杂交瘤细胞株AntiTput-13及其分泌的AntiTput-DP10单克隆抗体的制作方法

本发明属于尘螨变应原相关的基因工程领域，具体涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗腐食酪螨变应原derp10蛋白的单克隆抗体。

背景技术：

腐食酪螨(tyrophagusputrescentiae)属于蛛形纲(arachinida)、蜱螨亚纲(acari)，真螨目(acariformes)粉螨亚目(acaridida)，是世界性分布的仓储害螨，寄主范围广，也广泛存在于人类生活和工作环境中。其螨体及代谢物、排泄物等均具有较强变应原性，可引起过敏性哮喘、皮炎、过敏性鼻炎等ⅰ型变态反应性疾病，是粉尘螨、屋尘螨的成员之一。研究表明约50％以上的ⅰ型超敏反应性疾病患者由尘螨引起，全球人口总数的10～20％对尘螨过敏。1964年voorhort等发现螨是屋尘中主要的变应原以来，人们已发现尘螨变应原约有20种，粉尘螨和屋尘螨存在高度的交叉反应性，绝大多数尘螨患者都是屋尘螨和粉尘螨共同致敏。其中，屋尘螨的第一组分变应原derp1主要存在于屋尘螨排泄物中，第2组分变应原derp2主要存在于螨体内，derp1和derp2是80％以上屋尘螨过敏患者的主要致敏组分。粉尘螨第1组变应原组分derf1和第2组变应原组分derf2是主要的致敏组分。derf1和derp1可以诱导交叉反应，而derf2和derp2几乎完全交叉。屋尘螨第10类变应原derp10虽不是主要致敏组分，而是交叉反应的主要致敏蛋白，提示derp10可作为屋尘螨与其他变应原存在交叉反应的监测致敏组分。研究还显示，derp10是一种导致全身性严重变态反应的重要变应原。derp10和derf10相比，在全序列中只有3个氨基酸不同，序列一致性达98.5％，广泛存在于尘螨肌肉和非肌肉细胞中，它们存在交叉反应的结论已确定。

derp10蛋白质结构与无脊椎动物中的原肌球蛋白非常相似，如虾，龙虾，螃蟹，蟑螂和其他软体动物。derp10因其广泛的交叉反应性特点，除在螨虫过敏患者中呈阳性，且在蟑螂、虾蟹类和贝类食物的交叉过敏中也发挥重要作用。在交叉反应的抑制试验中，尘螨浸液是强烈的抑制因子，表明在致敏的变应原中尘螨是主要的来源。因此，derp10受到广泛关注，但作为尘螨的原肌球蛋白derp10还没有详细的报道。

抗体是生物及医学领域用途极为广泛的蛋白质分子。单克隆抗体是由于免疫b细胞与骨髓瘤细胞融合形成的淋巴细胞杂交瘤产生的，该杂交瘤不仅具有瘤细胞不断分裂的能力，而且具有免疫细胞产生抗体的能力。由于单克隆抗体是特异性抗体，特异性强，因此得到广泛应用。变应原单克隆抗体可以制成试纸条或elisa试剂盒等用于进行环境中尘螨变应原的检测或根据检测环境中变应原的量推测螨虫种群的数量。所以，筛选出一株可以分泌抗derp10蛋白的特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的derp10蛋白特异性b细胞表位多肽对derp10变应原的诊断及预防具有积极意义，并为derp10诊断试剂盒的研制奠定基础。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一株分泌derp10变应原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体antitput-dp10，该单克隆抗体antitput-dp10可与derp10蛋白发生特异性反应；

其序列为:

mnhkvhhhhhhmeaikkkmqamklekdnaidraeiaeqkardanlksekteeevralqkkiqqieneldqvqenltqattkleekekalqtaeadvaalnrriqlieedlerseerlkvatakleeashsadesermrkmlehrsitdeermdglesqlkearlmaedadrkydevarklamveadleraeeraetgeskiveleeelrvvgnnlkslevseekaqqreeayeqqirimtsklkeaearaefaersvqklqkevdrledelvhekekyesisdeldqtfaeltgy

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用trizol法提取腐食酪螨总rna，反转录克隆原肌球蛋白基因(derp10)的cdna，将该cdna插入原核表达载体pczn1，利用pczn1原核表达载体对derp10基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的derp10经his标签亲和纯化后作为免疫原，免疫spfbalb/c小鼠，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用大肠杆菌表达系统对derp10基因进行原核表达，对所表达的包涵体形式的derp10蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接elisa检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗derp10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：cgmcc16298，其命名为antitput-13，分类命名是：分泌抗derp10变应原单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2018年9月13日；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为antitput-dp10，western-blot检测结果表明单克隆抗体antitput-dp10可与derp10蛋白发生特异性反应，elisa检测结果表明单克隆抗体antitput-dp10与derp10发生特异性反应。

在本发明的一种实施方式中,以的腐食酪螨多抗为包被抗体,抗体标记后单克隆抗体antitput-dp10为酶标抗体,建立检测腐食酪螨的双抗体夹心工法,用此建立的双抗夹心法检测检测屋舍、仓储、田间等环境中腐食酪螨，具有实际应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1重组pczn1-tm-t质粒酶切结果，其中m：dnamarker；1：酶切前质粒；2：酶切后质粒；

图2是重组pczn1-tm-t蛋白的sds-page分析结果，其中m：标准蛋白marker；1：pczn1-tm-t诱导前产物；2：pczn1-tm-t诱导后产物；3：pczn1-tm-t纯化产物。

图3是为单克隆抗体antitput-dp10纯化后sds-page分析，其中1：标准蛋白marker；2：单克隆抗体antitput-dp10重链与轻链。

图4是为应用westernblot试验检测单克隆抗体antitput-dp10与derp10蛋白wb分析，其中1：螨虫裂解沉淀后产物；m：标准蛋白marker。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

主要实验材料和来源

1、细胞、尘螨和血清

sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，hgprt缺失；不生成免疫球蛋白且通过支原体检测,均由本实验室保存，腐食酪螨在本实验室种群饲养。腐食酪螨阳性、阴性血清由实验室制备，经elisa实验检测为阴性和阳性。

2、主要试剂和药品

胎牛血清、dmem培养基购自gibco公司；二氨基联苯胺(dab)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗鼠igg抗体、fitc标记羊抗鼠igg抗体、胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；50％peg、50×hat、50×ht购自sigma公司；邻苯二胺、预染蛋白marker购自fermentas公司；sbaclonotypingtmsystem/hrp抗体亚类鉴定试剂盒购于southernbiotechnology公司；质粒提取试剂盒购自axygen公司，t-e1、反转录酶、extaqdna聚合酶、t4dna连接酶，his标签纯化试剂购自大连宝生物公司。

3、实验动物

balb/c远交系小鼠，由长春亿斯实验动物提供。生产许可证：scxk(吉林)2016-0003

4、试验器材

灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿湿盒，2个500ml烧杯，2个50ml离心管，3个15ml离心管。

5、培养基

imdm培养基，胎牛血清购自hyclone公司，配置成imdm完全培养基(含15％血清)；peg1500购自roche，货号：78364；hat培养液、ht培养液均购自sigma，货号分别为h0262-10vl和h0137-10vl。杂交瘤上清elisa检测：包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph9.6；0.1mpbs缓冲液ph7.4；封闭液：2％脱脂牛奶；洗液：pbst(0.05％吐温，pbs)；显色液可溶性tmb；终止液：2m硫酸。

实施例1derp10蛋白的原核表达及纯化

1.引物设计

根据genbank中已登录的腐食酪螨的原肌球蛋白(tropomyosin)基因序列(登录号：aat40866.1)，设计pcr扩增引物，序列如下：上游引物5’-atgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatggc-3’，下游引物5’-ccgtctagattaataaccggtcagttcggcaaa-3’，下划线为酶切位点。

2.腐食酪螨总rna的提取及反转录

利用trizol法从腐食酪螨中提取总rna作为模板，用随机引物进行反转录合成cdna。

trizol法提取rna步骤：显微镜下挑取腐食酪螨成螨30头，加入0.5mltrizol混匀，室温静置5min，加入0.1ml氯仿，用力振摇15s，室温孵育2-3min，12000g，4℃离心15min，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4℃离心10min，弃上清，沉淀加入0.5ml75％的乙醇(depc水配制的)，轻振15s，7500g，4℃离心5min，小心弃尽上清，沉淀室温风干3-5min，加入20-30μldepc水溶解，-20℃保存。

用提取的总rna进行反转录合成cdna，体系如下：

反应过程中，先将模板rna溶液和随机引物于95℃孵育10min，冰浴冷却5min，然后将其余试剂加入，混匀，室温放置10min，42℃孵育60min，冰中冷却2min。

3.derp10基因扩增与纯化

以反转录获得的cdna为模板，利用所设计的pcr扩增引物，扩增derp10基因。

pcr反应体系(50μl)如下：

反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。pcr产物胶回收，将全部pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后按照大连宝生物有限公司胶回收试剂盒说明书回收pcr扩增出的derp10基因。

4.derp10蛋白原核表达重组载体的构建

将胶回收得到的derp10基因以及原核表达载体pczn1分别进行连接，连接体系为：

连接条件：16℃连接过夜。

5.转化与挑菌

将4中得到的连接产物全部转入ecolibl21感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μllb液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μl菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到3mllb(amp⁺，100μg/ml)液体培养基中37℃振荡培养。

6.重组质粒的pcr鉴定与测序

1)利用axygen公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒进行pcr鉴定并测序。

2)对疑似重组质粒进行pcr鉴定

pcr反应体系(50μl)如下：

反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。

将经过pcr结果阳性的质粒(如图1所示)送交南京擎科生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pczn1-tm-t。

7.derp10基因的原核表达与纯化

按照5所述转化方法将重组质粒pczn1-tm-t转化到原核表达用bl21感受态细胞，然后取出100μl菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板上，37℃培养过夜，挑取lb平板培养基上的白色菌落，接种于3ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中37℃培养过夜。表达诱导具体操作如下：取1ml重组菌菌液加入到100ml的lb培养基中37℃震荡培养至od600nm约为0.6-0.8(约2h)；加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃诱导4h。将表达产物进行sds-page电泳，通过his标签的亲和层析方法进行纯化，表达和纯化结果见图2。亲和层析方法如下：

1、将经过iptg诱导的菌液离心，7000rpm，10min。收集菌体细胞，用pbs漂洗两遍，将收集好的菌液超声破碎，直至澄清，13000rpm，离心10min，取沉淀。再用纯化所用的上样缓冲液漂洗一遍，最后用上样缓冲液重悬，13000rpm，离心10min，取上清，用0.45μm滤器过滤。

2、将填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

3、将上清负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。使用15倍柱体积的bindingbuffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用5mlelutionbuffer洗脱，收集洗脱峰。将纯化后产物进行sds-page电泳检测。

实施例2单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

以亲和纯化的原核表达的重组derp10蛋白免疫4只6周龄雌性spfbalb/c雌性小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为30μg/只，免疫途径为腹腔免疫。

分别在二免和三免后一周对小鼠进行眼眶采血，分离血清(4℃，10000rpm，20min)，用间接elisa检测抗体水平，结果见表1，3号小鼠效价最好，细胞融合选择3号小鼠。在细胞融合前3天，对免疫效果好的3号spfbalb/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。

间接elisa方法：用纯化后的重组derp10蛋白抗原，2ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜；后用洗液洗涤3次；2％脱脂乳封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为pbs，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次；加入pbs稀释20000倍的二抗(hrp标记的羊抗鼠igg)，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次；显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min；每孔加入50ul终止液终止；450nm处测od值，记录保存数据。

表1重组derp10蛋白elisa效价结果

2.细胞融合

融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取spfbalb/c小鼠腹腔巨噬细胞铺96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞3：1的比例用peg进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用纯化后的原核表达derp10蛋白建立间接elisa检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗derp10变应原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其分泌的单克隆抗体命名为antitput-13。

4.单克隆抗体的腹水制备与纯化

给10周龄左右的健康spfbalb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5ml/只，1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。

小鼠腹水抗体使用g蛋白亲和纯化。方法如下：将填料装载到层析柱中，用缓存液(20mmpbs，300mmnacl，ph7.4-8.5)将腹水稀释约5倍，上柱进行纯化。上样后，用平衡缓冲液(20mmpbs，300mmnacl，ph7.4-8.5)将蛋白未结合部分除去；然后加入洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸钠，ph4.0)，将结合蛋白洗脱下来，最后用中和缓冲液(1mtris-hcl,ph9.0)进行ph值调整，抗体浓度和纯度见表2。纯化后的抗体进行sds-page检测，结果见图3。

表2：纯化后antitput-13纯度、浓度和效价

实施例3单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照sbaclonotyping^tmsystem-hrp(southernbiotech)抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

结果显示本发明单克隆抗体antitput-dp10的重链为igg1，轻链为kappa链，鉴定结果见表3。

表3单克隆细胞亚类鉴定

2.westernblot鉴定试验

5头腐食酪螨成螨虫体研杵研碎后离心沉淀处理后进行sds-page电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18v电压30min，用5％脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵育1h，用pbst(含0.5ml/l吐温-20的ph7.4的pbs缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗鼠igg抗体室温孵育1h，pbst洗涤3次后，用dab显色试剂盒显色，扫描记录。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体antitput-dp10能够与腐食酪螨发生特异性反应，而与对照(糙皮侧耳菌丝)不发生反应，结果见图4，推测antitput-13所识别的derp10蛋白b细胞表位是一个线性表位。

实施例4利用腐食酪螨变应原derp10单克隆抗体antitput-dp10建立检测尘螨过敏源的夹心elisa方法

双抗体夹心法，通常是结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。本研究制备腐食酪螨阳性阳性多抗血清，做为包被抗体；单克隆抗体antitput-dp10标记辣根过氧化物酶作为显色抗体，检测物为疑似腐食酪螨培养物。该方法能应用与菌类螨虫危害检测，具有很强的实用性。

1、标准derp10蛋白不同稀释度标准曲线的确定

a.抗体工作浓度的确定：对包被抗体(腐食酪螨阳性阳性多抗血清)及酶标标记抗体(单克隆抗体antitput-dp10)进行梯度稀释,利用棋盘滴定法确定其工作浓度,实验表明包被抗体浓度为100μg/ml，酶标抗体稀释度1：2000时，效果最佳，阳性比阴性值最高。

b双抗体夹心法操作步骤的确定

1、包被：腐食酪螨阳性ⅰ号与包被液稀释至100μg/ml，100ul/孔，37℃恒温箱1.5h，洗板机清洗1次。

2封闭：10％脱脂乳+3％bsa进行封闭，每孔250ul，4℃封闭24h洗板机清洗4次。

3样品100ul，使用包被液(1％脱脂乳)稀释，37℃恒温箱1.5h洗板机清洗3次。

4二抗1:2000稀释100μl，pbs(1％脱脂乳)，37℃1h，洗板机清洗2次。

5显色：tmb100μl室温3min。2mh2so4终止液50μl。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>杂交瘤细胞株antitput-13及其分泌的antitput-dp10单克隆抗体

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>295

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metasnhislysvalhishishishishishismetglualailelys

151015

lyslysmetglnalametlysleuglulysaspasnalaileasparg

202530

alagluilealagluglnlysalaargaspalaasnleulysserglu

354045

lysthrgluglugluvalargalaleuglnlyslysileglnglnile

505560

gluasngluleuaspglnvalglngluasnleuthrglnalathrthr

65707580

lysleugluglulysglulysalaleuglnthralaglualaaspval

859095

alaalaleuasnargargileglnleuileglugluaspleugluarg

100105110

serglugluargleulysvalalathralalysleugluglualaser

115120125

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130135140

serilethraspglugluargmetaspglyleugluserglnleulys

145150155160

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165170175

alaarglysleualametvalglualaaspleugluargalagluglu

180185190

argalagluthrglygluserlysilevalgluleugluglugluleu

195200205

argvalvalglyasnasnleulysserleugluvalsergluglulys

210215220

alaglnglnarggluglualatyrgluglnglnileargilemetthr

225230235240

serlysleulysglualaglualaargalagluphealagluargser

245250255

valglnlysleuglnlysgluvalaspargleugluaspgluleuval

260265270

hisglulysglulystyrgluserileseraspgluleuaspglnthr

275280285

phealagluleuthrglytyr

290295