本发明属于石花菜技术领域，具体涉及一种石花菜多糖的制备方法。
背景技术：
石花菜别名海冻菜、红丝、凤尾，是我国重要的经济红藻之一，生于大干潮线附近及以下6～10m海岩上，常见于中国黄海、渤海沿岸，浙江、福建以及台湾沿海也有生长。石花菜中所含的多糖类物质已被证实具有抑菌、抗氧化、抗凝血等生物活性，有极高的“药食两用”价值。
在石花菜所含的多种生物活性物质中，石花菜多糖的含量高、用途广泛、可利用度高，尤其受到研究者的关注，作为石花菜多糖研究和利用的首要步骤，多糖的提取显得尤为重要。目前石花菜多糖的提取多依赖于水提醇沉的方法，耗时长且温度高，易引起多糖的降解，所提多糖质量远不及酶法等新型提取方法所得多糖。
利用复合酶法提取石花菜多糖，研究其适宜的提取条件，提高生产效率，是提高石花菜附加值的重要途径。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种石花菜多糖的制备方法，该方法生产周期短，效率高，多糖不易降解，且获得的石花菜多糖质量好。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种石花菜多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取石花菜干品进行预处理，再经超微粉碎和过筛，得石花菜粉末；
(2)在石花菜粉末中加入水，预热后再加入木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，酶解后再进行灭酶处理；
(3)灭酶后离心，弃渣，将上清液进行旋转浓缩；
(4)在旋转浓缩产物中加入无水乙醇进行醇沉处理；
(5)醇沉后离心，弃去上清液，将沉淀洗涤后冷冻干燥，即得石花菜多糖。
在上述石花菜多糖的制备方法中：
优选的，步骤(1)中所述石花菜干品预处理包括清洗、除杂和烘干。
优选的，过筛时过30～40目筛，更佳为40目筛。
优选的，步骤(2)中所述石花菜和水的质量体积比为1g：30～35ml，更佳为1g：32ml。
优选的，步骤(2)中预热时温度为50～60℃，更佳为50℃，预热时间为5～10min，更佳为10min。
在石花菜多糖的开发应用中，分离提取是关键的步骤之一，不仅影响着产品得率，直接关系经济效益，还与产品的活性价值有着密切的相关性。
在石花菜多糖的提取方法中，传统的热水浸提法操作时间长，并且细胞壁间的石花菜多糖较难渗出，而超声萃取、微波萃取、酸提或碱提等方法一定程度上会对多糖的立体结构造成破坏，降低其生物活性。
本发明采用了复合酶法提取技术，与传统的热水浸提法及单一酶法提取技术相比缩短了提取时间，可以更有效的提取石花菜多糖，从而节省成本，提高经济效益。
优选的，步骤(2)中所述木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶的添加量为石花菜粉末和水总质量的2.0～2.5％，更佳为2.3％，其中所述木瓜蛋白酶和纤维素酶的质量份配比为2：1。
本发明采用复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)法提取石花菜多糖，利用木瓜蛋白酶水解石花菜中的游离蛋白质，利用纤维素酶水解石花菜细胞壁中的纤维素，使得石花菜结构变得松散，促进细胞中的多糖溶出，显著缩短石花菜多糖的提取时间，节省能耗，大大提高提取效率，同时降低石花菜多糖粗提物中蛋白的含量，有利于石花菜多糖的纯化。
优选的，步骤(2)中酶解温度为55～65℃，更佳为60℃，酶解时间为2～2.5h，更佳为2h。
更佳的，本发明在单因素试验的基础上以复合酶添加量、提取温度和料液比为考察因素，石花菜多糖得率为响应值，采用响应面曲面设计方法，确定了石花菜多糖复合酶法提取的最佳工艺参数为复合酶添加量2.3％、提取温度60℃、料液比1:32g/ml，结果显示，按照本发明工艺参数对石花菜多糖进行提取2小时，石花菜多糖得率可达到15.98％。
优选的，步骤(2)中灭酶时采用沸水浴灭酶，灭酶时间为10～20min，更佳为15min。
优选的，步骤(3)中离心时转速为4000～5000r/min，更佳为4000r/min，离心时间为10～20min，更佳为10min。
优选的，步骤(3)中将上清液进行旋转浓缩至原体积的1/4～1/2，更佳为1/3。
优选的，步骤(4)中无水乙醇的加入量为旋转浓缩产物总体积的3～5倍，更佳为4倍，醇沉温度为4℃或室温，室温通常是指25℃；醇沉时间为8h或过夜，过夜一般是指12～16h。
优选的，步骤(5)中离心时转速为4000～5000r/min，，更佳为4500r/min，离心时间为10～30min，更佳为10min；将沉淀洗涤依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明方法与传统的热水浸提法相比提取石花菜多糖效率高、时间短；
(2)本发明方法不会像超声萃取、微波萃取、酸提或碱提等方法一定程度上会对多糖的立体结构造成破坏，降低其生物活性；
(3)本发明方法采用了复合酶法提取技术，与传统的热水浸提法及单一酶法提取技术相比缩短了提取时间，本发明与传统的热水浸提法相比，时间缩短了66％；与单一酶法提取相比，时间缩短了20％，更有效的提取了石花菜多糖，从而节省成本，提高经济效益；
(4)本发明方法采用复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)法提取石花菜多糖，能显著缩短石花菜多糖的提取时间，节省能耗，大大提高提取效率，同时降低石花菜多糖粗提物中蛋白的含量，有利于石花菜多糖的纯化；所得的石花菜多糖可广泛用做药品和保健食品的基料。
具体实施方式
下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。
以下实施例中石花菜干品优选购于山东省威海市鲲鹏海产有限公司，原料经反复清洗除去杂质后烘干，超微粉碎后过筛(40目)获得石花菜粉末备用，其它来源的石花菜干品也可以获得类似结果。
对比例1热水浸提法制备石花菜多糖
选择料液比、浸提温度与浸提时间做单因素试验；正交试验选择料液比、浸提温度与浸提时间为考察因素，以多糖得率为测定指标，l9(34)正交试验方法(表1)，确定石花菜多糖热水浸提的最佳工艺参数。
表1热水浸提正交实验及石花菜多糖得率
根据表1中的正交实验，获得料液比为1:40(m/v)，最佳浸提时间为6小时，浸提温度为100℃，按照该条件采用热水浸提法制备石花菜多糖的具体步骤如下：
(1)称取5g石花菜粉末，按1:40(m/v，单位g/ml，下同)料液比加水在100℃水浴中浸提6小时；
(3)在4000r/min条件下离心10分钟弃滤渣，旋转蒸发至原体积的1/3；
(4)加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12小时；
(5)在4500r/min条件下离心10分钟，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后进行冷冻干燥，即得石花菜多糖。
采用热水浸提法提取石花菜多糖时，多糖得率为15.87％，所用时间为6小时(指浸提时间)。
多糖得率按照以下的测定方法，下同：
采用苯酚-硫酸法测定石花菜多糖得率(定义为苯酚硫酸法计算得到的多糖质量占藻粉质量的百分比)。以葡萄糖为标准品，于490nm处测定吸光度并绘制标准曲线。经线性回归得标准曲线方程：a＝6.395x+0.0099，相关系数r2＝0.999；式中x为多糖质量浓度，单位mg/ml；a为吸光度。转化得石花菜多糖溶液中多糖的质量浓度：
多糖得率(％)＝((a-0.0099)×v)/6.395m×0.9×100
式中：a为苯酚硫酸法测定的多糖溶液吸光度；v为多糖溶液体积(ml)；m为石花菜藻粉质量(mg)；0.9为转化系数。
对比例2单一酶法提取方法
选择料液比、木瓜蛋白酶加酶量、提取温度、提取时间、ph值做单因素试验；在这五个单因素实验基础上选择了三个影响最大的做的正交试验如表2中所示正交试验选择加酶量、提取温度与提取时间为考察因素，以多糖得率为测定指标，l9(34)正交试验方法(表2)，确定石花菜多糖单一酶法提取的最佳工艺参数。
表2单一酶法正交实验及石花菜多糖得率
根据表2中的正交实验，获得最佳的加酶量为1.0％，提取温度为70℃，提取时间为2.5小时，按照该条件采用单一酶法制备石花菜多糖的具体步骤如下：
(1)称取5g石花菜粉末，按1:40(m/v)料液比加水在50℃预热10分钟，然后加入1.0％木瓜蛋白酶(m/v)于70℃下提取2.5小时，沸水浴灭酶15分钟；
(2)在4000r/min条件下离心10分钟弃滤渣，旋转蒸发至原体积的1/3；
(3)加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12小时；
(4)在4500r/min条件下离心10分钟，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后进行冷冻干燥，即得石花菜多糖。
采用单一酶法提取石花菜多糖时，多糖得率为15.38％，所用时间为2.5h。
以下实施例为采用本发明中的石花菜多糖的制备方法来提取石花菜多糖：
实施例1复合酶法提取方法
选择料液比、复合酶加酶量、提取温度做单因素试验；box-behnken试验选择加酶量、提取温度与料液比为考察因素，以多糖得率为响应值，通过响应面分析(表3)，确定石花菜多糖复合酶法提取的最佳工艺参数。
表3复合酶法box-benhnken设计方案及石花菜多糖得率
根据表3中的响应面分析，料液比为1：30～35(m/v)，复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)加酶量为2.0～2.5％，提取温度为55～65℃，提取时间为2～2.5h，此时获得的石花菜多糖得率较高，而料液比为1：32(m/v)，复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)加酶量为2.3％，提取温度为60℃，提取时间为2h，此时获得的石花菜多糖得率最高。
实施例2
本实施例提供的采用复合酶制备石花菜多糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取5g石花菜粉末，按1：32(m/v)料液比加水在50℃预热10分钟，然后加入2.3％复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)于60℃下提取2小时，沸水浴灭酶15分钟；
(2)在4000r/min条件下离心10分钟弃滤渣，旋转蒸发至原体积的1/3；
(3)加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12小时；
(4)在4500r/min条件下离心10分钟，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后进行冷冻干燥，即得石花菜多糖。
采用本实施例复合酶法提取石花菜多糖时，多糖得率为15.98％，所用时间为2h。
如表4所示，采用本发明与传统热水浸提法相比，石花菜多糖提取时间缩短66％，多糖得率提高与单一酶法相比，石花菜多糖提取时间缩短20％，多糖得率也有了提升。
表4本实施例与对照提取条件和多糖得率比较
实施例3
本实施例提供的采用复合酶制备石花菜多糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取5g石花菜粉末，按1：30(m/v)料液比加水在50℃预热10分钟，然后加入2.0％复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)于60℃下提取2.0小时，沸水浴灭酶15分钟；
(2)在4500r/min条件下离心20分钟弃滤渣，旋转蒸发至原体积的1/2；
(3)加入3倍体积的无水乙醇，4℃醇沉8小时；
(4)在4500r/min条件下离心20分钟，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后进行冷冻干燥，即得石花菜多糖。
采用本实施例复合酶法提取石花菜多糖时，多糖得率约为15.76％。
实施例4
本实施例提供的采用复合酶制备石花菜多糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取5g石花菜粉末，按1：35(m/v)料液比加水在55℃预热8分钟，然后加入2.5％复合酶(木瓜蛋白酶：纤维素酶＝2：1)于62℃下提取2.5小时，沸水浴灭酶20分钟；
(2)在5000r/min条件下离心15分钟弃滤渣，旋转蒸发至原体积的1/4；
(3)加入5倍体积的无水乙醇，4℃醇沉16小时；
(4)在5000r/min条件下离心10分钟，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后进行冷冻干燥，即得石花菜多糖。
采用本实施例复合酶法提取石花菜多糖时，多糖得率约为15.91％。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。