负载离子液体微囊化产紫青霉细胞及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种微囊化细胞，尤其涉及一种负载离子液体产紫青霉微囊化细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

微囊化细胞技术为游离细胞培养过程增加细胞培养密度、增强逆境耐受能力、增加底物的转化量、提高微生物全细胞催化的稳定性和重复利用提供技术保障。然而，微囊化环境不同于游离细胞培养过程，研究发现微囊化环境中细胞存在生长滞后、代谢滞后、分化水平降低等现象。

离子液体(ionicliquids,ils)一般是由阴、阳离子构成的室温熔融盐，因其独特的理化性质，在生物学领域有广泛应用研究。离子液体作为生物催化介质与酶或全细胞作用时，具有维持或提高酶的活性、稳定性、立体选择性等作用，并可抑制副反应的发生。然而，离子液体作为反应介质、萃取剂时存在使用量大、使用成本高和难于回收利用等问题。

cn104342430a公开了一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞及其应用，该微囊化细胞是通过以下步骤制备获得的：配制含氯化钙、壳聚糖、[bmim]pf6的混合溶液；将混合溶液与产紫青霉(penicilliumpurpurogenumli-3)菌悬液混合，获得混悬液；将混悬液逐滴滴入海藻酸钠溶液中，即得。该专利申请在微囊化细胞制备过程中添加[bmim]pf6，[bmim]pf6在微囊化细胞中以及微囊化细胞表面形成大量的孔隙，[bmim]pf6即聚集这些孔隙、微囊化细胞表面以及中空液芯内；[bmim]pf6的加入不仅使得微囊化细胞三层结构之间的联系更加紧密，提高了微囊化细胞的机械强度；而且还提高了微囊化细胞的传质性能，提高了微囊化细胞的生物催化活性。但与离体细胞相比，该微囊化细胞生物合成gamg的产率相对较低，尤其在78小时左右的时间段。

技术实现要素：

本发明提供了一种负载离子液体微囊化产紫青霉细胞的制备方法，以解决现有微囊化细胞生物合成gamg相对离体细胞产率较低的问题。

一种负载离子液体微囊化产紫青霉细胞的制备方法，包括以下步骤：

提供包含羧甲基纤维素钠、氯化钙和[mbpy]tf2n的混合溶液，加入产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)cgmccno.446(自筛，已保藏)的菌悬液，混合均匀后，滴入海藻酸钠溶液中，成型制得微囊化细胞，将微囊化细胞浸入氯化钙溶液固化，即制得所述负载离子液体微囊化产紫青霉细胞。

优选的，混合溶液中，所述羧甲基纤维素钠的重量体积百分数为1.0％-1.8％。

优选的，混合溶液中，所述氯化钙的重量体积百分数为0.5％-2.5％。

优选的，混合溶液中，所述[mbpy]tf2n的体积百分数为不大于30％。

优选的，所述菌悬液的浓度为5g/l，加入混合溶液的体积百分数为2％-6％。

优选的，所述海藻酸钠溶液的重量体积百分比浓度为0.6％-1.4％。

优选的，所述氯化钙溶液的重量体积百分比浓度为不大于1.5％。

最优选的，所述羧甲基纤维素钠的重量体积百分数为1.4％；所述氯化钙的重量体积百分数为1.0％；所述[mbpy]tf2n的体积百分数为15％；所述菌悬液在混合溶液中的体积百分数为3％；所述海藻酸钠溶液的重量体积百分比浓度为1.2％；所述氯化钙溶液的重量体积百分比浓度为1.0％。

本发明还提供了所述制备方法制得的负载离子液体微囊化产紫青霉细胞。

本发明又提供了所述负载离子液体微囊化产紫青霉细胞在生物合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸中的应用。

相对于现有技术，本发明有益效果为：

本发明负载离子液体微囊化产紫青霉细胞基于培养时间的gamg产率变化接近游离细胞的培养过程，说明此微囊化体系具有优良的生物催化效率。

本发明负载离子液体微囊化产紫青霉细胞的ils分散在载体材料的不同部位，降低了ils粘度，扩大了ils与反应物接触面积，ils使用效率提高。

本发明ils用量明显减少、易回收，负载离子液体微囊化细胞制备方法简便、制备过程耗时少、壁材易得、材料损耗小、传质性能好、后处理便利、生物催化性能高。

附图说明

图1为负载15％离子液体微囊化细胞宏观实物图，图1(a)为湿润状态下的负载[mbpy]tf2n微囊化细胞，图1(b)为冷冻干燥的负载[mbpy]tf2n微囊化细胞；

图2为负载离子液体微囊化细胞表面的电镜图，

图2(a)为不含[mbpy]tf2n微囊化细胞，即微囊化细胞，

图2(b)为负载5％[mbpy]tf2n的微囊化细胞，

图2(c)为负载10％[mbpy]tf2n的微囊化细胞，

图2(d)为负载15％[mbpy]tf2n的微囊化细胞，

图2(e)为负载20％[mbpy]tf2n的微囊化细胞，

图2(f)为负载25％[mbpy]tf2n的微囊化细胞，

图2(g)为负载30％[mbpy]tf2n的微囊化细胞；

图3为负载离子液体微囊化细胞红外谱图，其中wavenumber(cm^-1)表示波数，transmittance(％)表示透射率，曲线a为微囊化细胞红外图谱，曲线b为[mbpy]tf2n红外图谱，曲线c为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞红外图谱；

图4为热重-差式扫描量热图谱，其中temp(℃)是温度，mass(％)是失重质量百分比，dsc(uv/mg)代表热流速，曲线a为微囊化细胞，曲线b为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞，图4(a)是微囊化细胞及负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的热重曲线，图4(b)是微囊化细胞及负载[mbpy]tf2n微囊化细胞差式扫描量热曲线；

图5为xrd图谱，其中intensity(a.u.)代表峰强度，曲线a为微囊化细胞，曲线b为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞；

图6为负载不同离子液体的负载[mbpy]tf2n微囊化细胞直径变化，其中concentration(v/v)代表负载离子液体浓度，diameter(mm)表示负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的直径，负载离子液体[mbpy]tf2n微囊化细胞浓度为0、5、10、15、20、25、30％v/v；

图7为负载不同浓度离子液体微囊化细胞物理机械强度，其中mechanicalstrength(n)表示机械强度；

图8为负载离子液体浓度对负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的gamg产率及产率增幅的影响，其中yield为gamg产率，increasedyield是负载离子液体微囊化细胞相对于微囊化细胞的gamg产率增幅；

图9为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的装载量对gamg产率及破损率的影响，其中loadcapacity(a/100ml)表示负载[mbpy]tf2n的装载量；

图10为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞中[mbpy]tf2n泄露曲线，其中time(h)代表培养时间，leakrate(％)是负载[mbpy]tf2n微囊化细胞中[mbpy]tf2n的泄露率；

图11为基于时间的gamg产率变化，其中曲线分别代表游离细胞、负载离子液体微囊化细胞、微囊化细胞基于培养时间gamg的产率变化；

图12为负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的重复利用，其中repeatedbatchnumber表示重复利用次数，relativeactivity(％)表示负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的相对活性；

图13为gl在微囊化细胞及负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的传质曲线，其中time(min)代表传质时间，ct/c0代表底物gl相对浓度，图13(a)是gl在微囊化细胞中的传质曲线，图13(b)是gl在负载[mbpy]tf2n微囊化细胞中的传质曲线。

具体实施方式

实施例1

配制浓度为1.4％w/v的cmc(羧甲基纤维素钠)溶液，浓度为1.0％w/v的cacl2(氯化钙)混合溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min，溶液自然冷却至室温后，在无菌条件下加入15％v/v经紫外照射的[mbpy]tf2n，磁力搅拌该混合溶液至离子液体均匀分散在溶液中，再加入3％v/v菌悬液(菌株为产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)cgmccno.446)，磁力搅拌均匀。此混合液经蠕动泵(120r/min)匀速滴入到经磁力搅拌(120r/min)的1.2％w/v的sa(海藻酸钠)溶液，sa溶液中迅速出现球状微囊化细胞，滴加结束后搅拌5min，随后用孔径约1mm漏网滤去sa溶液，用水冲洗成形微囊化细胞，再吸干其表面水分，固化囊膜过程是将微囊化细胞置于1.0％w/vcacl2溶液30min，再经无菌水冲洗，可得负载离子液体微囊化产紫青霉细胞，并保存于4℃冰箱。

对负载离子液体微囊化细胞拍照，如图1(a)所示，湿润状态下，微囊化细胞呈规整球形、颗粒饱满圆润、透光、粒径均一、肉眼可见疏水性油状物；经24h冷冻干燥后，如图1(b)所示，微囊化细胞部分瘪皱、凹凸不平、不透光、肉眼可见透明油状物。

实施例1.2

配制浓度为1.0％w/v的cmc(羧甲基纤维素钠)溶液，浓度为0.5％w/v的cacl2(氯化钙)混合溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min，溶液自然冷却至室温后，在无菌条件下加入5％v/v经紫外照射的[mbpy]tf2n，磁力搅拌该混合溶液至离子液体均匀分散在溶液中，再加入2％v/v菌悬液(菌株为产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)cgmccno.446，磁力搅拌均匀。此混合液经蠕动泵(120r/min)匀速滴入到经磁力搅拌(120r/min)的0.6％w/v的sa(海藻酸钠)溶液，sa溶液中迅速出现球状微囊化细胞，滴加结束后搅拌5min，随后用孔径约1mm漏网滤去sa溶液，用水冲洗成形微囊化细胞，再吸干其表面水分，固化囊膜过程是将微囊化细胞置于0.25％w/vcacl2溶液30min，再经无菌水冲洗，可得负载离子液体微囊化产紫青霉细胞，并保存于4℃冰箱。

实施例1.3

配制浓度为1.8％w/v的cmc(羧甲基纤维素钠)溶液，浓度为0.25％w/v的cacl2(氯化钙)混合溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min，溶液自然冷却至室温后，在无菌条件下加入30％v/v经紫外照射的[mbpy]tf2n，磁力搅拌该混合溶液至离子液体均匀分散在溶液中，再加入6％v/v菌悬液(菌株为产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)cgmccno.446，磁力搅拌均匀。此混合液经蠕动泵(120r/min)匀速滴入到经磁力搅拌(120r/min)的1.4％w/v的sa(海藻酸钠)溶液，sa溶液中迅速出现球状微囊化细胞，滴加结束后搅拌5min，随后用孔径约1mm漏网滤去sa溶液，用水冲洗成形微囊化细胞，再吸干其表面水分，固化囊膜过程是将微囊化细胞置于1.5％w/vcacl2溶液30min，再经无菌水冲洗，可得负载离子液体微囊化产紫青霉细胞，并保存于4℃冰箱。

实施例2

图2为负载不同浓度(体积百分数)[mbpy]tf2n微囊化细胞电镜图。按照实施例1.1的制备方法负载不同浓度[mbpy]tf2n微囊化细胞冷冻干燥24h，用尖嘴镊子取其表面，并喷金观察微囊化细胞形貌。图2-a为未负载离子液体微囊化细胞，可以看出，微囊化细胞表面光滑平整，当微囊化细胞结构中加入5％、10％ils后(b)、(c)，微囊化细胞整体表面整体较平滑，有部分突起，这是由于加入少量[mbpy]tf2n，离子液体与微囊化细胞载体接触后，填充在微囊化细胞囊膜的孔隙中，使得负载ils微囊化细胞表面整体平整，略有凸起；当[mbpy]tf2n的加入量为15％、20％时，过量的ils分布在微囊化细胞表面，由于分布不均匀，导致负载[mbpy]tf2n微囊化细胞表面的凹凸明显增多；当ils加入量为25％、30％时负载[mbpy]tf2n微囊化细胞表面较平整，凸起减少，孔隙密集，是因为加入大量ils，ils较为均匀地分布在微囊化细胞表面，形成了一层附着在微囊化细胞表面的ils薄层，从sem观察到负载ils微囊化细胞表面结构显得平整，而孔隙较多。

实施例3(测试实施例1.1)

图3是微囊化细胞(a)、离子液体[mbpy]tf2n(b)和负载离子液体微囊化细胞(c)的红外图谱。分析负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的红外图谱，3432cm^-1有宽峰吸收，说明负载[mbpy]tf2n微囊化细胞有氢键作用，1635cm^-1是微囊化细胞上羧基的不对称伸缩振动峰发生偏移，1466cm^-1、1346cm^-1是[mbpy]tf2n阳离子上亚甲基和甲基上的c-n伸缩振动峰，1193cm^-1为[mbpy]tf2n阴离子上c-f不对称伸缩振动峰，1139cm^-1为o＝s＝o对称伸缩振动峰，1055cm^-1是s-n-s不对称伸缩振动峰。由上分析可知，负载[mbpy]tf2n微囊化细胞的红外图谱上有属于微囊化细胞的特征吸收和离子液体[mbpy]tf2n阴离子的特征吸收峰，说明[mbpy]tf2n与微囊化细胞发生结合作用，这有利于增强离子液体与微囊化细胞结构稳定性。

实施例4(测试实施例1.1)

图4(a)是微囊化细胞(a)和负载离子液体微囊化细胞(b)的热分解tg曲线。silm的热分解可分为3个阶段。第一阶段30-248℃是吸附水及内部结合水的失重，约15.4％；第二阶段248-433℃，失重49.4％，是ils及ils与微囊化细胞结构的分解，最大热分解温度248℃；第三阶段433-680℃，残余质量21.76％，是炭化产物及金属氧化物。相比a、b失重曲线的第二阶段，最大热分解温度相同，而silm迅速失重，且失重质量是微囊化细胞的两倍，说明离子液体与微囊化细胞相互作用制备的silm，热稳定性较差。

图4(b)是微囊化细胞(a)和负载离子液体微囊化细胞(b)的dsc曲线。曲线a在100-680℃一直上升，说明微囊化细胞的热分解过程是持续放热过程；曲线b是在433-458℃有一尖锐的小吸热峰，该过程是silm热分解第二阶段结束，之后dsc曲线上升趋势减缓。dsc曲线表明，引入ils的微囊化细胞其热分解放热过程减弱。

实施例5(测试实施例1.1)

图5为微囊化细胞(a)、负载离子液体微囊化细胞(b)的xrd图谱，从a曲线看出，样品在20.23°、41.37°有宽的弥散衍射峰，说明样品a是具有微弱晶体结构，从b曲线看出，引入ils后微囊化细胞在20.23°、41.37°处峰强度减弱，说明引入[mbpy]tf2n的负载离子液体微囊化细胞晶体结构减弱。

实施例6(测试实施例1.1)

分别加入离子液体浓度为0、5、10、15、20、25、30％v/v，考察负载离子液体浓度对负载直径的影响。由图6可知，微囊化细胞的直径较大，而负载离子液体浓度为5％-30％的微囊化细胞直径较小，随ils浓度增加，负载ils微囊化细胞直径呈增大趋势。芯材溶液的粘度和密度，会影响液滴从针头滴出时的球形度及体积大小，在芯材中加入疏水性ils后，由于ils密度较大，且ils与cmc溶液不互溶，降低了芯材溶液的表面张力，因此芯材滴出时的体积减小，故silmcs直径较小；而随着ils浓度增加，负载ils微囊化细胞的直径呈增大趋势，可能是因为微囊化细胞中离子液体比例增加，芯材中水比例相应减少，芯材滴入sa溶液中，sa溶液中水的渗透压大，水向微囊化细胞内部渗透，从而使silmcs直径增大。

实施例7(测试实施例1.1)

单轴按压法测定微囊化细胞的破损率，破损率计算公式为：

由图7看出，不含ils微囊化细胞的机械强度为8.4n，破损率为0，随着ils浓度增大，silmcs的机械强度先增大后减小，破损率先增大后略有减小。ils浓度在5、10、15％时，机械强度都大于微囊化细胞，即引入ils有增大silmcs机械强度的作用，而在ils为20、25、30％时，silmcs的机械强度低于不含ils的微囊化细胞，即引入ils浓度较大时，silmcs的机械强度是下降的。这是因为少量ils与微囊化细胞作用时，并不能对微囊化细胞致密的结构造成较大影响，从图2的b、c、d看出，微囊化细胞并没出现明显的孔隙或孔洞，故而机械强度较好，而ils浓度较大时，ils对微囊化细胞的结构破坏作用增大，从电镜图，图2e、f、g可以看出，ils在浓度为20、25、30％时，负载ils微囊化细胞具有较多、较大的褶皱和丰富的孔隙，导致微囊化细胞致密的结构变得疏松，silmcs的机械强度下降。

silmcs的破损率大于不含ils微囊化细胞，且持续增大，这是因为ils密度较大，silmcs质量大于微囊化细胞，回旋振荡培养过程silmcs与培养瓶壁、微囊化细胞之间的碰撞摩擦大于不含ils的微囊化细胞。当ils浓度增大，silmcs相互之间的碰撞摩擦更大，因此破损率上升。

实施例8(测试实施例1.1)

由图8可知，随着负载离子液体浓度增加，gamg产率增加。这是因为[mbpy]tf2n对产紫青霉细胞具有促进生长代谢的功能，而离子液体与产紫青霉细胞共存于一个微囊化细胞环境中，ils分散在微囊化细胞中，粘度降低，营养物质等更好地在微囊化细胞中传递，微环境中细胞与ils也能密切接触，这样的微环境能更好地发挥ils体促进细胞生长代谢的功能。当负载[mbpy]tf2n浓度为5％，其gamg产率相比不负载离子液体微囊化细胞提高38％，随负载离子液体浓度继续增加，gamg产率的增长变缓慢，维持在50％以上。说明负载ils微囊化细胞为微囊化产紫青霉细胞发挥最佳代谢功能提供了良好载体。

实施例9(测试实施例1.1)

无菌条件下，silmcs装载量分别为25、50、100、150、200颗/100ml，生物培养78h后取样，测定gamg产率；培养96h后计算微囊化细胞破损率。由图9可知，随着silmcs的装载量增大，破损率迅速减小，gamg产率先增大后减小。这是因为silmcs的装载量小，回旋振荡培养的剪切力被少量微囊化细胞分担，单个微囊化细胞承受的剪切力较大，故破损率较大，而当装载量增大，流体剪切力分担给较多的微囊化细胞，单个微囊化细胞承受的剪切力减小，故破损率下降。gamg产率先增大后减小，是因为装载量低时，破损率较大，破损微囊化细胞里的菌体分散在培养基中细胞密度低，故gamg产率低；而装载量过高时，营养物质相对不足而导致微囊化细胞竞争营养物质阻碍了gamg的生成。当培养密度为100颗/100ml培养gamg产率最大，破损率较小，说明合理的silmcs装载量，利于高效发挥silmcs提高gamg产率的功能。

实施例10(测试实施例1.1)

负载离子液体微囊化细胞培养密度为100颗/100ml，间隔24h取样，培养192h，样品按荧光检测[mbpy]tf2n浓度方法，检测随培养时间离子液体泄露率变化，得到silmcs培养过程中[mbpy]tf2n泄露曲线。由图10看出，培养过程silmcs体系中离子液体泄露率是先增大后减小再稳定，培养24-96h离子液体泄露率逐渐增高，96-144hils泄露率逐渐减少，144h后ils泄露率无明显变化；从培养终点看到，ils浓度为5％的silmcs的泄露率最大，在培养96h时，泄露率为8.90％，随ils浓度增大，silmcs泄露率降低，ils浓度在25-30％，泄露曲线重叠。这是因为，培养初期，silmcs刚进入培养体系，承受流体剪切力较大，抗流体剪切力较弱的微囊化细胞破裂，泄露流出的ils分散在培养基中，随培养时间推移，只有较少微囊因溶胀作用和受流体剪切力而破损，泄露率变化较小，随培养时间推移，部分游离在培养基中的离子液体吸附于silmcs上，培养基中的ils量减少，培养后期泄露曲线呈下降趋势。以上分析说明此负载[mbpy]tf2n微囊化体系对[mbpy]tf2n固载稳定性良好。

实施例11(测试实施例1.1)

在无菌操作条件下，培养游离细胞(接种量5％)、silmcs(接种密度100颗/100ml)、微囊化细胞(接种密度100颗/100ml)，以考察三者生长曲线。从图11可以看出，基于时间的游离细胞、微囊化细胞及silmcs体系中的gamg产率曲线相似，均呈现“s”型规律，由三者生长曲线的比较可看出：培养终点三者体系中gamg的产率大小为：游离细胞体系≈silmcs体系>微囊化细胞体系。由于产紫青霉细胞与营养成分传质过程介入了囊膜，虽然囊膜可以保护细胞，但是营养物质须跨膜传递，细胞在微囊化环境中需要一定的时间来调整自身的生理状态，重新合成必需的酶类、辅酶及一些中间产物，因此微囊化细胞体系gamg产率最低，游离细胞体系中gamg产率最高。[mbpy]tf2n与产紫青霉作用，能最大限度地提高细胞生长和代谢水平，silmcs体系的生长曲线接近游离细胞。负载离子液体微囊化细胞体系中的gamg的产率明显高于微囊化细胞体系，当反应进行192h后，与不含[mbpy]tf2n微囊化细胞体系相比较，负载离子液体微囊化细胞体系中的gamg产率增加了16.08％。

微囊化细胞的制备方法：配制浓度为1.4％w/v的cmc(羧甲基纤维素钠)溶液，浓度为1.0％w/v的cacl2(氯化钙)混合溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min，溶液自然冷却至室温后，再加入3％v/v菌悬液(菌株为产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)cgmccno.446)，磁力搅拌至均匀。此混合液经蠕动泵(120r/min)匀速滴入到经磁力搅拌(120r/min)的1.2％w/v的sa(海藻酸钠)溶液，sa溶液中迅速出现球状微囊化细胞，滴加结束后搅拌5min，随后用孔径约1mm漏网滤去sa溶液，用水冲洗成形微囊化细胞，再吸干其表面水分，固化囊膜过程是将微囊化细胞置于1.0％w/vcacl2溶液30min，再经无菌水冲洗，可得微囊化产紫青霉细胞。

实施例12(测试实施例1.1)

有效回收并反复利用负载离子液体微囊化细胞是降低离子液体成本的关键。以silmcs接种密度为100颗/100ml进行重复批次催化反应，结果如图12所示。由图13可知，随着负载[mbpy]tf2n微囊化产紫青霉细胞重复利用次数的增加，微囊化细胞相对活性逐渐降低，负载[mbpy]tf2n液芯微囊化产紫青霉细胞经过连续使用9次后，其相对活性可达到70.81％，说明此微囊化体系有较强保持细胞活性的能力，由此体现了该体系在微囊化细胞培养方面具有显著优势。

实施例13(测试实施例1.1)

分别取50颗的微囊化细胞和负载离子液体微囊化细胞，吸干其表面水分后，投入50ml已知初始浓度c0的底物gl溶液中，置于恒温振荡器中32℃、150rpm下振荡，隔时取样，以紫外波长257nm测定溶液中gl的浓度ct。以ct/c0为纵坐标，扩散时间t为横坐标，绘制扩散曲线。由此得到主体溶液的相对浓度与时间的关系曲线，阐释溶质gl由在微囊化细胞体系中由外向内的传质过程。结果表明，底物gl在silm中迅速达到传质平衡，说明引入ils的silm的扩散性能良好。相比表1结果，silm的传质系数大于微囊化细胞的传质系数，可能是负载ils微囊化细胞表面孔隙较多，利于gl传质。将图13的数据经origin软件拟合，计算得到传质系数，结果列于表1。结果说明，负载[mbpy]tf2n微囊化细胞传质性能略优于微囊化细胞。

表1底物gl在微囊化细胞及负载离子液体微囊化细胞中的传质系数