本发明涉及生物
技术领域：
，具体说是一种检测海洋食品中铅污染的方法。
背景技术：
：我国海洋生物物种多样，资源丰富，但随着近年来人类活动影响的加剧，工业废水、城市污水的排放使养殖环境遭到严重破坏，其中重金属污染更是海洋生物污染中危害最严重的一类，威胁国民食品安全，如何有效检测海洋生物及由海洋生物制成的海洋食品中重金属污染已成为一个亟待解决的问题。目前，重金属离子检测常用的方法包括电化学法、分光光度法、电感耦合法和光谱法等。这类方法仪器昂贵、样品需要经过多步消解、样品需求量大且耗时长，这些局限也在一定程度限制了其在实际生产和生活中的应用。酶抑制法因其快速、简便和低成本的优势，正迅速应用于水、土壤、废弃物和食品中的痕量有害物质测定。酶法检测原理主要是利用酶活性位点上的基团与重金属离子发生特异性结合，对酶活产生抑制，抑制程度的高低可以显示重金属含量的多少。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测海洋食品中铅污染的方法。该方法具有检测灵敏度高、特异性好、准确性高、操作简便等优点。为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：本发明提供一种检测海洋食品中铅污染的方法，所述方法包括利用海洋食品处理seqidno.3所示脲酶并检测所述脲酶活性的步骤。进一步的，所述方法包括如下步骤：(1)提供待测海洋食品；(2)提供seqidno.3所示脲酶；(3)利用待测海洋食品处理步骤(2)所述脲酶，得到处理组脲酶；并以不经处理的空白脲酶作为对照组脲酶；(4)检测处理组和对照组脲酶活性；如果处理组脲酶低于对照组脲酶的活性，则提示待测海洋食品有被铅污染的风险。在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：s1、将待测海洋食品进行预处理，使所述海洋食品中的重金属以离子状态存在，获得待测样品液；s2、使用所述待测样品液处理seqidno.3所示脲酶，检测所述脲酶活性的被抑制程度；s3、将步骤s2检测的所述脲酶活性的被抑制程度作为一个具体值代入标准曲线方程中，经过计算获得所述海洋食品中的铅浓度；所述标准曲线方程为铅浓度与seqidno.3所示脲酶活性的被抑制程度所拟合的方程，所述方程的相关系数大于或等于0.9；优选的，所述标准曲线方程为i＝0.105c2+0.328c+1.44，其中，i为脲酶抑制率，单位为％，c为铅浓度，单位为μg/l。在一种实施方式中，步骤s1包括如下步骤：s11、将所述海洋食品制成匀浆，加入硝酸，获得第一处理液，所述硝酸的加入量为每克所述匀浆加2—3ml；s12、将所述第一处理液进行微波消解：120℃升温5min，恒温5min；160℃升温5min，恒温10min；180℃升温5min，恒温10min；冷却；s13、140℃～160℃条件下去酸，加入水获得待测样品液。在一种实施方式中，步骤s2中，所述使用所述待测样品液处理seqidno.3所示脲酶的处理时间为15—25min，优选为20min；处理方式为浸泡。在一种实施方式中，检测所述脲酶活性的被抑制程度包括如下步骤：s21、取经过所述待测样品液或铅离子标准溶液处理过的所述seqidno.3所示脲酶作为处理；取经过纯水处理过的所述seqidno.3所示脲酶作为对照；s22、将所述处理和所述对照分别按照如下方法处理：加入过量的尿素溶液，34-36℃恒温水浴反应5-10min，加入10％三氯乙酸溶液终止反应；从终止反应的液体中取部分液体加入过量的纳氏试剂，于415nm波长处测定其吸光值；所述处理的吸光值记为a1，所述对照的吸光值记为a0；s23、按照下式计算获得所述脲酶活性的被抑制程度即脲酶的抑制率i：脲酶抑制率i(％)＝[(a0-a1)/a0]×100％。本发明还提供了一种脲酶，其氨基酸序列如seqidno.3所示。本发明保护以上所述脲酶在检测海洋食品中铅污染的应用。本发明的有益效果如下：本发明得到的脲酶突变体t1(seqidno.3所示)对重金属离子pb2+的抑制作用具有特异性好和灵敏度高的优点，半数抑制浓度为20.12μg/l，且其它重金属离子hg2+、cu2+、cd2+对该脲酶无抑制作用。使用该脲酶突变体检测海洋食品中铅污染，得出的铅含量与原子吸收色谱法的结果相近，说明本申请检测方法的准确性很好。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、一种脲酶的获得及其表达、纯化和活性鉴定一、脲酶的获得根据ncbi公开的脲酶基因序列，设计一对引物(如seqidno.7和seqidno.8所示)，以萎缩芽孢杆菌(bacillusatrophaeus)编号bncc336879(购自北纳创联生物技术公司)的基因组dna为模板进行pcr扩增，电泳并回收约1.7kb左右的条带，经测序得到该脲酶编码基因的核苷酸序列seqidno.1，其编码的脲酶氨基酸序列为seqidno.2。二、工程菌的构建将seqidno.1所示脲酶编码基因连接到表达载体pet28a多克隆位点处，获得重组表达载体z1。将该重组表达载体z1转化大肠杆菌bl21(de3)，经pcr和测序鉴定，获得表达seqidno.2所示脲酶的工程菌j1。三、脲酶的诱导、表达和分离提纯1、脲酶的诱导表达及sds-page检测使用lb平板培养工程菌j1，挑取阳性单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、100r/min条件下振荡培养12h。然后再用lb液体培养基扩大培养，至菌液od600为0.6—0.8时向培养液中加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，在22℃、160r/min条件下振荡诱导培养16h。将经上述诱导培养后的培养液低温离心收集菌体，弃上清，用50ml缓冲液ⅰ(ph值为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：pbs20mmol/l，nacl500mmol/l，pmsf1mmol/l，及咪唑20mmol/l)重悬菌体沉淀。将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用超声波破碎，400w功率间歇破碎90次，然后将菌液进行低温离心，收集上清液，将上清液用0.45μm膜过滤后的滤液于4℃条件下保存。将诱导前、诱导后的大肠杆菌菌液、诱导后菌体经超声破碎得到的上清液和沉淀同时进行sds-page检测。sds-page检测结果：对比诱导前、诱导后的大肠杆菌菌液的sds-page检测结果，诱导后的大肠杆菌菌液中含有大量seqidno.2所示脲酶；对比诱导后菌体经超声破碎得到的上清液和沉淀的sds-page检测结果，诱导后菌体经超声破碎得到的上清液中含有大量seqidno.2所示脲酶。2、脲酶的纯化使用akta蛋白纯化系统，首先用超纯水洗蛋白纯化柱，再使用5倍柱体积的缓冲液ⅰ以1ml/min的流速平衡蛋白纯化柱。随后以0.1ml/min的流速将10ml步骤1中诱导后菌体经超声破碎得到的上清液(含有大量的seqidno.2所示脲酶)加入到蛋白纯化柱。再用5倍柱体积的缓冲液ⅰ以1ml/min的流速洗涤蛋白纯化柱。然后用缓冲液ⅱ(ph值为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：pbs20mmol/l，pmsf1mmol/l及咪唑250mmol/l)洗脱蛋白并用紫外检测仪在280nm下监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白。取部分洗脱得到的蛋白进行sds-page检测，结果证明得到了一条与理论蛋白大小(63.8kd)相同的蛋白条带，且通过分析可知该蛋白占总蛋白的比例高达99％，试剂盒检测洗脱得到的蛋白溶液中蛋白浓度为0.163mg/ml。四、脲酶的活性检测1、测定原理：脲酶在一定条件下，可水解尿素生成铵，在碱性条件下，铵盐转化成为氨，其与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，其色度与脲酶活性成正比。2、测定步骤：1)试剂配制：纳氏试剂的配制：碘化汞5.5g、碘化钾4.125g溶于25ml水中，溶解后转移到100ml容量瓶中，再称取14.4g氢氧化钠溶于50ml水中，待溶解冷却后，慢慢转移到上述100ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后倒入试剂瓶中，静置后取上清液。硫酸铵标准液的配制：精确称取硫酸铵0.9910g，加蒸馏水溶解后定容至1l容量瓶中，此溶液为15μmol/l的nh4+储存液；再将该储存液稀释为1.5μmol/l的nh4+标准溶液。2)标准曲线制作：准确吸取nh4+标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml(对应nh4+浓度为0.0、0.75、1.5、2.25、3.0、3.75、4.5μmol)分别置于不同的比色管中，加水至9ml，各加纳氏试剂1ml。于415nm波长处测定其吸光值。根据测得的吸光值绘制标准曲线。3)检测：取一定体积的待测脲酶样品，加入1ml3％(重量百分含量)的尿素溶液，35℃恒温水浴反应7min，加入1ml10％三氯乙酸溶液终止反应。从终止反应的液体中取0.5ml液体加入8.5ml蒸馏水及纳氏试剂1ml，使用分光光度计于415nm波长处测定其吸光值。依据步骤2)获得的标准曲线计算脲酶酶活。4)酶活定义：在步骤1)—3)实验条件下，定义每分钟分解底物产生1μmol/lnh4+所需的脲酶量为一个酶活力单位(u)。3、结果：将步骤三的步骤2中洗脱得到的蛋白溶液中蛋白的脲酶酶活力为5.68u/ml，比活力为41.8u/mg；该结果与商品化的脲酶(harvey，货号u21792，以下称对照脲酶)按照步骤四的方法检测得到的脲酶比活力35.6u/mg相近。五、不同重金属离子对脲酶的抑制实验1、标准液的配制：准确称取1.5985g硝酸铅，用少量硝酸溶液溶解，定容至1l，获得pb2+质量浓度为1mg/ml的储存液。准确称取0.1354干燥过的二氯化汞，加入硫酸和硝酸的混合酸液溶解，定容至100ml，获得hg2+质量浓度为1mg/ml的储存液。准确称取3.9289无水硫酸铜，用少量硝酸溶液溶解，定容至1l，获得cu2+质量浓度为1mg/ml的储存液。准确称取1g金属镉，用盐酸溶液和硝酸溶液溶解，定容至1l，获得cd2+质量浓度为1mg/ml的储存液。用去离子水分别对上述储存液进行稀释，获得不同浓度(10、20、30、40、50、60μg/l)的hg2+、cu2+、cd2+、pb2+标准液。2、实验方法处理1—24：用1ml不同浓度梯度(10、20、30、40、50、60μg/l)的hg2+、cu2+、cd2+、pb2+标准液分别溶解0.5g目标脲酶样品(步骤三的步骤2中洗脱得到的蛋白溶液中蛋白)；ck1：用1ml去离子水溶解0.5g目标脲酶样品(步骤三的步骤2中洗脱得到的蛋白溶液中蛋白)；处理25—48：1ml不同浓度梯度(10、20、30、40、50、60μg/l)的hg2+、cu2+、cd2+、pb2+标准液分别溶解0.5g对照脲酶；ck2：用1ml去离子水溶解0.5g对照脲酶；将上述处理及对照分别在室温抑制20min后，作为待测样品分别进行如下操作：取一定体积的待测样品，加入1ml3％(重量百分含量)的尿素溶液，35℃恒温水浴反应7min，加入1ml10％三氯乙酸溶液终止反应；从终止反应的液体中取0.5ml液体加入8.5ml蒸馏水及纳氏试剂1ml，于415nm波长处测定其吸光值。根据各处理的吸光值a1及其相应对照(ck1或ck2)的吸光值a0，计算脲酶抑制率(脲酶抑制率i(％)＝[(a0-a1)/a0]×100％)，再根据不同重金属离子浓度c及相应的脲酶抑制率i，使用spss软件进行拟合，得到各重金属离子对各脲酶的抑制效应拟合方程(相关系数在0.97以上)和半数抑制浓度(即：使脲酶活性降低50％所需要的重金属离子浓度)。半数抑制浓度越低，说明该脲酶对该重金属离子越敏感，即将该脲酶用于检测该重金属离子的灵敏度越高。3、结果如表1所示，与对照脲酶相比，本实施例获得的脲酶对重金属离子更敏感，即检测重金属离子的灵敏性更好，但两种脲酶对重金属离子的特异性不是很好。表1、不同重金属离子对脲酶样品的半数抑制浓度(μg/l)实施例2、脲酶突变体的获得及其表达、纯化和活性鉴定一、脲酶突变体的获得根据脲酶的功能区域，设计若干与实施例1得到的脲酶在氨基酸序列seqidno.2特定位置上存在2—3个氨基酸替换的脲酶突变体，其中四个突变体(t1、t2、t3、t4)的突变位点信息如下：突变体t1为在脲酶seqidno.2序列的第371位将氨基酸e(glu)替换为m(met)，且在第373位将氨基酸k(lys)替换为p(pro)；该突变体t1的氨基酸序列如seqidno.3所示，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.4所示；突变体t2为在脲酶seqidno.2序列的第152位将氨基酸q(gln)替换为r(arg)，且在第153位将氨基酸e(glu)替换为g(gly)，且在第154位将氨基酸l(leu)替换为s(ser)；突变体t3为在脲酶seqidno.2序列的第452位将氨基酸t(thr)替换为k(lys)，且在第455位将氨基酸q(gln)替换为v(val)；突变体t4为在脲酶seqidno.2序列的第297位将氨基酸p(pro)替换为n(asn)，且在第298位将氨基酸w(trp)替换为y(tyr)；该突变体t4的氨基酸序列如seqidno.5所示，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.6所示；根据上述四个突变体(t1、t2、t3、t4)的突变位点信息，获得相应突变体编码基因的核苷酸序列，然后以含有seqidno.1所示dna的载体为模板，通过pcr定点突变方式获得相应突变体编码基因的dna分子，且经测序验证无误。二、工程菌的构建将突变体t1、t2、t3和t4的编码基因分别连接到表达载体pet28a多克隆位点处，分别获得重组表达载体z2、z3、z4和z5。将重组表达载体z2、z3、z4和z5分别转化大肠杆菌bl21(de3)，经pcr和测序鉴定，获得分别表达突变体t1、突变体t2、突变体t3和突变体t4的工程菌j2、j3、j4和j5。三、突变体的诱导、表达和分离提纯按照实施例1步骤三的方法进行。洗脱得到的蛋白(突变体t1、突变体t2、突变体t3和突变体t4)分别进行sds-page检测，结果证明各突变体与理论蛋白大小(63.8kd)相同，且通过分析可知各突变体分别占各自总蛋白的比例均高达99％，试剂盒检测洗脱得到的蛋白(突变体t1、突变体t2、突变体t3和突变体t4)溶液中蛋白浓度如表1所示。四、突变体的脲酶活性检测按照实施例1步骤四的方法进行。结果如表1所示。表1、各突变体的脲酶活性检测突变体蛋白浓度(mg/ml)脲酶酶活力(u/ml)比活力(u/mg)t10.17072.4425.7t20.1566.440.9t30.1413.625.6t40.16249.8307.5表1的结果显示，突变体t1的脲酶比活力是实施例1中脲酶和商品化的脲酶的10.2和11.9倍，突变体t2的脲酶比活力与实施例1中脲酶和商品化的脲酶相近，突变体t3的脲酶比活力明显低于实施例1中脲酶和商品化的ⅰ型脲酶。突变体t4的脲酶比活力是实施例1中脲酶和商品化的脲酶的7.3和8.6倍，上述结果表明，突变体t1和t4作为脲酶具有很好的市场应用价值。五、不同重金属离子对突变体的脲酶抑制实验按照实施例1步骤五的方法进行，结果如表2所示，该结果显示，脲酶突变体t1对重金属离子pb2+的抑制作用具有特异性好和灵敏度高的优点，半数抑制浓度最低，为20.12μg/l，且对其它重金属离子hg2+、cu2+、cd2+的抑制作用无效果；脲酶突变体t4对重金属离子cd2+的抑制作用具有特异性好和灵敏度高的优点，半数抑制浓度最低，为25.43μg/l，且对其它重金属离子hg2+、cu2+、pb2+的抑制作用无效果。表2、不同重金属离子对脲酶样品的半数抑制浓度(μg/l)pb2+hg2+cu2+cd2+突变体t120.12——————突变体t284.5639.2146.7159.78突变体t395.3256.4649.8778.15突变体t4——————25.43对照脲酶97.5466.2575.1286.77注：表中的“——”表示该重金属离子在10—60μg/l范围内对相应的脲酶无明显抑制作用。实施例3、脲酶突变体t1在检测海洋生物/食品中铅污染中的应用1、待测海洋食品的预处理取市场买来的待测海洋生物/食品—牡蛎，用水洗净晾干，取可食用部分，制成匀浆后，准确取2g于消化管中，加入5ml硝酸，进行微波消解：120℃升温5min，恒温5min；160℃升温5min，恒温10min；180℃升温5min，恒温10min；冷却后取出，于140℃～160℃赶酸至1ml左右，用水定容至10ml备用，即样品液。2、标准曲线的制作处理a：用1ml不同浓度梯度(10、20、30、40、50、60μg/l)的pb2+标准液分别溶解0.5g脲酶突变体t1；ck-1：用1ml去离子水溶解0.5g脲酶突变体t1；处理b：用1ml不同浓度梯度(10、20、30、40、50、60μg/l)的pb2+标准液分别溶解0.5g对照脲酶；ck-2：用1ml去离子水溶解0.5g脲酶突变体t1；将上述处理及对照分别在室温抑制20min后，作为待测样品分别按照实施例1步骤五的步骤2的方法进行操作，得到铅离子浓度c对脲酶突变体t1的抑制效应拟合方程xa：i＝0.105c2+0.328c+1.44(相关系数r2＝0.998)；以及得到铅离子浓度c对对照脲酶的抑制效应拟合方程xb：i＝0.005c2+0.008c+0.216(相关系数r2＝0.978)。3、样品液的检测取步骤1制备得到的样品液1ml溶解0.5g脲酶突变体t1(或对照脲酶)，在室温抑制20min后，作为待测样品分别按照实施例1步骤五的步骤2的方法进行操作，得到脲酶抑制率i，代入步骤2相应的拟合方程中，计算获得样品液中铅离子浓度，实验重复三次，以原子吸收光谱法检测结果为参照，结果如表3所示。表3、样品检测结果(μg/l)样品原子吸收法脲酶突变体t1对照脲酶135.2737.8920.18234.1636.6729.65334.9837.5926.32表3的结果表明，本申请获得的脲酶突变体t1与原子吸收光谱法检测铅的结果接近，且比对照脲酶的结果更准确。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。sequencelisting<110>山东时进检测服务有限公司<120>一种检测海洋食品中铅污染的方法<130>qh-cnp190286<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1743<212>dna<213>人工序列<400>1atgaagatcctgcgaaagatcatgtgtctgtcctggatctccgctatggtatgtatcatc60accccggaggtaggtgagggtgagaacggttcctccgctctgccgtcccagctgccgaag120aacgtagtattcaagaacggtaccatctacacctccaacgagaagcaggagatggctgag180gctatcgagatcaaggacggtaagatcaccttcgtaggttccaacaaggacgtagagaag240ctgatcaacaaggacaccaaggtaatcaacctgcaggaggctaagcgacagctgctgtcc300ccggacaaccataacccgggtttcgtagctcatatcttcggtgctggtaactgttccgta360tccccggaggctgctctgcaggagcagcgatcctacctgaacgcttgtaagaaggacgta420aaggacggtgagtggatctccggtaccggtcagcaggagctgttctccaacatgctggag480ctgaagtccgagaccccggacgagaagctgcaggtactggacgagctgttcccgaacaac540ccggtaatcatcatggagcgaacctcccattccgtatgggtaaactccaaggctctggag600ctggctggtatcaacaaggacaccaaggacccgcagggtggtcgaatcatccgagacccg660gagaccggtgagccgttcggtatcctgtacgacaccgctggtgacatcgtaatggagaag720gcttggaacgctcagccgaacctgttcgagaaggtaggtctggacgaggtaggtgctaag780aactacatcaccaccaacgagggtctgctgggtgacgacggtcgactgtactggaagcga840ggttggctggacgtatggaacaaggtaaacgacgaggtactggtaaccccgtggctgaac900aagtcccgatacaagctggtagagaaccgaccggctgagcagatcgagtacttccagaag960atcaagcgagacggtctgtcctcccgaatgctgatcaaccaggtaaagatgtactccgac1020ggtatctccatcaactccaccgctaagaccctggagaagtacaagttcgagtggttcaag1080ggtaccccgtacggtctgaactacatcccggaggagaagatggagctgttcaagtggaac1140tggctgaccaagctgggtgactccggtggttaccataccatcgtaatcggtgctcgagag1200tccctgaacgctatcgaggctgctaagaaggagggtgctaagcagccgtacaccatggta1260gagctgacccatgtagctggtgagtcccatctgtccgacatgaaccgattcgctgacgta1320gacttccaggtaggtcatgacttcaagccgctgaccgaccagcagatgcagtccggtgac1380ccgaagtcctgggctacctaccaggctgagcgaatcatgttcatctggaagaccggtgct1440aacgtatccctgtcctccgactgggacgtaaacgagctgaacccgctggtaaccatcaac1500gtacaggctgctgagaagtacgctgctaccatcaagctggacaacatcggtctgtcctcc1560gacccggctaaggcttccatcctgggtctggacaagatcaccggttccatcgaggtaggt1620aagtccgctgacatcgtaatcctgaacgaggacatcaccaagatgtccgtagacaagatc1680ccgtccgtaaaggtactgatgaccgtactgcagggtgaggtagtataccataagggtgag1740taa1743<210>2<211>580<212>prt<213>人工序列<400>2metlysileleuarglysilemetcysleusertrpileseralamet151015valcysileilethrprogluvalglygluglygluasnglyserser202530alaleuproserglnleuprolysasnvalvalphelysasnglythr354045iletyrthrserasnglulysglnglumetalaglualailegluile505560lysaspglylysilethrphevalglyserasnlysaspvalglulys65707580leuileasnlysaspthrlysvalileasnleuglnglualalysarg859095glnleuleuserproaspasnhisasnproglypheval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