一种高产高光学纯度乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种微生物新亚种及其应用，具体涉及高产高光学纯度乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种及其应用。

背景技术：

乳酸(lacticacid，la)是世界三大有机酸(乳酸、乙酸和柠檬酸)之一，且已被美国食品和药品管理局认定为“公认安全物质(gras)”。近年来，随着人们环保意识的不断提升，以聚乳酸为代表的生物可降解塑料的需求急剧增加，而高光学纯乳酸单体是合成聚乳酸的前体物质。乳酸是一种重要的可降解、无污染的化工原料，其在医药、食品、石油化工等领域有着广泛的用途，具有重要的经济价值。因此便捷、高效的乳酸合成或制备方法成为当前的重要研究方向，同时技术上的突破也具有较广阔的实用价值和前景。

乳酸学名2-羟丙酸，因分子中含有一个不对称碳原子，形成右旋、左旋两种旋光异构体，将右旋乳酸简称d-乳酸、左旋乳酸简称l-乳酸。

乳酸的另一个重要应用是生产环保生物材料聚乳酸。聚乳酸是一种聚酯类材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且安全无毒。根据合成聚乳酸单体的不同，可以将聚乳酸分为聚d乳酸(pdla)、聚l乳酸(plla)和聚dl乳酸(pdlla)。近年来，随着人们环保意识的不断提高和化石资源的耗竭，以乳酸为原料的高分子聚合物的研究已经成为当今社会普遍关注的研究热点与重点。美国和日本等一些国家已经开始用聚乳酸生产绿色包装材料(如垃圾袋、包装纸和饮料罐等)，并投入市场使用。此外，还有一些地区用聚乳酸材料代替传统的聚乙烯农用地膜，不仅解决了传统地膜易破、透明度差的问题，还避免了白色污染对土壤的破坏。预计到2020年，全球乳酸和聚乳酸的需求量将分别达到1960和1205万吨。

目前全球乳酸的产能不足且价格较高，进而导致聚乳酸的生产成本居高不下，很难在价格上与传统的聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯材料相竞争。系统研究乳酸生产菌株的代谢机理，进而选育出能够利用廉价原料高效生产高光学纯度和化学纯度乳酸的生产菌种，以降低发酵法生产乳酸的成本，这对于扩大乳酸的应用范围和聚乳酸材料的推广以及环境保护都具有非常重要的意义。目前d-乳酸的制备较为复杂、且成本较高，d-乳酸的制备技术或方法成为影响乳酸相关产业发展的瓶颈，因此研究或发展一种低成本、高效、便捷的d-乳酸生产或制备技术成为该领域的重大课题，探寻高产率、高光学纯度的产d-乳酸的菌株成为极有意义及价值的研究方向。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是，d-乳酸单体的光学纯度越高，制备出的聚d-乳酸性能越好，并且效率更高。而现有技术中产高光学纯度d-乳酸的微生物菌株比较缺乏，生产的d-乳酸单体普遍光学纯度只有99.7％以下。为了解决该技术问题，本发明提供一种能够高产高光学纯度d-乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种(sporolactobacilluslaevolacticussubsp.hainanensis)。

一种高产高光学纯度乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，保藏日期是2019年2月27日，保藏编号为cgmccno.17270。

本发明提供了一种d-乳酸单体，采用本发明的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株通过发酵而获得。

本发明还提供了一种聚乳酸制品，采用本发明的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株发酵产生的d-乳酸单体聚合制成。

本发明还涉及本发明的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株在制备d-乳酸单体中的应用。

本发明还涉及本发明的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株在制备含有d-乳酸单体聚合成的聚乳酸的制品中的应用。

所述聚乳酸制品是手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。

所述聚乳酸制品还可以是生物塑料制品。

本发明的高产高光学纯度乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种通过如下方法分离筛选得到：将土壤样品加入gyp液体培养基中，经厌氧培养后，涂布于gyp琼脂培养基上，挑取有透明圈的菌落并经3次纯化，最终分离到一株高产高光学纯度d-乳酸的菌株，即左旋芽孢乳杆菌海南亚种la10菌株(sporolactobacilluslaevolacticussubsp.hainanensisla10)，并与模式菌株左旋芽孢乳杆菌jcm2513进行鉴定区分。

利用本发明提供的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株的gyp液体培养基成分易得且廉价，厌氧培养有效避免杂菌污染，减小生产染菌事故发生概率，其发酵周期短、产率高且稳定，所制备的乳酸具有低成本、高效率、高产率和高光学纯度等优点，本发明提供的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株la10所产d-乳酸的光学纯度高达99.9％，用其可以制备各种需要d-乳酸作为原料的聚乳酸制品，例如应用于医药方面的手术缝合线，药物控释制剂和骨折内固定材料或者生物塑料原料或具有耐热性的高强度sc-pla制品。

附图说明

图1：a和b分别是实施例1中的jcm2513和la10菌株的菌落外观形态图；

图2：a和b分别是实施例1中的jcm2513和la10菌株的显微形态图(×100放大倍数)；

图3：a和b分别是实施例1中的jcm2513和la10菌株革兰氏染色结果的显微镜照片图(×100放大倍数)。

图4：是实施例1中16srrnapcr扩增电泳检测图。

图5：是实施例1中pcr产物电泳检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明一种高产高光学纯度乳酸的左旋芽孢乳杆菌海南亚种及其筛选方法和应用作进一步的详细说明。

本发明实施例中所用到的仪器型号参数说明如下：

显微镜：生物显微镜cx41rf，olympus(奥林巴斯)；

培养箱：生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；

离心机：thermoscientificsorvalllegendmicro21r，thermo赛默飞世尔科技有限公司；

pcr仪：arktik多功能pcr仪，thermo赛默飞世尔科技有限公司；

电泳仪：dyy-11核酸电泳仪，北京六一仪器厂；

生物电泳图像分析系统：fr-980a，上海复日科技有限公司；

荧光计核酸定量仪：2.0，lifetechnologies；

高压液相色谱仪：岛津hplc-20ad；检测器：rid示差检测器和紫外检测器；色谱柱：tosohtskgel-oapakp+oapaka(7.8φ×300mm)和sumichiraloa-5000(4.6φ×150mm)/chirex3126(d)-penicillamine(替代品)；

本发明实施例中所用到的试剂说明如下：

mrs肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司出售)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801ml，ph值6.2±0.1，蒸馏水1000ml。

mrs琼脂培养基：mrs肉汤培养基基础48g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。

gyp液体培养基：葡萄糖10g，酵母浸粉10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾0.25g，磷酸氢二钾0.25g，盐溶液10ml，碳酸钙5g，蒸馏水990ml，ph6.8；所述盐溶液的配方为：七水硫酸镁400mg，无水硫酸锰20mg，七水硫酸亚铁20mg，氯化钠20mg，蒸馏水10ml。

gyp琼脂培养基：gyp液体培养基基础30.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

发酵用培养基：日水制药株式会社code05801培养基39.6g+5g碳酸钙(天津市光复科技发展有限公司出售)+蒸馏水1000ml，121℃灭菌15min。

apla50chl简易培养基：多胨10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801ml，溴甲酚酯0.17g，蒸馏水1000ml。

apl50ch碳水化合物鉴定试剂条：含阴性对照及以下49种碳水化合物：d-核糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、l-山梨糖、l-鼠李糖、甘露醇、山梨醇、n-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、水杨苷、d-麦芽糖、d-蔗糖、葡萄糖酸钾、甘露醇、赤藻糖醇、d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、l-木糖、d-侧金盏花醇1、甲基-βd吡喃木糖苷、卫茅醇、肌醇、甲基-ad吡喃甘露糖苷、甲基-ad吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷、d-纤维二糖、d-乳糖、d-蜜二糖、d-海藻糖、菊粉、d-松三糖、d-棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、d-龙胆二糖、d-土伦糖、d-来苏糖、d-塔格糖、d-岩藻糖、l-岩藻糖、d-阿拉伯醇、l-阿拉伯醇、2-酮基葡萄糖酸钾及5-酮基葡萄糖酸钾。

细菌基因组dna快速抽提试剂盒：上海生工工程有限公司；

细菌16srdna通用引物：f，5’agagtttgatcctggctcag3’，r，5’acggctaccttgttacgactt3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株la10的鉴定

(1)本发明的左旋芽孢乳杆菌海南亚种菌株的分离筛选过程

随机取0.25g海南地区的土壤样品加入含5mlgyp液体培养基的试管中，加入厌氧产气袋于30℃培养3d后，充分振荡均匀；第一次纯化取20μl涂布于gyp琼脂培养基上，然后置厌氧条件下于30℃培养2d；第二次纯化从第一次纯化后的菌落中挑取有透明圈的菌落划线纯化，然后置厌氧条件下于30℃培养24h，挑取有透明圈的菌落镜检，杆状菌进行第三次纯化；第三次纯化挑取少量菌体加入8.5％生理盐水中，充分混匀，取20μl涂布于gyp琼脂培养基上，然后置厌氧条件下30℃培养3d，挑取有透明圈的菌落接种于gyp琼脂培养基上，30℃厌氧培养2d；最终分离到一株产高光学纯度d-乳酸的菌株，即左旋芽孢乳杆菌海南亚种la10菌株(sporolactobacilluslaevolacticussubsp.hainanensisla10)。

(2)菌株la10和模式菌株jcm2513的产乳酸的产量、光学纯度及旋光性实验

实验方法：采用高效液相色谱法测定d-乳酸的含量和光学纯度。

d-乳酸含量测定色谱条件：

分析柱：tosohtskgel-oapakp+oapaka(7.8φ×300mm)；流动相：0.75mmh2so4水溶液；流速：0.8ml/min；进样量：10μl；柱温：40℃；检测器：rid示差折射检测器；定量方法：外标法；

d-乳酸光学纯度测定色谱条件：

色谱柱：sumichiraloa-5000(4.6φ×150mm)/chirex3126(d)-penicillamine(替代品)；柱温：40℃；检测器：紫外检测器；波长：254nm；流动相：1mmol/lcuso4水溶液；分析流速：1.0ml/min；进样量：5μl；分析方法：面积百分率法；检出时间：l-乳酸18min、d-乳酸22min。

分析步骤：将菌株la10和模式菌株jcm2513新鲜培养物接种于装有发酵用培养基的2l发酵罐中，35℃厌氧培养48h，当菌体呈细杆状，菌量多，且残糖量低于1g/l时，结束发酵。将发酵液在12000r/min下离心5min，取1ml发酵液进行10倍稀释并通过0.45μm滤膜后装入样品瓶中，进样量10μl，进样时间30min。使用标准曲线法，根据已建立的标准曲线积分计算出待测样品中d-乳酸的含量。

实验结果：在2l发酵罐中，模式菌株jcm2513在48h结束发酵，其d-乳酸含量为9.65％，光学纯度为99.7％；菌株la10在38h结束发酵，其d-乳酸含量为9.85％，光学纯度为99.9％。由此可知，菌株la10产d-乳酸产率和光学纯度均高于模式菌株jcm2513，且其光学纯度达到了工业生产聚乳酸的要求。

表1乳酸产量、光学纯度及旋光性实验结果

(3)菌株la10和模式菌株jcm2513的形态及对碳水化合物的发酵实验

实验方法：

形态特征观察：将试验菌株分别采用三区划线法接种于mrs琼脂培养基，烛缸法35℃培养48h后肉眼观察菌落形态。用灭菌接种环挑取单个菌落，涂于滴有生理盐水的载玻片上，显微镜下观察有无动力。涂片风干后火焰固定，革兰氏染色观察细菌形态。

催化试验：待测菌株置微好氧条件下于37℃培养24h，取1ml3％双氧水加入试管中，3min内有气泡产生的为催化酶阳性，无气泡产生的为催化酶阴性，若菌株没有生长，将菌株置厌氧条件下在37℃培养24h，菌落生长为催化酶阴性。

碳水化合物发酵实验：用api50ch碳水化合物鉴定试剂条进行实验，包括阴性对照及49种碳水化合物。按照说明书制备相当于2个麦氏浊度的菌悬液，将菌悬液加到试剂条上的50个管中，用无菌液体石蜡封管，35℃培养24h及48h各观察1次结果。试剂条变为黄色为阳性反应，变为绿色为弱阳性反应，不变色为阴性反应。

实验结果：

形态观察：菌株la10和模式菌株jcm2513的菌落呈短杆状，有动力，少数呈短链状排列，革兰氏染色阳性。菌株la10和模式菌株jcm2513在形态上无明显差异。

催化试验：菌株la10和模式菌株jcm2513催化试验中试管均无气泡，可知菌株la10和模式菌株jcm2513催化试验为阴性。

碳水化合物发酵实验结果(35℃培养48h)：菌株la10和模式菌株jcm2513对50种碳水化合物的发酵利用中有14种出现差异。14种碳水化合物中，菌株la10不能利用l-阿拉伯糖、核糖、山梨醇、苦杏仁甙、熊果甙、七夜灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、拢牛儿糖和葡萄糖酸盐，只能利用半乳糖；而模式菌株jcm2513正好相反，可见菌株la10和模式菌株jcm2513在碳水化合物的利用方面表现出较大差异。

表2碳水化合物发酵实验结果(注：+：阳性结果；-：阴性结果)

(4)16srrna基因序列测定

基因组dna的提取：采用细菌基因组dna快速抽提试剂盒提取菌株dna。

16srrnapcr扩增：通用引物f：agagtttgatcctggctcag，r：acggctaccttgttacgactt。并进行16srrna序列的pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳，检测电压200v，电泳时间30min；点样顺序：jcm2513，la10，阳性对照(+)，marker，结果如图4。

样品的拼接与blast比对：将上述约1500bp左右的条带切胶回收，采用sanger法测序。

16srrna基因序列结果：经样品的拼接和blast比对得知，模式菌株jcm2513和菌株la10与芽孢乳杆菌属菌株的16srrna的序列相似性达到99％以上。因此，可将菌株la10鉴定为芽孢乳杆菌属。

(5)基于全基因组的重测序分析

全基因组重测序实验：采用质检合格的基因组dna样品用于测序文库的构建，其中包括基因组dna片段化、使用nebultra^tmdnalibraryprepkitfor建库试剂盒建库方法建库(dna片段末端修复、连接接头、磁珠分选纯化连接产物、文库扩增和扩增产物磁珠纯化)；然后对文库进行质量控制：通过2％琼脂糖凝胶电泳检测文库大小。建库完成的文库pcr产物取4μl进行电泳检测，点样顺序依次为：jcm2513、la10、marker，结果如图5，为了得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据，必须对构建好的文库进行准确的浓度测定，使用2.0进行文库浓度测定，使用agilenttechnologies2100dna1000kit进行文库长度分布检测。

全基因组重测序实验结果：

g+c含量测定结果：模式菌株jcm2513g+c含量为43.67％，菌株la10的g+c含量为44.00％，参考模式菌株dsm442的g+c为42.70％，模式菌株jcm2513与参考模式菌株dsm442的g+c含量相差0.97％，菌株la10与参考模式菌株dsm442的g+c含量相差1.30％，可验证菌株la10、模式菌株jcm2513和参考模式菌株dsm442属于同一个种。此外，模式菌株jcm2513和菌株la10的g+c含量在芽孢乳杆菌属的g+c含量(38％-46％)范围之内。

表3g+c含量分析结果

ani分析结果：菌株la10的同源基因与模式菌株的同源基因基于全基因组的ani分析的ani值为97.2379％，模式菌株jcm2513的同源基因与参考模式菌株dsm442的同源基因基于全基因组的ani分析的ani值为99.995％(通常ani值大于95％-96％的菌株属于同一个种)，因此，可将la10确定为左旋芽孢乳杆菌(sporolactobacilluslaevolacticus)。

表4ani分析结果

indel和snp突变结果：首先使用gatkhaplotypecaller对单个样本的比对结果进行突变声明；随后使用gatkgenotypegvcfs对结果进行合并和质控，以提高突变声明质量，降低发生错误的概率；然后使用snpeff和gatkvariantannotator等工具，根据sporolactobacilluslaevolacticusdsm442参考基因组及其注释信息，对突变进行注释。

2981个indel突变位点中，只有一个突变位点(378)来自于模式菌株jcm2513；2976个突变位点来自于la10；两个突变位点来自于菌株la10和模式菌株jcm2513，其中997号位点是编码trna基因，2916号位点是编码蛋白基因位点。

64306个snp突变位点中，有15459个突变位点通过突变质量验证，可认为此位点100％发生snp突变。在15459个snp突变位点中，14个来自于模式菌株jcm2513，且全部为编码蛋白基因，其中有9个位点突变改变了对应的氨基酸序列；有15435个snp突变位点来自于菌株la10，其中15407个位点为编码蛋白基因，15个为lincrna基因，5个为pseudogene(假遗传因子)基因，4个为rrna基因，4个为无意义基因位点，此外有3022个位点突变改变相应的氨基酸序列(错义突变和无义突变)；有10个snp突变位点来自于菌株la10和模式菌株jcm2513，且全部为编码蛋白基因，其中4个位点突变改变了对应的氨基酸序列。

功能基因序列差异比对结果：根据菌株la10和模式菌株jcm2513对上述14种碳水化合物利用差异结果，对利用各碳水化合物的关键酶的基因和影响d-乳酸产率的相关基因进行序列比对，发现菌株la10的β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、l-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的基因均发生不同程度的突变，与参考模式菌株dsm442相比，纤维二塘、熊果甙、七夜灵和柳醇的关键酶β-葡萄糖苷酶序列相似率为99.47％、99.46％、99.51％和99.46％；蜜二糖关键酶α-半乳糖苷酶序列相似率为98.83％；乳酸关键酶乳酸脱氢酶序列相似率为98.53％；l-乳酸关键酶l-乳酸脱氢酶序列相似率为98.39％和98.77％；三羧酸循环中丙酮酸的关键酶丙氨酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶序列相似率分别为97.10％和94.49％。而模式菌株jcm2513利用各碳水化合物的关键酶基因和影响d-乳酸产率的相关基因与参考模式菌株dsm442相比，无明显差异

表5关键酶基因比对分析结果

(6)基于蛋白编码基因gyra、gyrb、rpoa、rpob、tuf、hsp和phes的同源性鉴定：利用基因组重测序实验结果，在ncbi数据库中找到参考模式菌株dsm442的蛋白编码基因gyra、gyrb、rpoa、rpob、tuf、hsp和phes的基因序列，并在模式菌株jcm2513和菌株la10的基因组数据库中进行蛋白编码基因的序列比对。

实验结果：

对于以上5个蛋白编码基因，模式菌株jcm2513和菌株la10出现差异。模式菌株jcm2513与参考模式菌株sporolactobacilluslaevolacticusdsm442基于蛋白编码基因gyra、gyrb、rpoa、rpob、tuf、hsp和phes的同源性序列相似率菌株100％，可见模式菌株jcm2513与参考模式菌株dsm442同源性很近；而菌株la10与参考模式菌株sporolactobacilluslaevolacticusdsm442基于蛋白编码基因gyra、rpoa、tuf和hsp的同源性序列相似率为99.06％-99.89％，蛋白编码基因rpob的同源性序列相似率为98.33％，蛋白编码基因gyrb的同源性序列相似率为98.91％。各蛋白编码基因均发生突变，从而表现出序列的差异性，可知菌株la10与参考模式菌株dsm442同源性出现差异，在左旋芽孢乳杆菌种的基础上进一步区分鉴定为亚种。

表6同源基因相似性比对结果

(7)基于脂肪酸含量检测分析：采用气相色谱分别对菌株la10和模式菌株jcm2513细胞壁脂肪酸组分进行分析，并将分析结果进行比对。

实验结果：

菌株la10和模式菌株jcm2513的主要脂肪酸为c15:0anteiso和c17:0anteiso。

菌株la10和模式菌株jcm2513总脂质的色谱图模式一致，但菌株la10和模式菌株jcm2513在c15:0iso、c17:0iso和c17:0anteiso脂肪酸含量上出现了差异。其中对于总脂质含量而言，模式菌株jcm2513(95.83％)是菌株la10(94.20％)的1.02倍；对于脂肪酸c15:0iso而言，菌株la10(6.40％)是模式菌株jcm2513(2.89％)的2.21倍；对于脂肪酸c17:0iso而言，菌株la10(3.47％)是模式菌株jcm2513(1.81％)的1.92倍；特别是对于主要脂肪酸c17:0anteiso而言，模式菌株jcm2513(48.18％)是菌株la10(40.19％)的1.2倍，在主要脂肪酸含量上，表现出显著差异。

表7菌株la10和模式菌株jcm2513脂肪酸含量检测

注：1.表中数值为总脂肪酸的百分比。

2.表中只列出百分比>1％的脂肪酸含量。

上面(3)的鉴定实验表明，本发明筛选得到的菌株la10为革兰氏阳性杆菌，有芽孢，形成内生孢子，接触酶和氧化酶阴性，微好氧，10℃以下和45℃以上不生长，15℃至40℃之间生长良好，最适生长温度35℃，最适发酵温度30℃，产乳酸明胶不液化、不形成吲哚、不还原硝酸盐以及石蕊牛奶不变，根据《伯杰细菌鉴定手册》(1984年,第八版,科学出版社)和《伯杰氏系统细菌学手册》(2009年,第二版.第三卷.斯普林格出社)(bergey′smanualofsystematicbacteriology.2009,2nded.vol.3.springer.p.)，可鉴定其属于芽孢乳杆菌属(sporolactobacillussp.)。(4)的16srrna序列比对结果、(5)的g+c含量和ani分析结果表明，菌株la10为左旋芽孢乳杆菌(sporolactobacilluslaevolacticus)

目前左旋芽孢乳杆菌下还未见关于亚种的分类报道，根据上面(3)中对碳水化合物的发酵试验表明，与模式菌株jcm2513相比，菌株la10不能水解l-阿拉伯糖、核糖、山梨醇、苦杏仁苷、熊果甙、七夜灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、拢牛儿糖以及葡萄糖酸盐，与模式菌株jcm2513表现出较大差异，不符合参考模式菌株sporolactobacilluslaevolacticusdsm442的特性。

上面(5)中功能基因序列差异比对表明，本发明分离得到的菌株la10的β-葡萄糖苷酶基因序列与模式菌株相应序列的相似率为99％以上，α-半乳糖苷酶基因、乳酸脱氢酶、l-乳酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因序列与模式菌株相应序列的相似率为97.10％-98.83％，而丙酮酸脱氢酶基因序列与模式菌株相应序列的相似率仅为94.49％。因此，菌株la10的相关功能基因序列和左旋芽孢乳杆菌参考模式菌株dsm442均不相符。

上面(6)中菌株la10蛋白编码基因rpob与参考模式菌株dsm442的同源序列相似性为98.33％，而模式菌株jcm2513蛋白编码基因rpob与参考模式菌株dsm442的同源序列相似性为100％；菌株la10蛋白编码基因gyrb与参考模式菌株dsm442的同源序列相似性为98.91％，而模式菌株jcm2513蛋白编码基因rpob与参考模式菌株dsm442的同源序列相似性为100％。因此菌株la10与参考模式菌株dsm442不相符，而模式菌株jcm2513与参考模式菌株dsm相符。

此外，菌株la10和模式菌株jcm2513在c15:0iso、c17:0iso和c17:0anteiso脂肪酸含量上出现了差异。其中对于总脂质含量而言，模式菌株jcm2513(95.83％)是菌株la10(94.20％)的1.02倍；对于脂肪酸c15:0iso而言，菌株la10(6.40％)是模式菌株jcm2513(2.89％)的2.21倍；对于脂肪酸c17:0iso而言，菌株la10(3.47％)是模式菌株jcm2513(1.81％)的1.92倍；特别是对于主要脂肪酸c17:0anteiso而言，模式菌株jcm2513(48.18％)是菌株la10(40.19％)的1.2倍，在主要脂肪酸含量上，表现出显著差异。

综合分离筛选得到的菌株la10的形态学特征、生理生化特征、16srrna基因、基于全基因组重测序分析、相关关键酶基因序列相似性、6种蛋白编码基因同源性鉴定和脂肪酸成分鉴定结果，将该菌株鉴定为左旋芽孢乳杆菌(sporolactobacilluslaevolacticus)的新亚种，命名为左旋芽孢乳杆菌海南亚种(sporolactobacilluslaevolacticussubsp.hainanensis)

关于以往左旋芽孢乳杆菌的产酸性能说明

《伯杰氏细菌分类手册》第8版芽孢乳杆菌属的描述中，芽孢乳杆菌属菌株是仅仅产生乳酸的典型的同型发酵途径，并且是严格的同型发酵产生d-乳酸。

liy等人用左旋芽孢乳杆菌(模式菌株dsm442)使用棉籽作为唯一氮源生产d-乳酸，在补料分批发酵35h得到最高d-乳酸浓度144.4g/l，平均产率为4.13g/l·h，此时葡萄糖浓度为0.96g/g，发酵液中d-乳酸光学纯度为99.3％(liy,wangl,juj,yub,may.efficientproductionofpolymergraded-lactatebysporolactobacilluslaevolacticusdsm442withagriculturalwastecottonseedasthesolenitrogensource.bioresourtechnol142(0):186–191.)

hwang等报道了产高效的聚合物级d-乳酸的左旋芽孢乳杆菌(模式菌株dsm442)的全基因组序列(wangh,wangl,juj,yub,may.2013.genomesequenceofsporolactobacilluslaevolacticusdsm442,anefficientpolymer-graded-lactate-producerfromagriculturalwastecottonseedasanitrogensource.genomeannounc.1(6):e01100-13.)

takashimimitsuka等人研究发现当分批发酵中副原料的量减少时，d-乳酸产率下降，但左旋芽孢乳杆菌菌株jcm2513在连续发酵过程中，发酵时间为800h，d-乳酸浓度为67.3g/l，产量为0.97g/g，生产效率为11.2g/(l·h)，d-乳酸的产率并未下降，与先前报道的常规膜基发酵反应器相比，膜集成发酵反应器系统在工业中的适用性指数增加了6.3倍，表明该d-乳酸连续发酵过程的工业化潜力(mimitsukat,nak,moritak,sawaih,minegishis,henmim,yamadak,shimizus,yoneharat.amembrane-integratedfermentationreactorsystem:itseffectsinreducingtheamountofsub-rawmaterialsford-lacticacidcontinuousfermentationbysporolactobacilluslaevolacticus.bioscibiotechbioch76(1):67–72.)。

hidekisaeai等人描述左旋芽孢乳杆菌通过膜集成发酵反应器连续发酵高产高光纯d-乳酸，并且优于批量发酵高光学纯度d-乳酸产量，并且其d-乳酸光学纯度最大为99.8％，是批量发酵11倍。(hidekisawai,kyungsuna,nanamisasakietal.membrane-integratedfermentationsystemforimprovingtheopticalpurityofd-lacticacidproducedduringcontinuousfermentation,bioscience,biotechnology,andbiochemistry,75:12,2326-2332.)。

silviaklotz等综述说明研究d-乳酸的野生型菌株最多的一类是乳杆菌属菌株，而研究的重点是芽孢乳杆菌属菌株(sklotz,nkaufmann,akuenz,uprüβe.biotechnologicalproductionofenantiomericallypured-lacticacid.applmicrobiolbiotechnol.2016.100(22):9423-9437.)

wanglm等研究芽孢乳杆菌属菌株在300ml锥形瓶中加入100ml培养液，并在ph为5.5-6.0时加入caco3，最终d-乳酸浓度为72.0g/l，产量为0.9g/g，发酵时间为24h(wanglm,zhaob,lifs,xuk,macq,taof,liqg,xup.highlyefficientproductionofd-lactatebysporolactobacillussp.casdwithsimultaneousenzymatichydrolysisofpeanutmeal.applmicrobiolbiot89(4):1009–1017.)

由上可知，左旋芽孢乳杆菌菌株是研究d-乳酸的最重要的一种菌株，而参考模式菌株dsm442的光学纯度仅为99.3％，不足以满足后续制备聚乳酸单体的要求，而本发明的菌株la10光学纯度为99.9％，满足工业生产条件。此外，综合上述说明，可知左旋芽孢乳杆菌菌株la10不同于左旋芽孢乳杆菌模式菌株jcm2513和参考模式菌株dsm442，可鉴定其分类学地位为左旋芽孢乳杆菌海南亚种。

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