用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜及其方法和系统与流程

本发明属于拉曼光谱检测技术领域，尤其是涉及一种用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜及其方法和系统。

背景技术：

细菌感染是临床中最为常见的疾病，是威胁人类身体健康的重要因素。在治疗时需要首先对细菌种类进行鉴定分析，然后再进行抗生素的药敏试验，以帮助医生选择抗生素的种类和剂量。另外，国内对抗生素的滥用也导致病原微生物的耐药性越来越强，这就需要对多变的病原菌进行及时鉴定分类。传统的病原菌鉴定方法依赖于表型鉴定，主要采用染色法、培养法和简单的生化检验。传统检测方法适用于体外培养的生物体，一些菌株表现出不符合已知种属模式的独特的生化特性。对此，许多现代方法如pcr技术、dna阵列芯片、免疫学、脂肪酸分析、代谢物分析等手段不依赖于活的培养物，可以分辨出传统方法所检测不到的有机体之间的细微差别。

然而，以上这些检测方法的检测周期较长，其原因主要是因为病原菌体的个体数量较少，需要对样本进行体外培养扩增后再进行鉴定，根据病原菌的种类不同，其培养周期从两天至五天，这就导致对疾病的判定时间大大延长，不利于患者治疗，甚至延误最佳治疗时间窗。虽然目前一些自动化检测仪器可以在一定程度上提高病原菌的鉴定准确定和效率，但是它们还只适用于可以体外培养的常见病原体，还需要较长时间的体外培养周期。另外，对于一些医疗条件较差的地区，不具备微生物培养的设备和昂贵的自动化检测设备，无法进行病原菌体的精确鉴定检测。因此，急需一种低成本、可靠、快速鉴定的检测方法，以满足便携、快速、高灵敏度的检测需求。

拉曼光谱分析技术具有的分子指纹图谱特性，不仅可以实现物质的定性与定量分析，还可以进行物质官能团及分子结构分析，在物质鉴定、分子结构研究、化工过程、医学医药、生物化学、考古及宝石鉴定、公安与法学样品分析、反恐技术、食品安全、地质及环境科学等各个领域都具有广泛应用。更为重要的是，拉曼光谱技术是一种无损、无标记的检测技术。其中，表面增强拉曼光谱分析技术(sers)是基于金属纳米材料表面的纳米光电场耦合增强效应的一种拉曼光谱技术，sers技术具有超高灵敏度检测水平，是痕量物质检测的有力分析方法，其检测灵敏度可达单分子水平。目前，拉曼光谱技术已经应用在细菌鉴定分析方面，比如专利cn109266717a中提及了一种基于单细胞分析检测的细菌检测方法，主要采用普通拉曼光谱来鉴别病原菌的种类；该方法由于只采用普通拉曼光谱技术，只采集单细胞整体拉曼信号，不利于病原菌体亚型的鉴定。专利cn107586823a提及了一种基于基于sers技术的病原菌检测方法，主要采用将贵金属纳米金属颗粒与病原体混合干燥后，利用便携式拉曼检测仪对病原菌进行检测；该方法检测时病原菌在干燥的过程中会导致菌体发生生化信息的变化，这将导致鉴定的准确性和可靠性大大降低。专利cn109060757a提及一种基于滤纸的sers技术，将贵金属纳米粒子溶液在滤纸上干燥形成sres基底，然后将病原菌溶液滴加在sers滤纸基底上；该方法也存在病原菌在干燥过程中发生不可逆变化的问题。专利cn104458694a提出了一种由不同形貌纳米粒子所组装而成的sers基底，其检测过程也采用干燥后检测的模式，也存在病原菌变性的问题。

在以上这些方法中，细菌附着于二维sers基底表面，其拉曼信息主要来自sers基底与细菌的接触面。由于细菌的鉴定主要依据其表面特定蛋白分子信号，而这些分布于细菌表面的特定蛋白分子与sers基底的接触则存在一定的概率，因此这种基于二维sres基底的细菌鉴定形式的成功率和准确度较低；另外，由于sers基底的制备方式不适于发规模生产，这些方法也不利于实际市场推广应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，以克服现有技术的缺陷，在聚合物材料层上增设若干漏斗状的通孔，检测过程中，病原菌体与通孔(也即聚合物材料层)的接触面积大，可以间接提高检测的灵敏度。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，包括聚合物材料层；所述聚合物材料层上设有若干漏斗状的通孔，且聚合物材料层和若干漏斗状的通孔表面均设有拉曼增强材料层。

优选的，所述聚合物材料层的材质为pmma、ps、pc、pe、pdms或pegma。

优选的，所述拉曼增强材料层的材质为贵金属纳米粒子；优选的，所述拉曼增强材料层的材质为纳米金和/或纳米银。

优选的，所述聚合物材料层的厚度为5-30μm；漏斗状的通孔上开口尺寸为3-30μm；下开口尺寸小于病原菌体的尺寸，为0.2-3μm。

优选的，若干漏斗状的通孔在聚合物材料层上按照尺寸大小分区域设置，属于同一区域的漏斗状的通孔的尺寸相同。

优选的，若干漏斗状的通孔在聚合物材料层上阵列分布；所述聚合物材料层的材质为pegma。

本发明的另一目的在于提出一种包含有如上所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，以应用该三维拉曼增强膜对病原菌体进行鉴定。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种包含有如上所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，还包括自上而下依次设置的样本池、支撑结构和废液池；所述三维拉曼增强膜设在样本池与支撑结构之间，且三维拉曼增强膜通过若干漏斗状的通孔与样本池和废液池连通；所述样本池顶部敞开，其上方设有拉曼探头；废液池上设有出液口，出液口可与负压装置连通。

进一步的，所述样本池下表面与三维拉曼增强膜的上表面之间、三维拉曼增强膜与支撑结构的上表面之间、支撑结构的下表面与废液池的上表面之间均紧密贴合且固定连接。

进一步的，所述支撑结构为设在三维拉曼增强膜下表面边缘的单面氧化硅片。

进一步的，所述支撑结构内侧成上小下大的圆台或棱台状，或者为圆柱或棱柱状，且支撑结构内侧与废液池共同构成废液腔；负压装置为小型负压泵或简易的注射器。

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，其工作原理如下：

当施加一个适当负压时，病原菌液体开始流过三维拉曼增强膜，溶液中的水从漏斗下开口流出，当有病原菌体落入到微米漏斗(也即漏斗状的通孔)中时，由于漏斗下开口尺寸小于病原菌体的尺寸，此时病原菌体被卡到漏斗下开口处，同时该处漏斗不再有液体流出；通过调整病原菌体的浓度，使病原菌体的数量稍低于阵列化三维拉曼增强微米漏斗的数量，以保证每一个病原菌体都能落入到一个三维拉曼增强微米漏斗中。然后，在继续保持负压的情况下，病原菌体与三维拉曼增强微米漏斗的接触面积大大增加，此时用便携式拉曼探头或者手持式拉曼探头对阵列化三维拉曼增强膜一次进行数据采集，完成对病原菌体的鉴定。

本发明还涉及一种用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的制备方法，主要是用来制备如上所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，该方法可以满足大规模生产三维拉曼增强膜的需求。

一种用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用纳米压印技术制备含有若干漏斗状的通孔的聚合物材料层；

(2)选用单面氧化硅片，依次经甩胶、光刻、刻蚀、去胶、干法刻蚀或湿法刻蚀、去保护层程序，制备支撑结构；

(3)在支撑结构表面旋涂或喷涂一层1至20μm的醇溶性聚合物，该聚合物可以是醇溶性树脂、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙基苯酚等及其它相似聚合物；

(4)将含有若干漏斗状的通孔的聚合物材料层浸入到乙醇中，将其捞出后平铺在支撑结构表面，并在20-80℃下进行干燥；

(5)将步骤(4)中得到的总体结构浸入到hf溶液中1-5min去除支撑窗口处的支撑膜，然后再将其浸入到乙醇中1-10min去除支撑窗口处的醇溶性聚合物；

(6)将步骤(5)处理后的结构用氧等离子体处理2-10min，浸入到5wt％aptes的乙醇溶液中反应15-30min，然后再浸入到拉曼增强材料溶液中反应2-8h，并用清水冲洗干净，即可得到三维拉曼增强膜。

相对于现有技术，本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜具有以下优势：

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，其漏斗形腔体(也即漏斗状的通孔)使得落在其中的病原菌体与腔体四周的接触面积大大增加，从而得到更多有关病原菌体拉曼信息，进而提高病原菌的鉴定准确度。此外，当聚合物材料层上的若干漏斗状的通孔，按照尺寸大小分区设置时，可实现多种病原菌的鉴定检测。

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的制备方法，采用连续纳米压印技术，可实现三维漏斗形拉曼增强膜的大规模制备。

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，可实现病原菌单细胞捕捉快速固定与拉曼检测。

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，可实现多种病原菌的鉴定检测。

附图说明

图1为本发明实施例所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的纵剖简单剖视示意图；

图2为本发明其中一个实施例(若干漏斗状的通孔未按尺寸大小分区域设置，通孔尺寸均一)所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的俯视图；

图3为本发明其中一个实施例(若干漏斗状的通孔按尺寸大小分区域设置)所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的俯视图；

图4为本发明实施例所述的含有用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统的简单结构示意图；

图5为本发明实施例所述的含有用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统中支撑结构的制备流程图；

图6为本发明实施例所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜中聚合物材料层的制备流程图；

图7为本发明实施例所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的制备流程图。

附图标记：

1-三维拉曼增强膜；101-聚合物材料层；102-漏斗状的通孔；103-拉曼增强材料层；4-样本池；5-支撑结构；6-废液池；601-出液口；7-拉曼探头；8-拉曼检测仪；9-病原菌体。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

一、用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜

如图1所示，用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，包括聚合物材料层101，该聚合物材料层101上阵列分布有若干漏斗状的通孔102，该漏斗状的通孔102也可以被称之为式漏斗腔。每一个漏斗状的通孔102都可以是上大下小的圆台状或棱台状，其上开口尺寸为5至30μm，下开口尺寸为0.2至3μm。优选的，每一个漏斗状的通孔102都可以是上大下小的棱台状或圆台状，进一步优选为圆台状。整个聚合物材料层101的厚度为5至30μm，材质可以选择pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、ps(聚苯乙烯)、pc(聚碳酸酯)、pe(聚乙烯)、pdms(聚二甲基硅氧烷)或pegma(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)等及其它种类的纳米压印胶，但优先选择pegma(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)。在聚合物材料层101和若干漏斗状的通孔102表面均设有拉曼增强材料层103，该拉曼增强材料层103的材质可以选择纳米金和/或纳米银等贵金属纳米粒子。

作为本发明一个优选的实施例，如图2所示，若干漏斗状的通孔102的数量为100个，且成10×10的阵列分布；每一个漏斗状的通孔102都可以是上大下小的圆台状，其上开口尺寸为20μm，下开口尺寸为0.5μm。整个聚合物材料层101的厚度为15μm。该拉曼增强材料层103的材质选择纳米金。

作为本发明另一个优选的实施例，若干漏斗状的通孔102在聚合物材料层101上还可以按照尺寸大小分区域设置，属于同一区域的多个漏斗状的通孔的尺寸相同。根据检测鉴定和产业规模的需求，区域的设置数量可以有多个，每个区域内的漏洞状的通孔的数量可以是相同的，也可以是不同的。如图2所示，比如如图3所示，若干漏斗状的通孔102的数量为100个(均为圆台状)，且成10×10的阵列分布，可以将其分为4个区域，分别是左上角区域、右上角区域、左下角区域、右下角区域，这四个区域的漏斗状的通孔数量可以是均分的，也可以根据需要，数量有多又少，但是四个区域的漏斗状的通孔的尺寸可以是左上角区域、右上角区域、左下角区域、右下角区域依次减小，比如：左上角区域的漏斗状通孔的尺寸为上开口30μm，下开口3μm；右上角区域的漏斗状通孔的尺寸为20μm，下开口2μm；左下角区域的漏斗状通孔的尺寸为10μm，下开口1μm；右下角区域的漏斗状通孔的尺寸为5μm，下开口0.5μm。或者，四个区域的漏斗状的通孔的尺寸还可以采用其他形式的孔径分布，只要保证每个区域的漏斗状的通孔的尺寸不一致就可以，这样就可以用于产业化的病原菌体检测，采用一张三维拉曼增强膜即可检测鉴定四种不同类型和尺寸的病原菌体。

二、用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统

如图4所示，一种用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的分析检测系统，其包括上述用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜1，三维拉曼增强膜1上方设有样本池4，样本池4本身为一个只有周壁的壳体，其顶部敞开，上方设有拉曼探头7。样本池4以三维拉曼增强膜1为其底部，且其下表面边缘部分与三维拉曼增强膜1紧密贴合连接，以防止液体泄漏。三维拉曼增强膜1下方设有支撑结构5，支撑结构5上表面边缘与三维拉曼增强膜1下表面的边缘紧密贴合固定。支撑结构5本身形状类似筒状，其与设在其下方的废液池6共同构成废液腔。废液池6通过三维拉曼增强膜上的若干漏斗状的通孔102与样本池4连通。需要说明的是，支撑结构5的下表面与废液池6的上表面之间也紧密贴合且固定连接，废液池6上设有出液口(未画出来)，出液口可用来外接一个负压装置。

作为本发明一个优选的实施例，支撑结构5为粘接在三维拉曼增强膜1下表面边缘的单面氧化硅片，其厚度在2至10μm之间。

作为本发明一个优选的实施例，样本池4下表面与三维拉曼增强膜1的上表面之间、三维拉曼增强膜1与支撑结构5的上表面之间、支撑结构5的下表面与废液池6的上表面之间均通过粘接胶紧密贴合且固定连接。

作为本发明一个优选的实施例，所述支撑结构5内侧成上小下大的圆台或棱台状，或者为圆柱或棱柱状；负压装置可以是小型负压泵，也可以是接一个简易的注射器，用来在检测过程中为废液池、样本池等提供负压环境。进一步优选的，支撑结构5内侧成上小下大的圆台状，负压装置采用小型负压泵。

使用时，将拉曼探头7连接现有的拉曼检测仪8上，当施加一个适当负压时，病原菌液体开始流过三维拉曼增强膜1，溶液中的水从漏斗状的通孔102流出，当有病原菌体9落入到微米漏斗(也即漏斗状的通孔102)中时，由于漏斗状的通孔102下开口尺寸小于病原菌体9的尺寸，此时病原菌体9被卡到漏斗状的通孔102下开口处，同时该处漏斗状的通孔102不再有液体流出；通过调整病原菌体9的浓度，使病原菌体9的数量稍低于阵列化三维拉曼增强微米漏斗(漏斗状的通孔102)的数量，以保证每一个病原菌体9都能落入到一个三维拉曼增强微米漏斗(漏斗状的通孔102)中。然后，在继续保持负压的情况下，病原菌体9与三维拉曼增强微米漏斗(漏斗状的通孔102)的接触面积大大增加，此时用便携式拉曼探头7或者手持式拉曼探头7对阵列化三维拉曼增强膜一次进行数据采集，完成对病原菌体9的鉴定。

三、用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜、支撑结构等的制备方法

如图5-7所示，用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜的方法，包括以下步骤：

(1)采用纳米压印技术制备含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101；

(2)选用单面氧化硅片，依次经甩胶、光刻、刻蚀、去胶、干法刻蚀或湿法刻蚀、去保护层程序，制备支撑结构5；

(3)在支撑结构5表面旋涂或喷涂一层1-20μm(优选为10μm)的醇溶性聚合物，该聚合物可以是醇溶性树脂、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙基苯酚等及其它相似聚合物，优选为醇溶性树脂，比如热塑性酚醛树脂。

(4)将含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101浸入到乙醇中，将其捞出后平铺在支撑结构5表面，并在20-80℃下进行干燥；

(5)将步骤(4)中得到的总体结构浸入到hf溶液中1-5min去除支撑窗口(也即漏斗状的通孔所在的位置)处的支撑膜，然后再将其浸入到乙醇中1-10min去除支撑窗口处的醇溶性聚合物；

(6)将步骤(5)处理后的结构用氧等离子体处理2-10min，浸入到5wt％aptes的乙醇溶液中反应15-30min，然后再浸入到拉曼增强材料溶液中反应2-8h，并用清水冲洗干净，即可得到三维拉曼增强膜。

其中，步骤(1)中，如图5所示，采用纳米压印技术制备含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101的方法为：在基底上涂布压印聚合物，然后用下表面带有漏斗状筒体的压印模板对压印聚合物进行按压，之后一次脱模，去掉压印模板，再去掉压印聚合物上与漏斗状筒体相对应位置的残胶，形成漏斗状通孔，最后脱模后即为含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101。这里，需要说明的是：

a、压印模板可以为自制pdms模板，或者为商品化定制产品，其材料为镍膜或者其它可以实现类似功能的材料。压印聚合物和基底也为商品化产品，压印聚合物材料可以为pmma，ps、pc、pe、pdms、pegma等及其它种类的纳米压印胶。基底材料为pet、pp、ptfe等材料。优选地，以具有良好生物相容性的pegma为压印聚合物材料，基底材料为pet。

b、采用热压或者紫外压印方式进行纳米压印；可采用平面对平面、卷对平面、卷对卷的方式进行纳米压印。优选地，选择卷对卷纳米压印机进行压印复制，选择镍模板作为压印模板。

c、为了保证连续纳米压印的稳定性，需要首先对压印模板进行表面化学修饰，即先将压印模板在120℃浓硫酸和双氧水按质量比2:1混合的混合液中清洗液处理20min。

d、然后再将经步骤c处理后的压印模板放入氨水洗液(以质量比计，氨水：双氧水：水＝1：1：5)中处理20min。

e、之后将经步骤d处理后的压印模板放入还有1mm的全氟癸基三氯硅烷的异辛烷溶液中反应30分进行疏水化处理。

f、将化学修饰后的压印模板固定在压印卷棍表面。

g、将1g2-羟基-2-甲基苯丙酮与100gpegma混合得到紫外光敏胶，选择波长为365nm的紫外固化光源，压印速度为1～10mm/s。

h、由于纳米压印存在残胶，需要采用离子刻蚀、等离子体刻蚀来去漏斗下部残余胶去除，最后形成开口形态。

i、将以上去残胶后的三维微米漏斗膜(也即含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101)从基底材料上剥离下来，得到大面积三维微米漏斗膜，也即含有若干漏斗状的通孔102的聚合物材料层101。

步骤(2)中，支撑结构的制备方法，具体来说，如图6所示，包括以下步骤：

1)选用单面氧化硅片，氧化硅层厚度为2-10μm(优选为6μm)，在非氧化面蒸发一层50至200nm(优选为100nm)的金属cr；

2)旋涂2至10μm厚的光刻胶az4620；

3)进行紫外光刻，并用2.5wt％的tmah(四甲基氢氧化铵)进行显影；

4)放入cr腐蚀液(主要成分为硝酸铈铵和硝酸，比如可以采用美国transene公司铬腐蚀液ce-8001-n)中将显影图形转移到cr层；

5)放入丙酮中去除光刻胶层；

6)放入25wt％的tmah(四甲基氢氧化铵)溶液中，在50-70℃(优选为60℃)下进行腐蚀1-3h(优选为2h)直至腐蚀到氧化硅层，然后再放入cr腐蚀液中去除cr层(也即保护层)，得到支撑结构5；

7)或者，将步骤5)后得到的基底在六氟化硫和氧气的混合气体下进行深硅刻蚀，直至刻蚀到氧化硅层，然后再放入cr腐蚀液中去除cr层(也即保护层)，得到支撑结构。

作为本发明一个优选的实施例，步骤(5)中，hf溶液中hf的质量浓度优选为10％，浸渍时间优选为3min。

作为本发明另一个优选的实施例，步骤(6)中，将步骤(5)处理后的结构用氧等离子体处理5min，浸入到5wt％aptes的乙醇溶液中反应20min，然后再浸入到贵金属纳米粒子比如20至100nm(优选为60nm)的纳米金和纳米银溶液中反应5h，并用清水冲洗干净，即可得到三维拉曼增强膜。

本发明所述的用于细菌快速鉴定的三维拉曼增强膜，其漏斗形腔体(也即漏斗状的通孔)使得落在其中的病原菌体与腔体四周的接触面积大大增加，从而得到更多有关病原菌体拉曼信息，进而提高病原菌的鉴定准确度。同时，由于采用了生产级纳米压印的制备方法，可大规模制备三维拉曼增强膜，使该方法具有较高的市场价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。