物进行分析。

pcr分析是在移植入土壤前的早期阶段对转化的细胞、组织或苗筛选所并入基因的存在的快速方法(sambrook和russell(2001)molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny)。利用对目的基因或农杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物实施pcr。

可以通过基因组dna的southern印迹分析确认植物转化(上文sambrook和russell,2001)。总地来讲，从转化体中提取总dna，用适宜的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中分离并转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。接着根据标准技术利用例如放射性标记的³²p靶dna片段对膜或“印迹物”进行探测，以确认所引入的基因整合入植物基因组中。

在northern印迹分析中，从转化体的特定组织中分离rna，在甲醛琼脂糖凝胶中分离并根据本领域例行使用的标准步骤(上文sambrook和russell,2001)印迹至尼龙膜上。接着利用本领域已知方法(上文sambrook和russell,2001)，通过使膜与来源于杀虫基因的放射活性探针杂交，对由杀虫基因所编码rna的表达进行测试。

可以对转基因植物实施western印迹、生化测定等，以利用与杀虫蛋白上存在的一个或多个表位结合的抗体，通过标准步骤(上文sambrook和russell,2001)确认由杀虫基因所编码蛋白的存在。

植物中的杀虫活性

在本发明的另一个方面中，可以产生表达具有杀虫活性的杀虫蛋白的转基因植物。可以利用上面通过示例方式描述的方法产生转基因植物，但是产生转基因植物细胞的方式对于本发明而言并非关键。本领域已知或描述的方法，例如农杆菌介导的转化、生物射弹转化和非粒子介导的方法，可以由实验者酌情使用。表达杀虫蛋白的植物可以通过本领域描述的常规方法进行分离，例如通过转化愈伤组织、对转化的愈伤组织进行选择和由这种转基因愈伤组织再生可育性植物。在这一过程中，可以利用任意基因作为选择标记，只要其在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化细胞的能力。

已经开发了用于植物细胞的一些标记，例如氯霉素、氨基糖甙g418、潮霉素等抗性标记。编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可以用作选择标记。例如，提供对植物除草剂例如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可能特别有用。已经报道了这类基因(stalker等，(1985)j.biol.chem.263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)和sathasivan等，(1990)nucl.acidsres.18:2188(ahas咪唑啉酮抗性基因))。额外地，本文中公开的基因用作标记，以评估细菌或植物细胞的转化。用于检测转基因在植物、植物器官(例如叶片、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中的存在的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性检测转基因的存在。

可以对表达杀虫蛋白的可育性植物进行杀虫活性的测试，并且选择显示最佳活性的植物进行进一步育种。测定杀虫活性的方法是本领域可获得的。一般来讲，将蛋白混合并用于饲喂测定中。参见例如marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78:290-293。

本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的示例包括但不限于谷物(玉米)、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸芭属物种(brassicasp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、油橄榄、番木瓜、腰果、全缘叶澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜类、观赏植物类和松柏类。

蔬菜包括但不限于番茄、生菜、青豆、利马豆、豌豆和黄瓜属(curcumis)成员，例如黄瓜、网纹甜瓜和香甜瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、八仙花、朱槿、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选本发明的植物是作物植物(例如玉米、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。

在杀虫控制中的用途

将包含本发明核苷酸序列或其变体的菌株应用于杀虫控制中或使其他有机体作为杀虫剂的一般方法是本领域已知的。参见例如美国专利no.5,039,523和ep0480762a2。

含有本发明核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌属菌株或已经遗传改变以含有本发明杀虫基因和蛋白的微生物可以用于保护农作物和农产品免受害虫损害。在本发明的一个方面中，用试剂对产生毒素(杀虫剂)的有机体的完整即未裂解细胞进行处理，所述试剂使得当细胞应用于靶害虫的环境时，细胞中所产生毒素的活性延长。

或者，通过将杀虫基因引入细胞宿主中产生杀虫剂。杀虫基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。在本发明的一个方面中，接着在一定条件下对这些细胞进行处理，所述条件使得当细胞应用于靶害虫的环境时，细胞中所产生毒素的活性延长。所得产物保留毒素的活性。接着可以根据常规技术对这些天然包囊化的杀虫剂进行配制，以应用于靶害虫所在环境，例如土壤、水和植物叶片。参见例如epa0192319以及其中所引用的参考文献。或者，可以配制表达本发明基因的细胞，以允许应用所得物质作为杀虫剂。

本发明的活性成分通常以组合物形式应用，并且可以随其他化合物同时或依次应用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、抗冻剂、表面活性剂、去垢剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或在单次应用制剂后允许对靶区域长期投药的延时释放或生物可降解载体制剂。其还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、抗阿米巴药、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫药、杀螺剂或这些制备品中几种制品的混合物，如果需要，连同制剂领域中通常使用的其他农药可接受载体、表面活性剂或应用促进佐剂。适宜的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使有的物质，例如天然或再生性矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，制剂可以制备成可食性“饵料”或加工成害虫“陷阱”，以允许靶害虫采食或摄取杀虫制剂。

应用含有本发明细菌菌株所产生至少一种杀虫蛋白的本发明活性成分或本发明农业化学组合物的方法包括叶面应用、种子包衣和土壤应用。应用的次数和应用的速率取决于相应害虫的侵袭强度。

组合物可以配制为粉剂、尘剂、丸剂、粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体、溶液等，并且可以通过常规手段例如对包含多肽的细胞培养物进行干燥、冻干、匀质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备。在含有至少一种这类杀虫多肽的所有这些组合物中，多肽可以以重量比为约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本发明的方法杀死给定区域中鳞翅目、异翅目、双翅目或鞘翅目害虫或减少其数量，或者可以预防性应用至某环境区域以防止易感害虫侵袭。优选害虫摄取或接触杀虫有效量的多肽。“杀虫有效量”意指能够使至少一种害虫死亡或者能够显显减少害虫生长、采食或正常生理发育的杀虫剂量。该量将根据如以下所述因素变化，例如待控制的特定靶害虫、特定环境、位置、植物、作物或农业地点、环境条件，以及有效杀虫的多肽组合物的应用方法、速率、浓度、稳定性和量。制剂还可以根据气候条件、环境考虑和/或应用频率和/或害虫侵袭的严重程度方面而变化。

所描述的杀虫组合物可以通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或者分离的蛋白组分与期望的农业上可接受的载体进行配制而制备。组合物可以在施用之前以适宜手段配制，例如冻干、冷冻干燥或在水性载体、培养基或合适的稀释剂中，例如盐水落石出或其他缓冲液。所配制的组合物可以是尘剂或颗粒物质形式，或者是在油(植物油或矿物油)中的悬液或者水或油/水乳液，或者作为可湿性粉剂，或者与适用于农业应用的任何其他载体物质组合。术语“农业上可接受的载体”涵盖常规用于杀虫剂配制技术中的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀虫剂配制领域的技术人员熟知的。制剂可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并且可以通过多种手段制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适佐剂均匀混合、掺和和/或研磨。合适的配制和应用方法描述于通过引用并入本文的us专利no.6,468,523中。

“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自鞘翅目(coleoptera)、双翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、食毛目(mallophaga)、同翅目(homoptera)、半翅目(hemiptera)、直翅目(orthroptera)、缨翅目(thysanoptera)、革翅目(dermaptera)、等翅目(loptera)、虱目(anoplura)、蚤目(siphonaptera)、毛翅目(trichoptera)等，特别地选自鞘翅目、鳞翅目和双翅目。

鞘翅目包括肉食亚目(adephaga)和多食亚目(polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(caraboidea)和豉甲总科(gyrinoidea)、而多食亚目包括水龟甲总科(hydrophiloidea)、隐翅甲总科(staphylinoidea)、花萤总科(cantharoidea)、郭公甲总科(cleroidea)、叩甲总科(elateroidea)、花甲总科(dascilloidea)、泥甲总科(dryopoidea)、丸甲总科(byrrhoidea)、扁甲总科(cucujoidea)、芫菁总科(meloidea)、花蚤总科(mordelloidea)、拟步甲总科(tenebrionoidea)、长蠹总科(bostrichoidea)、金龟总科(scarabaeoidea)、天牛总科(cerambycoidea)、叶甲总科(chrysomeloidea)和象甲总科(curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(cicindelidae)、步甲科(carabidae)和龙虱科(dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(gyrinidae)。水龟甲总科包括水龟甲科(hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(silphidae)和隐翅甲科(staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(cantharidae)和萤科(lampyridae)。郭公甲总科包括郭公甲科(cleridae)和皮蠹科(dermestidae)。叩甲总科包括叩甲科(elateridae)和吉丁甲科(buprestidae)。扁甲总科包括瓢甲科(coccinellidae)。芫菁总科包括芫箐科(meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(passalidae)和金龟科(scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(curculionidae)和小蠹科(scolytidae)。

双翅目包括亚目长角亚目(nematocera)、短角亚目(brachycera)和环裂亚目(cyclorrhapha)。长角亚目(nematocera)包括大蚊科(tipulidae)、毛蠓科(psychodidae)、蚊科(culicidae)、蠓科(ceratopogonidae)、摇蚊科(chironomidae)、蚋科(simuliidae)、毛蚊科(bibionidae)和瘿蚊科(cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(stratiomyidae)、虻科(tabanidae)、剑虻科((therevidae)、食虫虻科(asilidae)、拟蜂虻科(mydidae)、蜂虻科(bombyliidae)和长足虻科(dolichopodidae)。环裂亚目(cyclorrhapha)包括无缝组(aschiza)和有缝组。无缝组包括科蚤蝇科(phoridae)、食蚜蝇科(syrphidae)和眼蝇科(conopidae)。有缝组包括无瓣类(acalyptratae)和有瓣类(calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(otitidae)、实蝇科(tephritidae)、潜蝇科(agromyzidae)和果蝇科(drosophilidae)。有瓣类包括科虱蝇科(hippoboscidae)、狂蝇科(oestridae)、寄蝇科(tachinidae)、花蝇科(anthomyiidae)、蝇科(muscidae)、丽蝇科(calliphoridae)和麻蝇科(sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(papilionidae)、粉蝶科(pieridae)、灰蝶科(lycaenidae)、蛱蝶科(nymphalidae)、斑蝶科(danaidae)、眼蝶科(satyridae)、弄蝶科(hesperiidae)、天蛾科(sphingidae)、大蚕蛾科(saturniidae)、尺蛾科(geometridae)、灯蛾科(arctiidae)、夜蛾科(noctuidae)、毒蛾科(lymantriidae)、透翅蛾科(sesiidae)和谷蛾科(tineidaee)。

对于主要作物的本发明昆虫害虫包括：玉米：玉米螟，欧洲玉米钻心虫(europeancornborer)；小地老虎(agrotisipsilon)，黑地蚕(blackcutworm)；谷实夜蛾，美洲棉铃虫(cornearworm)；草地夜蛾(spodopterafrugiperda)，秋夜蛾(fallarmyworm)；西南玉米杆草螟(diatraeagrandiosella)，西南玉米钻心虫(southwesterncornborer)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎钻心虫(lessercornstalkborer)；小蔗螟(diatraeasaccharalis)，甘蔗钻心虫(surgarcaneborer)；玉米根叶甲(diabroticavirgifera)，西方玉米根虫(westerncornrootworm)；长角叶甲巴氏亚种(diabroticalongicornisbarberi)，北方玉米根虫(northerncornrootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(diabroticaundecimpunctatahowardi)，南方玉米根虫(southerncornrootworm)；纹路叩甲属(melanotusspp.)，铁线虫(wireworms)；圆头犀金龟(cyclocephalaborealis)，圆头独角仙(蛴螬)(northernmaskedchafer(whitegrub))；圆头无斑犀金龟(cyclocephalaimmaculata)，南方圆头犀金龟(蛴螬)(southernmaskedchafer(whitegrub))；日本金龟(popilliajapontca)，日本甲虫(japanesebeetle)；玉米铜色跳甲(chaetocnemapulicaria)，玉米跳甲(cornfleabeetle)；玉米谷喙甲(sphenophorusmaidis)，玉米谷象(maizebillbug)；玉米缢管蚜(rhopalosiphummaidis)，玉米蚜(cornleafaphid)；玉米根蚜(anuraphismaidiradicis，cornrootaphid)；美洲谷长蝽(blissusleucopterusleucopterus)，麦虱(chinchbug)；赤腿黑蝗(melanoplusfemurrubrum)，赤腿蚱蜢(redleggedgrasshopper)；血黑蝗(melanoplussanguinipes)，迁徙蚱蜢(migratorygrasshopper)；玉米种蝇(hylemyaplatura)，玉米种蛆(seedcornmaggot)；美洲黍潜叶蝇(agromyzaparvicornis)，玉米斑潜叶蝇(cornblotleafminer)；玉米黄呆蓟马(anaphothripsobscrurus)，草蓟马(grassthrips)；窃叶蚁(solenopsismilesta)，窃蚁(thiefant)；二斑叶螨(tetranychusurticae)，二点叶螨(twospottedspidermite)；高粱：玉米禾螟(chilopartellus)，高粱钻心虫(sorghumborer)；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米茎钻心虫；粒肤地老虎(feltiasubterranea)，颗粒地老虎(granulatecutworm)；phyllophagacrinita，蛴螬；伪金针虫属(eleodes)、叩头虫属(conoderus)和aeolus属，铁线虫；黑甲负泥虫(oulemamelanopus)，谷类植物跳甲(cerealleafbeetle)；玉米铜色跳甲，玉米跳甲；玉米谷喙甲、玉米谷象；玉米缢管蚜；蔗黄伪毛蚜(siphaflava)，甘蔗黄蚜(yellowsugarcaneaphid)；美洲谷长蝽(blissusleucopterusleucopterus)，麦虱；高粱瘿蚊(contariniasorghicola)，高粱蠓(sorghummidge)；朱砂叶螨(tetranychuscinnabarinus)，棉红蜘蛛(carminespidermite)；二斑叶螨、二点叶螨；小麦：美洲一星粘虫(pseudaletiaunipunctata)，行军虫(armyworm)；草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎钻心虫；西方灰地老虎(agrotisorthogonia)，西部切根虫(westerncutworm)；南美玉米苗斑螟，小玉米茎钻心虫；黑甲负泥虫，禾谷跳甲；三叶草叶象(hyperapunctata)，车轴草叶象甲(cloverleafweevil)；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯麦蚜(russianwheataphid)；麦二叉蚜(schizaphisgraminum)，绿虫(greenbug)；麦长管蚜(macrosiphumavenae)，英国禾谷蚜(englishgrainaphid)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；血黑蝗，迁徙蚱蜢；小麦瘿蚊(mayetioladestructor)，黑森瘿蚊(hessianfly)；麦红吸浆虫(sitodiplosismosellana)，麦蠓(wheatmidge)；美洲麦杆蝇(meromyzaamericana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheatstemmaggot)；麦疫种蝇(hylemyacoarctata)，麦种蝇(wheatbulbfly)；烟褐花蓟马(frankliniellafusca)，烟草蓟马(tobaccothrips)；茎锯蜂(cephuscinctus)，麦茎蜂(wheatstemsawfly)；郁金香瘤瘿螨(aceriatulipae)，麦瘿螨(wheatcurlmite)；向日葵：向日葵芽卷叶蛾(suleimahelianthana)，向日葵芽蛾(sunflowerbudmoth)；向日葵斑螟(homoeosomaelectellum)，美洲向日葵螟(sunflowermoth)；向日葵叶甲(zygogrammaexclamationis，sunflowerbeetle)；胡萝卜金龟(bothyrusgibbosus)，胡萝卜甲虫(carrotbeetle)；向日葵籽瘿蚊(neolasiopteramurtfeldtiana)，向日葵籽蠓(sunflowerseedmidge)；棉属植物：烟蚜夜蛾(heliothisvirescens)，棉卷叶蛾(cottonbudworm)；谷实夜蛾，美洲棉铃虫(cottonbollworm)；甜菜夜蛾(spodopteraexigua)，甜菜粘虫(beetarmyworm)；红铃麦蛾(pectinophoragossypiella)，棉红铃虫(pinkbollworm)；墨西哥棉铃象(anthonomusgrandis)，棉铃象甲(bollweevil)；棉蚜(aphisgossypii)，棉花蚜虫(cottonaphid)；棉跳盲蝽(pseudatomoscelisseriatus)，棉花跳盲蝽(cottonfleahopper)；结翅粉虱(trialeurodesabutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwingedwhitefly)；美国牧草盲蝽(lyguslineolaris)，牧草盲蝽tarnishedplantbug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；棉蓟马(thripstabaci)，洋葱蓟马(onionthrips)；烟褐花蓟马，草蓟马；朱砂叶螨，棉红蜘蛛；二斑叶螨，二点叶螨；稻：小蔗螟，甘蔗钻心虫；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；葡萄鞘叶甲(colaspisbrunnea，grapecolaspis)；稻水象甲(lissorhoptrusoryzophilus，ricewaterweevil)；米象(sitophilusoryzae，riceweevil)；黑尾叶蝉(nephotettixnigropictus)，稻叶蝉(riceleafhopper)；美洲谷长蝽，麦虱；喜绿蝽(acrosternumhilare，greenstinkbug)；大豆：大豆夜蛾(pseudoplusiaincludens)，大豆尺蠖(soybeanlooper)；梨豆夜蛾(anticarsiagemmatalis)，梨豆毛虫(velvetbeancaterpillar)；苜蓿绿夜蛾(plathypenascabra，greencloverworm)；玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；甜菜夜蛾，甜菜粘虫；烟蚜夜蛾，棉卷叶蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(epilachnavarivestis，mexicanbeanbeetle)；桃蚜(myzuspersicae，greenpeachaphid)；蚕豆微叶蝉(empoascafabae)，马铃薯叶蝉(potatoleafhopper)；喜绿蝽(acrosternumhilare)，绿臭蝽(greenstinkbug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；玉米种蝇，玉米种蛆；大豆蓟马(sericothripsvariabilis，soybeanthrips)；棉蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(tetranychusturkestani，strawberryspidermite)；二斑叶螨，二点叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；麦二叉蚜，绿虫；美洲谷长蝽，麦虱；喜绿蝽，绿臭蝽；褐臭椿(fuschistusservus，brownstinkbug)；玉米种蝇，玉米种蛆；小麦瘿蚊，黑森瘿蚊；麦岩螨(petrobialatens，brownwheatmite)；油籽油菜：甘蓝短棒蚜(brevicorynebrassicae)，甘蓝蚜(cabbageaphid)；十字花科跳甲(phyllotretacruciferae，fleabeetle)；蓓带夜蛾(mamestraconfigurata，berthaarmyworm)；小菜蛾(diamond-backmoth)；地种蝇属某些物种(deliassp.)，根蛆(rootmaggots)。

线虫包括寄生性线虫如根结线虫、胞囊线虫和根腐线虫，包括胞囊线虫属(heterodera)某些物种、根结线虫属(meloidogyne)某些物种和球胞囊属(globodera)某些物种；特别地是胞囊线虫成员，包括但不限于heteroderaglycines(大豆胞囊线虫)；heteroderaschachtii(甜菜胞囊线虫)；heteroderaavenae(谷类胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(globoderarostochiensis)和马铃薯白线虫(globoderapailiaa)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体属(pratylenchus)某些物种。

用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达多肽的植物或植物细胞，所述多肽编码本文中公开的杀虫多肽序列的多聚核苷酸，以及在被害虫侵袭的田间使该植物或其种子生长，其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施方案中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫类害虫具有杀虫活性，并且所述田间被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫类害虫侵袭。如本文中所定义，植物的“产量”指由植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”意指任何被测量的植物产物。生物质产生的增加是被测量植物产物的产量上的任意改善。增加植物产量具有几项商业应用。例如，增加植物叶片生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产物的生产。产量的增加可以包含任何统计学上显著的增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。在具体的方法中，植物产量由于表达本文中所公开杀虫蛋白的植物对害虫的抗性增强而增加。杀虫蛋白的表达导致害虫侵袭或采食植物的能力降低。

还可以用一种或多种化学组合物对植物进行处理，所述的化学组合物包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：水果/蔬菜除草剂：莠去津(atrazine)、除草定(bromacil)、敌草隆(diuron)、草甘膦(glyphosate)、利谷隆(linuron)、嗪草酮(metribuzin)、西玛津(simazine)、氟乐灵(trifluralin)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、氯吡嘧磺隆(halosulfurongowan)、百草枯(paraquat)、炔草胺(propyzamide)、稀禾定(sethoxydim)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氯吡嘧磺隆、indaziflam；水果/蔬菜杀虫剂：涕灭威(aldicarb)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuriengiensis)、甲萘威(carbaryl)、克百威(carbofuran)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、阿维菌素(abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯(cyfluthrin/β-cyfluthrin)、顺式氰戊菊酯(esfenvalerate)、高三氟氯氰菊酯(λ-cyhalothrin)、灭螨醌(acequinocyl)、联苯肼酯(bifenazate)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、双苯氟脲(novaluron)、环虫酰肼(chromafenozide)、噻虫啉(thiacloprid)、呋虫胺(dinotefuran)、嘧螨酯(fluacrypyrim)、螺螨酯(spirodiclofen)、γ-氯氟氰菊酯(gama-cyhalothrin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、艾克敌(spinosad)、氯虫苯甲酰胺(rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(cyazypyr)、杀铃脲(triflumuron)、螺虫乙酯(spirotetramat)、吡虫啉(imidacloprid)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、硫双威(thiodicarb)、氰氟虫腙(metaflumizone)、氟啶虫胺腈(sulfoxaflor)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、cyanopyrafen、可尼丁(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺(flonicamid)、甲硫威(methiocarb)、氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin-benzoate)、恶二唑虫(indoxacarb)、fozthiazate、苯线磷(fenamiphos)、吡丙醚(pyriproxifen)、苯丁锡(fenbutatin-oxid)；水果/蔬菜杀真菌剂：唑嘧菌胺(ametoctradin)、嘧菌酯(azoxystrobin)、苯噻菌胺(benthiavalicarb)、啶酰菌胺(boscalid)、克菌丹(captan)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、含铜杀菌剂(copper)、氰霜唑(cyazofamid)、环氟菌胺(cyflufenamid)、霜脲氰(cymoxanil)、环丙唑醇(cyproconazole)、嘧菌环胺(cyprodinil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯酰吗啉(dimetomorph)、腈菌萘(dithianon)、咪唑菌酮(fenamidone)、环酰菌胺(fenhexamid)、氟啶胺(fluazinam)、咯菌腈(fludioxonil)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、灭菌丹(folpet)、福賽得(fosetyl)、异菌脲(iprodione)、丙森锌(iprovalicarb)、吡唑萘菌胺(isopyrazam)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、代森锰锌(mancozeb)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、甲霜灵/精甲霜灵(metalaxyl/mefenoxam)、代森联(metiram)、苯菌酮(metrafenone)、腈菌唑(myclobutanil)、戊菌唑(penconazole)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、霜霉威(propamocarb)、戊唑醇(propiconazole)、甲代森锌(propineb)、碘喹唑酮(proquinazid)、丙硫菌唑(prothioconazole)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、嘧霉胺(pyrimethanil)、苯氧喹啉(quinoxyfen)、螺环菌胺(spiroxamine)、硫磺(sulphur)、戊唑醇(tebuconazole)、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)；谷类植物除草剂：2.4-d、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、溴苯腈(bromoxynil)、唑草酮-e(carfentrazone-e)、氯麦隆(chlorotoluron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、炔草酸-p(clodinafop-p)、二氯吡啶酸(clopyralid)、麦草畏(dicamba)、禾草灵酸-m(diclofop-m)、吡氟草胺(diflufenican)、恶禾草灵(fenoxaprop)、双氟磺草胺(florasulam)、氟酮磺隆-na(flucarbazone-na)、氟噻草胺(flufenacet)、氟啶嘧磺隆-m(flupyrsulfuron-m)、氟草烟(fluroxypyr)、呋草酮(flurtamone)、草甘膦、碘甲磺隆(iodosulfuron)、碘苯腈(ioxynil)、异丙隆(isoproturon)、mcpa、甲磺胺磺隆(mesosulfuron)、甲磺隆(metsulfuron)、二甲戊(pendimethalin)、唑啉草酯(pinoxaden)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、苄草丹(prosulfocarb)、甲氧磺草胺(pyroxsulam)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、肟草酮(tralkoxydim)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、氟乐灵、三氟甲磺隆(tritosulfuron)；谷类植物杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺(bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环丙唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺(dimoxystrobin)、氟环唑(epoxiconazole)、苯锈啶(fenpropidin)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑(fluquinconazole)、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、醚菌酯、叶菌唑(metconazole)、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺(prochloraz)、戊唑醇、碘喹唑酮、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、苯氧喹啉、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷类植物杀虫剂：乐果(dimethoate)、高三氟氯氰菊酯(λ-cyhalthrin)、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯(bifenthrin)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒(acetamiprid)、呋虫胺(dinetofuran)、clorphyriphos、抗蚜威(pirimicarb)、甲硫威、氟啶虫胺腈；玉米除草剂：莠去津、甲草胺(alachlor)、溴苯腈、乙草胺(acetochlor)、麦草畏、二氯吡啶酸、二甲吩草胺((s-)dimethenamid)、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮(isoxaflutole)、精异丙甲草胺(s-metolachlor)、甲基磺草酮(mesotrione)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、磺草酮(sulcotrione)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、苯吡唑草酮(topramezone)、环磺酮(tembotrione)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、酮脲磺草吩(thiencarbazone)、氟噻草胺、pyroxasulfon；玉米杀虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、溴氰虫酰胺、氟虫腈(fipronil)、吡虫啉、高三氟氯氰菊酯、七氟菊酯(tefluthrin)、特丁硫磷(terbufos)、噻虫嗪、可尼丁、螺环菌胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲(lufenuron)、丁基嘧啶磷(tebupirimphos)、乙虫腈(ethiprole)、溴氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素(avermectin)；玉米杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、环丙唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯(fenitropan)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯；稻除草剂：丁草胺(butachlor)、敌稗(propanil)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、氰氟草酯(cyhalofop)、杀草隆(daimuron)、四唑酰草胺(fentrazamide)、咪唑磺隆(imazosulfuron)、苯噻草胺(mefenacet)、恶嗪草酮(oxaziclomefone)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron)、稗草畏(pyributicarb)、二氯喹啉酸(quinclorac)、禾草丹(thiobencarb)、茚草酮(indanofan)、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、恶嗪草酮、双环磺草酮(benzobicyclon)、环酯草醚(pyriftalid)、五氟磺草胺(penoxsulam)、双草醚(bispyribac)、丙炔恶草酮(oxadiargyl)、乙氧磺隆(ethoxysulfuron)、丙草胺(pretilachlor)、甲基磺草酮、tefuryltrione、恶草酮(oxadiazone)、恶唑禾草灵、pyrimisulfan；稻杀虫剂：地亚农(diazinon)、仲丁威(fenobucarb)、丙硫克百威(benfuracarb)、噻嗪酮(buprofezin)、呋虫胺(dinotefnran)、氟虫腈、吡虫啉、异丙威(isoprocarb)、噻虫啉、环虫酰肼、可尼丁、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、艾克敌、spinotoram、氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯(etofenprox)、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈；稻杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、环丙酰亚胺(carpropamid)、双氯氰菌胺(diclocymet)、苯醚甲环唑、敌瘟磷(edifenphos)、嘧菌腙(ferimzone)、庆大霉素(gentamycin)、己唑醇(hexaconazole)、恶霉灵(hymexazol)、异稻瘟净(iprobenfos，ibp)、稻瘟灵(isoprothiolane)、异噻菌胺(isotianil)、春雷霉素(kasugamycin)、代森锰锌、苯氧菌胺(metominostrobin)、肟醚菌胺(orysastrobin)、戊菌隆(pencycuron)、烯丙苯噻唑(probenazole)、戊唑醇、甲代森锌、咯喹酮(pyroquilon)、戊唑醇、甲基硫菌灵、噻酰菌胺(tiadinil)、三环唑(tricyclazole)、三氟啶磺隆、维利霉素(validamycin)；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆(fluometuron)、msma、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、扑草净(prometryn)、氟乐灵、唑草酮、烯草酮(clethodim)、精吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)、草甘膦、氟草敏(norflurazon)、二甲戊、嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆、吡喃草酮(tepraloxydim)、草铵膦、丙炔氟草胺(flumioxazin)、噻苯隆(thidiazuron)；棉花杀虫剂：乙酰甲胺磷(acephate)、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinbenzoate)、吡虫啉、恶二唑虫、高三氟氯氰菊酯、艾克敌、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚(pyridalyl)、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫苯甲酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、溴氰虫酰胺、艾克敌、spinotoram、γ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈；棉花杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、含铜杀菌剂、环丙唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰(maneb)、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲代森锌、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、五氯硝基苯(quintozene)、戊唑醇、氟醚唑(tetraconazole)、甲基硫菌灵、肟菌酯；大豆除草剂：甲草胺、灭草松(bentazone)、氟乐灵、氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)、氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、恶唑禾草灵、氟磺胺草醚(fomesafen)、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟(imazamox)、咪唑喹啉酸(imazaquin)、咪唑乙烟酸(imazethapyr)、精异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊、吡喃草酮、草铵膦；大豆杀虫剂：高三氟氯氰菊酯、灭多威(methomyl)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、艾克敌、spinotoram、氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮、螺虫乙酯、spinodiclofen、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、含铜杀菌剂、环丙唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇(flutriafol)、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、异菌脲、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、甲代森锌、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯；甜菜除草剂：氯草敏(chloridazon)、双苯胺灵(desmedipham)、乙氧呋草黄(ethofumesate)、甲双苯胺灵(phenmedipham)、野麦畏(triallate)、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定(lenacil)、苯嗪草酮(metamitron)、氯甲喹啉酸(quinmerac)、噻草酮(cycloxydim)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、吡喃草酮、喹禾灵(quizalofop)；甜菜杀虫剂：吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮、七氟菊酯、氯虫苯甲酰胺、cyaxypyr、氟虫腈、克百威；卡诺拉油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵酸、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡唑草胺(metazachlor)、氟乐灵、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、氯甲喹啉酸、喹禾灵、烯草酮、吡喃草酮；卡诺拉油菜杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、环丙唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑(flusilazole)、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、缩节胺(mepiquat-chloride)、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑(paclobutrazole)、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯、乙烯菌核利(vinclozolin)；卡诺拉油菜杀虫剂：克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(fluvaleriate)、乙虫腈、艾克敌、spinotoram、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮。

以下实施例以说明方式且不以限制方式提供。

实施例

实施例1.axmi115融合蛋白的设计和测试

axmi115描述于美国专利公开20100004176中(氨基酸序列在本文中如seqidno:43所示)。该基因与vip3aa享有70％的序列同源性。axmi115的经密码子优化形式(在本文中也被称为axmi115v01，seqidno:42中所示)利用大肠杆菌表达载体进行克隆和表达。所产生的蛋白在体外生物测定中显示对多种昆虫害虫具有杀虫活性，包括欧洲玉米螟虫(ecb)、螟蛉(cew)、秋天行军虫(faw)和小地老虎(bcw)。

axmi005也描述于美国专利公开20100004176中。该基因与vip3aa享有94％的序列同源性。axmi005的经密码子优化形式(optaxmi005，在本文中如seqidno:44所示)利用大肠杆菌表达载体进行克隆和表达。所产生的蛋白在体外生物测定中显示对多种昆虫害虫具有杀虫活性，包括谷实夜蛾(hz)、烟芽夜蛾(hv)、faw、bcw、甘蔗螟虫(scb)和梨豆毛虫(vbc)。

与axmi005相比，axmi115对hz和faw的相对活性较低。而且如上面所指出，axmi005不具有ecb活性。在鉴定负责差异特异性以及两种蛋白活性的结构域的尝试中，如下面所描述制备表达optaxmi005和axmi115经密码子优化形式的融合体的构建体，并图示于图1中。在大肠杆菌中表达蛋白，并在体外生物测定中针对ebc、hz、faw和bcw进行测试。当与由pax5477(axmi115v01，在本文中如seqidno:42所示)所表达的蛋白相比时，由pax6307(axmi115v02.01，在本文中如seqidno:1所示)所表达的蛋白对被测的所有四种害虫显示出增强的活性。

将pax6307中表达的基因(axmi115v02.01)克隆入由甘蔗泛素启动子驱动蛋白表达的植物表达载体pag6141中。

对来自表达axmi115v01和axmi115v02.01的转基因植物的叶片样品进行测试，其中在实验室昆虫生物测定中针对ebc、hz、faw和bcw，在田间测试中针对ebc、hz和faw。结果显示经改良的axmi115v02.01对所有被测害虫具有较好的效力。

质粒说明：

对来源于vip3aa、axmi005、axmi115v01、axmi163和axmi184dna序列的硅片(insilico)翻译的氨基酸序列进行比对，以鉴定所有同源物中的保守性氨基酸(axmi163和axmi184也描述于美国专利公开20100004176中)。

利用pax5478(含有axmi005的经密码子优化形式，seqidno:44中所示)中存在的optaxmi005序列和pax5477(含有axmi115的经密码子优化形式)中存在的optaxmi115序列，针对axmi005和axmi115v01的3个保守区设计引物。通过重叠pcr产生3种融合基因(参见图1)。

将这些pcr反应产生的融合基因的dna克隆入大肠杆菌表达载体prsf1b中。所得表达载体显示于表1中。利用已知方法表达蛋白，并在体外生物测定中对大肠杆菌提取物进行测试。

表1.融合基因构建体

体外生物测定

对载体中表达的大肠杆菌粗提取物进行针对hz、ecb、faw和bcw的测定。结果显示于表1(发育不良)和表3(致死)中。

表2.发育不良分值

*分值系统：

0＝未观察到效果

1＝轻度非均一性发育不良

2＝中度非均一性发育不良

3＝中度至严重的均一性发育不良

4＝致死(<100％)的均一性发育不良

5＝完全致死

表3.致死百分比

载体pax6307(融合a)表达的蛋白变化了6个氨基酸，其被命名为axmil115v02.01。该融合蛋白的氨基酸序列示于seqidno:15中。

表达axmi115v01(pax5476)和axmil115v02.01(pax6307)的大肠杆菌表达载体具有n末端的6xhis标签。利用6xhis标签的镍结合性质对这两种蛋白进行纯化。通过体外生物测定，对不同浓度的经纯化蛋白进行针对ecb、faw、bcw和甜菜粘虫(baw)的测定。结果显示，与axmi115v01相比，axmi115v02.01在所有情况下具有增强的活性(表4和5)。

表4.发育不良分值

表5.致死分值

植物叶盘生物测定

将axmi115v01(seqidno:42)和axmil115v02.01(seqidno:1)分别克隆入植物载体pag6585和pag6141中，产生转基因玉米植株。取样进行pcr和western印迹分析以及针对hz、ecb、faw和bcw的体外叶盘生物测定。生物测定计分为未损伤、低度损伤(1-数个孔)、中度损伤和重度损伤。未损伤和轻度损伤被认为是正面结果，而中度至重度损伤被认为是负面结果。

在体外叶盘生物测定中对来自pcr和western阳性植株的叶片材料进行测定。图2a显示对于每个构建体给出未损伤、轻度损伤、中度损伤或重度损伤生物测定分值的pcr阳性植株百分比。western印迹显示表达optaxmil115v02.01的植株中的蛋白表达水平总体上高于表达axmi115v01的植株。

制备产生了表达axmi115v02.01的额外的转基因植株。在体外叶盘生物测定中对来自pcr和western阳性植株的叶片材料进行针对hz、ecb、faw和bcw的测定。结果显示于图2b中。

植株田间试验

表达表6中所显示基因的植株种植于polkcounty,ia测试位点。当植株处于v3-v4叶片期时，利用应用1次草甘膦(20oz./aofbuccaneer5,tenkoz,inc.)鉴定并去除阴性分离株。昆虫压力源自ecb、hz和faw的人工侵袭。

ecb的侵袭模仿第一代和第二代的天然发生。对于ecb，总共约340只幼虫侵袭入每个植株的叶轮(第一代，ecb1)或叶腋(第二代，ecb2)。通过guthrie1-9等级量表对ecb1进行评估。对ecb2测量茎隧道的总长度，以cm测量。

20只hz幼虫侵袭到每个植株初生穗的末稍。还有中度天然侵袭，使得这些人工侵袭被放大。ear损伤以sq.cm测量。

约60只faw幼虫侵袭入叶轮。损伤以如下面所描述的modifieddavis109等级量表进行测量。

这些田间试验的结合显示于表6中。

表6.田间试验结果

faw-modifieddavis1-9等级量表说明

1.轮生叶上无可见损伤或仅有针孔形病变。

2.轮生叶上存在针孔形和小的环状病变。

3.轮生叶和卷叶上存在小的环状病变和少许长度至1.3cm(1/2")的小的拉长形(长方形)病变。

4.少许轮生叶和卷叶上存在数个长度为1.3至2.5cm(1/2"至1")的小至中等大小的拉长形病变。

5.少许轮生叶和卷叶上存在数个长度大于2.5cm(1")的拉长形病变和/或啃食轮生叶和/或卷叶形成的数个小至中等大小的均一至不规则形状的孔(基膜被耗尽)。

6.数个轮生叶和卷叶上存在数个大的拉长形病变和/或啃食卷叶/轮生叶形成的数个大的均一至不规则形状的孔。

7.数个轮生叶和卷叶上存在许多大大小小的拉长形病变以及啃食轮生叶和卷叶形成的数个大的均一至不规则形状的孔。

8.大多数轮生叶和卷叶上存在许多大大小小的拉长形病变以及啃食轮生叶和卷叶形成的许多中等至大的均一至不规则形状的孔。

9.轮生叶和卷叶几乎完全被破坏。

davis,f.m.,s.s.ng和w.p.williams.1992.visualratingscalesforscreeningwhorl-stagecornforresistancetofallarmyworm.miss.agric.forestryexp.stn.tech.bull.186.

ecb-guthrie1-9等级量表说明。

1.无可见的叶片损伤。

2.少许叶片上有少量蛀洞损伤。

3.数个叶片上常见蛀洞损伤。

4.数个叶片上存在蛀洞和拉长形病变。

5.数个叶片上存在拉长形病变。

6.数个叶片上存在约2.5cm长的拉长形病变。

7.约一半叶片上常见长的病变。

8.约三分之二的叶片上常见长的病变。

9.大部分叶片存在长的病变。

guthrie,w.d.,f.f.dicke和c.r.neiswander.1960.leafandsheathfeedingresistancetotheeuropeancornborerineightinbredlinesofdentcorn.ohio.agric.exp.sta.res.bull.860.

实施例2.axmi115v02的定向进化。

已经利用定向进化提高axmi115对ecb、hz、faw、bcw和vbc的效力和活性谱。为了鉴定参与昆虫毒性的axmi115区域，制备了axmi115c末端部分中的几个axmi115/axmi005序列交换变体。对axmi115和axmi005之间的21个序列差异区进行命名(参见作为整体通过引用并入本文的美国专利公开no.20100004176)，并使axmi115中的这些序列区被相应的axmi005序列区替换。杂交蛋白的生物测定显示，第2、3、10和18区的置换与昆虫毒性增强有关联。

制备靶向第2、3、10和18区位点的点突变库。在一式4份水平上在1.5倍范围内对这些点突变库进行针对ecb、hz、faw、bcw和vcb的测定。在一式4份水平上进行再测定，并在一式16份水平上按比例扩大。以下点突变显示出针对一种或多种害虫的增强的活性：

表7.axmi115点突变的活性

这些变体在c末端部分含有突变。为了寻找axmi115v02(pax6307)的协同增强，将上述变体中的一些的c末端部分克隆入axmi115v02(pax6307)中。进行扩大测定，并鉴定与axmi115v02相比活性增强的变体。

表8.axmi115v02突变体的活性

变体axmi115b2l11h6(v02)显示针对h.zea、vbc、faw的活性增强。其被命名为axmi115v02(evo27)。axmi115v02(evo27)的核苷酸序列示于seqidno:4中，所编码的氨基酸序列示于seqidno:18中。

变体axmi115b18l12b10(v02)显示针对ebc的增强。其被命名为axmi115v02(evo28)。axmi115v02(evo28)的核苷酸序列示于seqidno:5中，所编码的氨基酸序列示于seqidno:19中。

变体axmi115b2l11f9(v02)显示针对h.zea、vbc、faw的增强。其被命名为axmi115v02(evo29)。axmi115v02(evo29)的核苷酸序列示于seqidno:6中，所编码的氨基酸序列示于seqidno:20中。

在axmi115v02序列的c末端区域中进行了额外的突变。鉴定出3个变体相对于axmi115v02的活性增强(表9)。对这些c末端突变体中的2个测定了lc50和ec50数值(表10)。

axmi115v02(evo31)相对于axmi115v02显示针对faw、大豆尺蠖(sbl)和vbc的致死性增强。axmi115v02(evo31)的核苷酸序列示于seqidno:7中，氨基酸序列示于seqidno:21中。

axmi115v02(evo32)相对于axmi115v02显示针对ecb和h.zea的致死性增强。axmi115v02(evo32)的核苷酸序列示于seqidno:8中，氨基酸序列示于seqidno:22中。

axmi115v02(evo38)相对于axmi115v02显示针对bcw的致死性增强。axmi115v02(evo38)的核苷酸序列示于seqidno:47中，氨基酸序列示于seqidno:48中。

表9.axmi115v02c末端突变体的活性

表10.c末端突变体的lc50和ec50

sbl＝大豆尺蠖

实施例3.杀虫活性的额外测定

可以对本发明的核苷酸序列测试其产生杀虫蛋白的能力。通常用一些方法评估杀虫蛋白用作害虫杀虫剂的能力。本领域熟知的一种方法是进行饲喂测试。在这种饲喂测试中，将害虫暴露于含有待测化合物的样品或对照样品中。通常这通过将待测物质或该物质的适宜稀释液放置于害虫将摄食的物质例如人造食物上而进行。待测物质可以由液体、固体或浆液构成。可以将待测物质放置于表面，接着使其干燥。或者，可以将待测物质与软化的人造食物混合，接着配药入测试室中。测试室可以是例如杯、盘或微量滴定板的孔。

用于吸吮害虫(例如蚜虫)的测定可以包括用隔离物将测试物质与昆虫分离，所述隔离物理想上是能够被吸吮昆虫的刺吸式口器刺穿的部分，以允许摄食测试物质。通常测试物与饲养刺激物例如蔗糖混合，以促进测试化合物的摄食。

其他类型的测试可以包括将测试物质显微注射入在虫的口或肠道中，以及研发转基因植株，随后测试以转基因植株饲养害虫的能力。植株测试可以包括分离一般消耗的植物部分，例如与叶片相连的小笼，或者在含有昆虫的笼中分离整株植株。

测试害虫的其他方法和步骤是本领域公知的，并且可以在例如robertson和preisler,eds.(1992)pesticidebioassayswitharthropods,crc,bocaraton,fl中找到。或者，测试常常描述于期刊arthropodmanagementtests和journalofeconomicentomology中或者通过与entomologicalsocietyofamerica(esa)讨论而描述。

在一些实施方案中，将编码本文中所公开杀虫蛋白的毒性区的dna区域克隆入大肠杆菌表达载体pmal-c4x中，位于编码麦芽糖结合蛋白(mbp)的male基因后面。这些相同读码框的融合使得在大肠杆菌中表达mbp-axmi融合蛋白。

对于在大肠杆菌中表达，用单独的质粒转化bl21*de3。将单个菌落接种于添加了羧苄青霉素和葡萄糖的lb中，并于37℃生长过夜。第二天，用1％的过夜培养物接种新鲜培养基，并于37℃生长至对数期。随后，培养物用0.3mmipgt于20℃诱导过夜。将每份细胞沉淀物重悬于20mmtris-cl缓冲液(ph7.4)+200mmnacl+1mmdtt+蛋白酶抑制剂中，并进行超声。可以利用sds-page分析确认融合蛋白的表达。

接着，无细胞总提取物流过与快速蛋白液相色谱(fplc)连接的直链淀粉柱，以对mbp-axmi融合蛋白进行亲和纯化。用10mm麦芽糖溶液将已结合的融合蛋白从树脂上洗脱下来。接着，用因子xa或胰蛋白酶切割经纯化的融合蛋白，以将氨基端mbp标签从axmi蛋白中去除。蛋白的切割和溶解性可以通过sds-page确定。

实施例4.构建合成序列

在本发明的一个方面中，制备了合成的axmi序列。这些合成序列与母本axmi序列相比dna序列发生改变，并且编码与其相应的母本axmi蛋白共线但是缺少许多内毒素蛋白中存在的c末端“晶体结构域”的蛋白。

在本发明的另一个方面中，设计了合成基因的经修饰形式，以使所得到的肽靶向植物器官，例如内质网或非原质体。已知使得融合蛋白靶向植物器官的肽序列是本领域公知的。例如，本领域公知，来自白羽扇豆(lupinusalbus)的酸性磷酸酶基因(genebankidgi:14276838；milleretal.(2001)plantphysiology127:594-606)的n末端区域能够导致异源蛋白靶向内质网。如果所得融合蛋白还在c末端含有包含肽n末端-赖氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即“kdel”基序(seqidno:46))的内质网滞留序列，则融合蛋白将靶向内质网。如果融合蛋白在c末端缺少内质网靶向序列，则蛋白将靶向内质网，但是将最终被隔离到非原生质体中。

实施例5.用本文中描述的杀虫蛋白转化玉米细胞

玉米穗于授粉后8-12天进行最佳收集。从穗中分离胚，并优选大小为0.8-1.5mm的那些胚用于转化。将胚以盾片面向上放置于适宜的孵育培养基上，例如dn62a5s培养基(3.98g/ln6盐；1ml/l(1000x贮存液)n6维生素；800mg/ll-天门冬酰胺；100mg/l肌醇；1.4g/ll-脯氨酸；100mg/l酪蛋白氨基酸；50g/l蔗糖；1ml/l(1mg/ml贮存液)2,4-d)。然而，除了dn62a5s的其他培养基和盐是适宜的并且是本领域公知的。胚在黑暗中于25℃孵育过夜。然而，本质上不必要孵育胚过夜。

将所得外植体转移至方格盘(每盘30-40)，转移到渗透性培养基中约30-45分钟，接着转移至束射板上(参见例如pct公开no.wo/0138514和美国专利no.5,240,842)。

使用气溶胶粒子束加速器，利用大体上如pct公开no.wo/0138514中所描述的条件，使针对本发明的基因设计的dna构建体加速进入植物组织中。束射后，将胚在渗透性培养基上孵育约30min，并放置于孵育培养基上，在黑暗中于25℃过夜。为了避免出现过度损伤的经束射外植体，其在转移至复原培养基中之前孵育至少24小时。接着使胚分散于复原期培养基上，在黑暗中于25℃放置约5天，接着转移至选择培养基中。外植体在选择培养基中孵育长至8周，这取决于所使用具体选择的性质和特性。选择期后，将所得愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到形成成熟的体细胞胚。接着将所得成熟体细胞胚放置于弱光下，并通过本领域已知的方法起始再生过程。使所得到的根扎根于生根培养基中，并将所得植株转移至温育罐中，作为转基因植株繁殖。

材料

dn62a5s培养基

用1nkon/1nkcl将溶液ph调至ph5.8，加入浓度为3g/l的gelrite(sigma)，并对培养基进行高压蒸气灭菌。冷却至50℃后，加入2ml/l的5mg/ml硝酸银贮存液(phytotechnologylabs)。

实施例6.通过农杆菌介导的转化将本发明的基因转化入植物细胞中

玉米穗于授粉后8-12天进行最佳收集。从穗中分离胚，并优选大小为0.8-1.5mm的那些胚用于转化。将胚以盾片面向上放置于适宜的孵育培养基上，并在黑暗中于25℃孵育过夜。然而，本质上不必要孵育胚过夜。使胚与农杆菌菌株接触约5-10min，所述农杆菌菌株含有用于ti质粒介导的转移的适宜载体，接着置于共培育培养基中约3天(在黑暗中于25℃)。共培育后，外植体在选择培养基中孵育长至8周，这取决于所使用具体选择的性质和特性。选择期后，将所得愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到形成成熟的体细胞胚。接着将所得成熟体细胞胚放置于弱光下，并通过本领域已知的方法起始再生过程。

说明书中提及的所有出版物和专利公开解释本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利公开通过引用并入本文，程度与如果指明每篇单独的出版物或专利文献特别地以及单独地通过引入并入相同。

尽管前述发明已经通过阐述以及出于清楚理解的目的通过示例进行详细描述，然而显而易见的是，在所附权利要求的范围内可以实施某些变化和修改。

序列表

<110>d•莱特宁

h•m•德塞

v•海恩瑞奇斯

<120>axmi115变体灭虫基因及其使用方法

<130>2013010pn

<150>61/471,848

<151>2011-04-05

<160>48

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>2415

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>axmi115变体序列

<400>1

atgaacatgaacaacaccaagctcaatgcaagggcgctgccgagcttcatcgactacttc60

aatggcatctatggcttcgccaccggcatcaaggacatcatgaacatgatcttcaagacc120

gacaccggcggcaacctcaccttggatgagatcctcaagaaccagcagctgctgaatgag180

atctcaggcaagctggacggcgtcaatggaagcctcaacgacctcattgctcaaggcaac240

ctcaacaccgagctgagcaaggagatcctcaagattgcaaatgagcagaaccaggtgctg300

aatgatgtcaacaacaagctggacgccatcaacaccatgctgcacatctacctgccaaag360

atcacctcaatgctctctgatgtgatgaagcagaactacgcgctgagcctccagattgag420

tacctctcaaagcagctgcaagagatctccgacaagctggacatcatcaatgtcaatgtg480

ctcatcaacagcaccttgacagagatcacgccggcctaccagaggatcaagtatgtcaat540

gagaagttcgacaagctcaccttcgccaccgagagcaccctccgcgccaagcaaggcatc600

ttcaatgaagattcatttgacaacaacaccttggagaacttgacagacctcgccgagctg660

gccaagagcatcaccaagaatgatgtggacagcttcgagttctacctccacaccttccat720

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atcaccaaggatgagatcaagacaagcggcagcgagatcggcaaggtctacagcttcctc840

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aatggatatgaagcatggggagacaacttcatcatcctggaggccaagctcttcgagaca2040

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accggcaatgagctgaggattgatcattcaagaggaggctacttccgccaaagcctcaac2160

atcgacagctacagcacctacgacctcagcttcagcttcagcggcctctgggccaaggtg2220

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ctcaccgccgagaggacaagcagcaccttccacagcttcagagacatcagcatcaaggag2400

aagattgaatagtaa2415

<210>2

<211>2397

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>axmi115变体序列

<400>2