一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法与流程

本发明涉及生物发酵
技术领域：
，尤其涉及一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法。
背景技术：
：固定化细胞技术是将具有一定生理功能的微生物细胞通过一定的方法将其固定在相应的载体上，使其维持生物活性的一项技术。固定化细胞技术与传统的游离细胞发酵相比具有许多突出的优点，最突出的优点是细胞可以多次重复利用，而且实现连续化发酵生产；提高细胞浓度，缩短发酵周期，并且对ph、温度、有机溶剂等环境具有更强的耐受力，反应过程更容易控制，目前由于其低成本和可操作性强已广泛应用于食品发酵、废水处理和医药等领域。针对目前发现的蒙氏肠球菌（enterococcusmundtii）hnmd-m25(中国微生物菌种保藏管理委员会保藏编号为：gcmccno.8699)，进行固定化发酵蛋壳，具有一定的挑战性。第一，有关蒙氏肠球菌的固定化发酵属于首次突破；第二，利用蛋壳进行固定化发酵制备乳酸钙，目前在国内外未见报道，技术难度更高；第三，需要解决固定化载体在生产中易出现破裂、软化、机械强度低等问题，选择合适的包埋材料对于能够实现多次重复利用及其在实际生产中的应用具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提出一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，实现蒙氏肠球菌株的首次应用于固定化发酵，固化细胞机械稳定性高，固定化细胞的细菌活力保持持久，重复利用率高。为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，包括如下步骤：（1）将蒙氏肠球菌经过活化后，收集菌体细胞；（2）菌体细胞与包埋剂混合均匀，并用无菌注射器加入成型剂中固化成型，得到固定化的蒙氏肠球菌，所述包埋剂为海藻酸钠、海藻酸钠-聚乙烯醇及海藻酸钠-活性炭；（3）将固定化的蒙氏肠球菌接种至发酵培养基中发酵培养，得到乳酸钙，所述发酵培养基为蛋壳粉8~12g，葡萄糖10-16g，蛋白胨0.3~0.6g，胰蛋白胨0.3~0.6g，酵母提取物0.8~1.2g，盐溶液3~5ml和蒸馏水100ml。本发明具有以下优点：（1）本发明用于乳酸钙生产的菌种为蒙氏肠球菌，蒙氏肠球菌（enterococcusmundtii）hnmd-25(中国微生物菌种保藏管理委员会保藏编号为：gcmccno.8699)从埋于地下1-2米的废弃蛋壳中分离，与其他菌株相比对蛋壳的降解具有更好的优势，该菌种首次应用于固定化发酵。（2）本发明以蛋壳为原料进行固定化发酵生产乳酸钙，目前在国内外没有相关报道，且蛋壳来源广，价格低廉，容易获得，不仅将蛋壳资源进行充分的利用，而且减少蛋壳对环境造成的污染，使蛋壳变废为宝，创造出较高的价值。（3）本发明所采用的海藻酸钠、海藻酸钠-聚乙烯醇、海藻酸钠-活性炭三种包埋材料，通过比较乳酸钙的产量，选择最优包埋材料。由于蛋壳中含有93%以上为碳酸钙，而发酵过程中由于钙离子的加入，可与包埋材料发生反应形成交联凝胶体系，可防止固定化细胞在长期发酵过程中凝胶体系中的钙离子可能被其他阳离子替换，导致其机械稳定性差，出现易软化、破裂、细胞易泄露的问题。另一个方面，蛋壳中的钙离子又不断地同发酵产生的乳酸反应形成乳酸钙。因此，蛋壳钙离子的作用增强固定化细胞的机械稳定性，有效解决了固定化发酵中普遍存在的机械稳定性差、易软化、破裂等重大问题。（4）本发明所使用的固定化细胞其细菌活力保持持久，重复利用率高，在重复使用18次后依然能够保持较高的活力，实现连续化发酵生产；而传统的游离细胞在重复使用过程中其细胞活力下降非常快，其稳定性差。（5）本发明发酵周期较短，对ph、温度、有机溶剂等环境具有更强的耐受力，反应过程更容易控制，后期更容易分离以及低成本和可操作性强等优点，解决了传统微生物发酵法中微生物易污染、生产周期长、生产成本高等问题，利用蛋壳发酵制备的乳酸钙溶解性好，吸收率高，生物利用效率很高。进一步说明，步骤（3）中，所述发酵培养基中的蛋壳粉经过预处理，步骤如下：将新鲜的蛋壳用蒸馏水冲洗，除去表面的污垢，以及膜上残留的蛋清液，使用盐溶液将清洗过的蛋壳进行浸泡并对其进行烘干，将烘干后的蛋壳粉碎，并用200目筛分出的蛋壳粉与水进行混合，搅拌之后溶液经抽滤烘干得到蛋壳粉。进一步说明，在蛋壳粉的预处理中，所述盐溶液分别为1mnacl和100mmedta，ph值为8.5，蛋壳浸泡时间2~4h，烘干温度25℃，粉碎时间10s，蛋壳粉与水的料液比为1:10，搅拌速度600rpm，搅拌15min。通过对所述蛋壳粉进行预处理，使其在发酵培养基中与包埋材料充分反应形成交联凝胶体系，稳定性高，防止固定化细胞在发酵过程中凝胶体系中的钙离子可能被其他阳离子替换，提高固定化细胞的机械稳定性。进一步说明，步骤（2）中，所述成型剂为氯化钙溶液，其浓度为20g/l。进一步说明，步骤（2）中，所述包埋剂的海藻酸钠的浓度为10g/l-30g/l，聚乙烯醇的浓度为70g/l，活性炭浓度为20g/l；菌体细胞与包埋剂等体积混合。进一步说明，步骤（2）中，所述海藻酸钠的固定化温度分别为37℃，固化时间为30min，所述海藻酸钠-聚乙烯醇和海藻酸钠-活性炭的固化温度均为4℃，固定化时间为24h。进一步说明，步骤（1）中所述蒙氏肠球菌活化，包括如下步骤：将冻于-80℃冰箱中的蒙氏肠球菌从保藏状态恢复到室温状态，在无菌条件下吸取100μl于mrs肉汤培养基，37℃厌氧培养24h进行活化，重复活化2-3次；其中，所述mrs肉汤培养基为：葡萄糖20.0g，牛肉粉8.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉4.0g，乙酸钠5.0g，吐温801.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，蒸馏水1000ml，ph值6.5±0.2（25℃），118℃灭菌15min。步骤（1）中所述收集菌体细胞，包括如下步骤：将经过活化后的菌种接到摇瓶培养基中，其接种量为2%，于37℃、180r/min振荡培养11h，然后将发酵液于10000r/min离心10min，收集菌体细胞。更优选的，步骤（3）中，所述发酵培养基为蛋壳粉10g，葡萄糖13g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母提取物1.0g，盐溶液4ml和蒸馏水100ml；其中，盐溶液的成分为nahco310.0g，nacl2.0g，无水cacl20.2g，k2hpo41.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.48g，定容至1000ml，121℃灭菌15min。进一步说明，步骤（3）中，在完成一次发酵后，用无菌纱布由发酵培养基过滤分离出固定化蒙氏肠球菌，并向固定化蒙氏肠球菌中重新加入等体积的新的发酵培养基，进行再次发酵。进一步说明，步骤（3）中，于摇床中发酵培养，发酵的温度为37℃，摇床的转速为180r/min，发酵时间为72h。本发明的有益效果：本发明使用蒙氏肠球菌（enterococcusmundtii）hnmd-25(中国微生物菌种保藏管理委员会保藏编号：gcmccno.8699)，进行固定化发酵蛋壳制备乳酸钙，通过采用海藻酸钠等固定化材料对蒙氏肠球菌进行包埋，使其在含蛋壳粉的发酵培养基反应达到生产乳酸钙的目的，提高细胞利用率，实现了该菌株的首次应用于固定化发酵，固定化细胞的细菌活力保持持久，可以多次重复利用，重复利用率高，实现连续化发酵生产；并且还通过以蛋壳粉为原料，使之与包埋材料发生反应，形成交联凝胶体系，防止固定化细胞在长期发酵过程中，机械稳定性差，出现易软化、破裂的问题。附图说明图1是本发明实施例1的固定化细胞的表面结构扫描电镜图；图2是本发明实施例2的固定化细胞的表面结构扫描电镜图；图3是本发明实施例3的固定化细胞的表面结构扫描电镜图；图4是葡萄糖标准曲线图；图5是本发明实施例3重复分批发酵次数。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。实施例1-一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，包括如下步骤：（1）将蒙氏肠球菌经过活化后，收集菌体细胞；（2）菌体细胞与包埋剂混合均匀，并用无菌注射器加入成型剂中固化成型，得到固定化的蒙氏肠球菌，所述包埋剂为海藻酸钠；所述成型剂为20g/l氯化钙溶液；（3）将固定化的蒙氏肠球菌接种至发酵培养基中发酵培养，得到乳酸钙，所述发酵培养基为蛋壳粉8g，葡萄糖10g，蛋白胨0.3g，胰蛋白胨0.3g，酵母提取物0.8g，盐溶液3ml和蒸馏水100ml。实施例2-根据实施例1的一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，其中，发酵培养基为蛋壳粉10g，葡萄糖13g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母提取物1.0g，盐溶液4ml和蒸馏水100ml，其余步骤均与实施例1相同，得到乳酸钙。实施例3-根据实施例1的一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，其中，发酵培养基为蛋壳粉12g，葡萄糖16g，蛋白胨0.6g，胰蛋白胨0.6g，酵母提取物1.2g，盐溶液5ml和蒸馏水100ml，其余步骤均与实施例1相同，得到乳酸钙。实施例4-一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，包括如下步骤：（1）蛋壳粉的预处理：将新鲜的蛋壳用蒸馏水冲洗，除去表面的污垢，以及膜上残留的蛋清液，使用1mnacl溶液浸泡2h后用蒸馏水冲洗，接着用100mmedta，ph8.5浸泡2h，25℃烘干。将烘干后的蛋壳经粉碎机短时（10s）粉碎，用200目筛分出的蛋壳粉与水料液比1:10，600rpm搅拌15min，溶液经抽滤烘干得到蛋壳粉；（2）培养基及培养条件：①液体活化培养基（g/1000ml）mrs肉汤培养基：葡萄糖20.0g，牛肉粉8.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉4.0g，乙酸钠5.0g，吐温801.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，蒸馏水1000ml，ph值6.5±0.2（25℃），118℃灭菌15min。②发酵培养基（g/100ml）pyg发酵培养基：蛋壳粉10g、葡萄糖13g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母提取物1.0g，盐溶液4ml，蒸馏水100ml；其中盐溶液的成分为nahco310.0g，nacl2.0g，无水cacl20.2g，k2hpo41.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.48g，定容至1000ml，121℃灭菌15min；（3）利用固定化细胞制备乳酸钙，其步骤如下：①菌种的活化将冻于-80℃冰箱中的蒙氏肠球菌从保藏状态恢复到室温状态，在无菌条件下吸取100μl于mrs肉汤培养基，37℃厌氧培养24h进行活化，活化2-3次；②菌体细胞的收集将经过活化后的菌种接到摇瓶培养基中，其接种量为2%，于37℃、180r/min振荡培养11h，然后将发酵液于10000r/min离心10min收集菌体细胞；③细胞的固定化将所收集到的蒙氏肠球菌菌悬液（2ml）与等体积（1:1v/v）的海藻酸钠溶液混合并搅拌5min，海藻酸钠的浓度为20g/l，将混合溶液置于注射器（5ml）中并使其逐滴滴入100ml20g/lcacl2溶液中，并将小球放在37℃下硬化30min，然后用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4℃下保存备用；④发酵培养将固定化的蒙氏肠球菌接种于发酵培养基中，于摇床中发酵培养，其发酵温度为37℃、摇床的转速为180r/min、发酵时间为72h；⑤重复发酵培养结束后，用无菌纱布由发酵培养基过滤分离出固定化蒙氏肠球菌，并向固定化蒙氏肠球菌中重新加入等体积的发酵培养基，培养条件同步骤④，得到乳酸钙。实施例5-根据实施例4的一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，其中，在细胞的固定化步骤中，将所收集到的菌悬液与等体积的含聚乙烯醇（70g/l）和海藻酸钠（10g/l）的溶液混合，并使用灭菌注射器（5ml）将混合溶液滴入cacl2（20g/l）溶液中以形成小球，小球在4℃下储存24h后，用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4℃下保存备用；其余步骤均与实施例4相同，得到乳酸钙。实施例6-根据实施例4的一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，其中，在细胞的固定化步骤中，将所收集到的菌悬液与等体积的含活性炭（20g/l）和海藻酸钠（30g/l）的溶液混合，并使用灭菌注射器（5ml）将混合溶液滴入cacl2（20g/l）溶液中以形成小球。小球在4℃下储存24h后，用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4℃下保存备用；其余步骤均与实施例4相同，得到乳酸钙。、扫描电镜(sem)分析利用扫描电子显微镜（sem）观察固定化细胞的微观结构。其处理步骤如下：将不同材料的固定化细胞置于2.5%的戊二醛溶液中4℃固定6h，然后用无菌蒸馏水洗涤固定化细胞3次，每次10min，以去除戊二醛。洗涤后样品依次浸泡于30%、50%、70%和90％的乙醇溶液中进行梯度脱水，每个梯度洗涤一次，每次10min，最后用无水乙醇洗涤2次，每次15min，以移除最后的水分。将充分脱水后的样品于冷冻干燥仪中进行干燥，干燥后样品粘在具有双面胶带的样品台上固定、喷金，最后使用扫描电镜进行观察，图1~3为实施例4、实施例5、实施例6中不同包埋材料固定化细胞的微观结构。、不同包埋材料的机械强度及传质系数的测定机械强度测定：采用质构分析仪测定探头：p6；触发值：0.005n；压缩比：75%；测前速度、测试速度、测后速度均设为1.0mm/s进行测试，实验结果取平均值。传质系数的测定：无菌条件下，在锥形瓶内装有100ml1mg/ml的葡萄糖溶液，并随机取30粒固定化小球浸泡，37℃浸泡24h，并于540nm下采用dns法测定浸泡前后锥形瓶中葡萄糖溶液吸光值的变化，前后葡萄糖的吸光值比值即为传质系数。实施例4～6的机械强度值和传质系数测定结果见表1；表1:固定化材料的机械强度值和传质系数实验组机械强度（g）传质系数（%）实施例4153.67±15.170.18±0.01实施例5124.55±8.550.31±0.02实施例6149.57±8.650.18±0.003、乳酸钙含量的测定采用edta法测定乳酸：离心取上清液1ml，加蒸馏水50ml，加1mol/lnaoh4ml，钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/ledta.na2溶液至背光观察黄绿色荧光变为橙色为止，并记录edta.na2的体积，从而计算乳酸钙含量。实施例4～6的乳酸钙含量如表2所示，实施例6发酵液中乳酸钙的产量明显高于实施例4、实施例5发酵液中乳酸钙产量，三者均能够在70g/l以上。表2：发酵液中乳酸钙和残糖含量发酵时间72h乳酸钙含量（g/l）残糖含量（g/l）实施例496.33±3.1944.65±1.93实施例576.09±3.3854.19±1.07实施例6101.01±3.1325.50±1.074、残糖含量的测定采用dns法测定发酵液中残留的葡萄糖含量。葡萄糖标准曲线：用7支25ml比色管，分别加1mg/ml的葡萄糖标准液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，蒸馏水补至2ml，加入1.5mldns试剂摇匀，沸水浴5min，将试管冰浴至室温。蒸馏水定容到25ml，540nm下测od值。葡萄糖标准曲线如图4所示，实施例4～6的残糖含量如表2所示，实施例6发酵液中残糖含量明显低于实施例4、实施例5发酵液中残糖含量。、重复分批发酵测定每次发酵结束后，弃去发酵液，用无菌生理盐水清洗固定化细胞3-4次，然后重新倒入新鲜培养基在相同条件下进行下一批发酵。实例6的重复分批发酵结果如图5所示，在重复发酵18次后，乳酸钙产量仍无降低，且机械强度良好，无破损。、蛋壳粉含量对固定化细胞的机械强度的影响根据实施例4的一种固定化发酵蛋壳粉制备乳酸钙的方法，仅改变发酵培养基中蛋壳粉的加入量，即限定了蛋壳粉的加入量为0~14g，其余步骤均与实施例4相同，并分别检测不同蛋壳粉含量对固定化细胞的机械强度的情况，其结果如下表3，当限制蛋壳粉的加入量为8~12g时，其固定化细胞的机械强度明显提高，而随着蛋壳量的减少或增多，其对固定化细胞的机械强度影响明显减弱。注：同一列英文字母上标不同，表示均值存在显著性差异（p＜0.05）以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。当前第1页12