高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株及其应用的制作方法

本发明涉及一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251及其应用。(二)
背景技术：
：赤霉素(Gibbeerllins，GAs)是一种植物激素，广泛应用于农、林、园艺、食品酿造等诸多领域。其制备方法主要有植物提取法、化学法、微生物发酵法，然而微生物发酵法因其具有生产成本低和对环境污染小等优点，具有广阔的工业应用前景。霉素最早是由日本植物病理学家KenkichiSawada在研究水稻恶苗病中发现的，后来他的同事EiichiKurosawa证实了这一点，他于1926年发表了一篇论文，表明这种疾病的症状可以通过应用无菌真菌培养物来复制，他发现这些分泌物也会刺激除水稻以外的几种幼苗的生长。这一具有里程碑意义的出版物随后出现了大量有关分泌物质特性的报告，1935年，东京大学农业化学教授化学家TeijiroYabuta获得了具有高生物活性的纯化样品，称为赤霉素。赤霉素可促进种子发芽、植物生长使蔬菜水果增产；可作为植物生长调节剂，促进作物生长发育；拥有雌激素样活性，在发制品中能促进头皮血液循环。赤霉素GA3是一种二萜类酸，分子式C19H22O6，分子量346.37，熔点233-235℃，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氢钠溶液及pH为6.2的磷酸缓冲液，难溶于水和乙醚。GAs生物合成从GGDP开始经由异戊烯二磷酸(IPP)，在经过两次环化步骤从GGDP经由焦磷酸古巴酯(CPP)后，产生了贝壳杉烯。通过贝壳杉烯醇和贝壳杉烯醛在C-19上氧化产生贝壳杉烯酸，后氧化收缩，形成GA12-醛。GA12-醛羟基化生成GA14-醛，然后在C-7位氧化形成GA14，GA14通过氧化转化为GA4，GA4经去饱作用生成GA7，然后通过羟基化转化为GA3。1970年来我国筛选到高产变种“4303”，不过该菌无产孢子能力，且为多核菌丝，使继续选育十分困难。目前的生产效价呈现出徘徊不前的状态，而且有的生产菌种出现退化。中国的发明专利(公开号CN104892554A)描述了关于赤霉素GA3的制备方法，但未有报道高产赤霉素的藤仓赤霉菌及其应用，传统的菌株在产量上一直在1.8g～2g之间徘徊，有待于进一步提升。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251及其应用，该菌株可应用于工业化生产，在相同培养成本的条件下有更高的产素能力，可为工业化生产提供利润，在发酵后期杂质少，可减少提取分离工作。本发明采用的技术方案是：一株高产赤霉素GA3的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-251(FusariumfujikuroiGA-251)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M2019201，保藏日期2019年3月25日。本发明菌株的获得过程如下：1、制备原生质体，具体方法参照朱廷恒等赤霉菌原生质体外源基因高效转化方法研究(浙江工业大学学报，2013，41(5)，482-485)2、通过钴60-γ射线(Co60γ-射线)、氯化锂单因素诱变和复合诱变得到藤仓赤霉菌GA-251。所述水稻恶苗病菌GA-251的18srDNA序列如SEQIDNO.1所示。本发明还涉及所述的水稻恶苗病菌GA-251在微生物发酵制备赤霉素中的应用。具体的，所述水稻恶苗病菌GA-251用于微生物发酵制备赤霉素GA3。具体的，所述应用为：将所述水稻恶苗病菌GA-25接种至发酵培养基，20～30℃、200～300rpm条件下发酵培养12～48h，获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得赤霉素GA3。所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉60～90g/L，米粉70～100g/L，大豆粉3～7g/L，花生粉3～7g/L，K2SO40.3～0.7g/L，KH2PO40.3～0.7g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30min。优选的，所述水稻恶苗病菌GA-25先接种至斜面培养基，活化后的菌株接种至种子培养基经种子培养获得种子液再接种至发酵培养基，所述斜面培养基组成如下：土豆150～200g/L、蔗糖10～30g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、碳酸钙0.1～0.3g/L、琼脂20g/L，pH自然，115℃灭菌30min；所述种子培养基组成如下：玉米淀粉10～30g/L、蔗糖10～30g/L、花生粉10～30g/L、大豆粉10～30g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，pH自然，121℃灭菌30min。本发明有益效果主要体现在：1、本发明提供一株高产赤霉素的藤仓赤霉菌突变株，该菌株生长过程中不产生分生孢子；2、本发明提供一种赤霉素GA3的发酵方法，该方法采用可产生赤霉素GA3；本发明菌株接种到液体种子培养基中，待细胞长成熟后，转接到发酵培养基中，发酵水平大幅度提高，赤霉素产率达到野生菌的21倍，为国际领先。赤霉素在胞外分泌，可直接从发酵液汇总获取，有利于固液分离，提取收率升高。同时，提高了设备和原料的利用率，大大降低了生产成本，具有显著的经济效益与社会效益；3、采用本发明，能在现有制药生产设备上实施，无额外投资。(四)附图说明图1为菌株18SrDNA序列PCR扩增argrose电泳图。图2为电镜观察下的菌丝体形态。图3为发酵液中GA3含量变化。图4为发酵液中pH变化。图5为GA-251发酵干重变化。图6为GA3高效液相色谱(HPLC)检测标准曲线。图7为不同发酵温度对菌株GA-251GA3产生的影响(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：野生藤仓赤霉菌原生质体制备(1)斜面的制备：将野生藤仓赤霉菌菌株接种至斜面培养基中，28℃培养3～7天，待气生菌丝长满斜面可转接至种子液。(2)种子液的制备：挑取步骤(1)中的一小块菌接种至种子培养基中，28℃，250rpm培养48h，获得种子液。种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，溶剂为自来水，pH自然，121℃灭菌30min。(3)发酵培养250mL规格摇瓶装样40mL发酵培养基，发酵时按体积浓度1-4％接种种子液，28℃，250rpm发酵培养168h。发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉5g/L，花生粉5g/L，K2SO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。(4)原生质体制备从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基(酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％，溶剂为水)中，28℃、180rpm培养48个小时。取2ml菌液加入无菌Eppendorf管中，先后用无菌水、1MMgSO4各洗涤一次。用灭菌枪头蘸取少量菌丝至已过滤除菌的1.5mL破壁缓冲液(1MMgSO4、总酶浓度为15mg/mL，其中Dryslase：Yatalase＝3:7)中，吹打均匀，置于30℃水浴摇床中反应45分钟(原生质体产生率在95％以上)。5000rpm离心10分钟，转移上清0.75mL至另一离心管，加入等量的无菌水，混合均匀，6000rpm离心5分钟，弃上清。用1mL1M山梨醇将上述细胞沉淀充分悬浮，原生质体制备成功。经过镜检，可稀释适当倍数涂板于MYG培养基(麦芽糖0.5％，葡萄糖1％，酵母粉0.5％，蔗糖5M，琼脂2％，溶剂为水)进行原生质体复苏。对照用无菌水悬浮并稀释、涂板。通过血球计数板计数，测出单位体积内所含有的原生质体数。并将原生质体溶液稀释至106～107个/mL。实施例2：高产GA3突变株的筛选(1)将野生型藤仓赤霉菌接种至斜面培养基，28℃培养3～7天，从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基(酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％，溶剂为水)，用无菌水和盐缓冲液洗涤一次，取少量菌丝加入破壁缓冲液，置于30℃水浴摇床中反应45分钟，3000rpm离心10min，弃上清用无菌水洗一次后加入缓冲液悬浮。(2)Co60诱变方法：将步骤(1)活化的菌株涂布于MYG固体培养基(麦芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、蔗糖5M、琼脂2％)，28℃培养3-7天至长出菌落，通过步骤(1)制备原生质体，控制菌数约为107个/mL，以不同的剂量(0Gy、200Gy、400Gy、600Gy、800Gy和1000Gy)的Co60对原生质体进行诱变。将经Co60诱变的原生质体用生理盐水稀释至10-5后涂板于MYG平板培养基，30℃培养5天，初步筛选菌落大菌，气生丝密集的菌株，挑取单菌落，进行发酵，收集发酵液通过HPLC方法检测产量，直至获得高产GA3突变株。突变次数、突变率和致死率如表1所示。表1：Co60诱变方法诱变过程(3)LiCl-Co60诱变方法：将步骤(1)制备好的原生质体悬液5mL置于无菌ep管中，经过步骤(2)后，使用LiCl处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用含1mg/mL氯化锂(LiCl)用1M山梨醇缓冲液搅拌0.5h，6000rpm离心5min，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在MYG固体培养基中，28℃培养，初步筛选菌落大菌，气生丝密集的菌株，挑取单菌落，进行发酵，收集发酵液通过HPLC方法检测产量，直至获得高产GA3突变株。突变次数、突变率和致死率如表2所示。表2：紫外-亚硝基胍复合诱变过程对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行复合诱变。最终筛选获得GA3产量达2～4g/L的突变株GA-251，命名为藤仓赤霉菌(Fusariumfujikuroi)GA-251，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2019年3月25号，保藏编号CCTCCNO：M2019201，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明包含但不仅限于上述三种诱变方式。其中MYG固体培养基的配制：麦芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、蔗糖5M、琼脂2％，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌20min。YEPD培养基的配制：酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌20min。实施例3：18SrDNA分子鉴定(1)DNA提取：取菌丝离心，取少量放入1.5mLEP管中，加入978μLsodiumphosphatebuffer，悬浮菌体；将菌悬液转移至LysingMatrixETube中，加入112μLMTBuffer混匀；使用MP均质破碎仪破碎细胞，速度设定为6.0，时间设定为40s；12000rpm离心LysingMatrixETube10min，去除样品碎屑；将上清液转移至新的EP管中，加入250μLPPS试剂，手持离心管晃动10次以混匀，12000rpm离心5min；将上清转移至10mL干净离心管中，加入1mLBindingMatrixsuspension，将离心管上下颠倒2min，静置3min，使DNA附着于BindingMatrix上，并等待二氧化硅基质沉淀；小心移除500μL上清(避免吸出沉淀)，将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μL混合液移入SPINFilter中，12000rpm离心1min，弃滤液，再将剩余液体都转移至SPINFilter，离心弃滤液；加500μLSEWS-M溶液，12000rpm离心1min弃滤液，再将SPINFilter离心2min，将SPINFilter转移至新的catchtube，敞开室温干燥5min；加入50μLDES溶液，室温静置1min，并12000rpm离心1min，catchtube中的滤液即为所提取的菌种的基因组。(2)真菌18SrDNA的PCR扩增和序列分析：真菌核糖体ITSrDNA通用引物所用引物如下：ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’其中克隆PCR体系：加入10×TaqBuffer(Mg+)5μL，加入10mMdNTPs1μL，TaqDNAPolymerase0.5μL，ITS1和ITS4引物各0.5μL，模板1.5μL，补足去离子水至50μL。其中克隆PCR程序：95℃变性45s，55-60℃退火30s，72℃延伸45min，共35个循环。最后72℃延伸30s。(3)取5μLPCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳实验，用凝胶成像仪观察分析。若条带清晰且大小无误(500bp左右)，则对PCR产物进行凝胶回收。回收产物再各取5μL进行琼脂糖凝胶电泳验证，若条带清晰且大小无误，则回收样品可用于测序。测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，测序引物与PCR引物相同。使用NCBIblast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行序列比对。测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，结果如下(SEQIDNO.1)：ggtccggccgggcctttccctctgtggaaccccatgcccttcactgggtgtggcggggaa60acaggacttttactgtgaaaaaattagagtgctccaggcaggcctatgctcgaatacatt120agcatggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctaggaccgccgta180atgattaatagggacagtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttgga240tttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaac300gaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccg360actagggatcggacggtgttattttttgacccgttcggcaccttacgagaaatcaaagtg420cttgggctccagggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggc480accaccaggggtggagcctgcggcttaatt510获得的序列与genBank中保存的数据进行相似性分析发现，本实验所鉴定微生物与Fusariumfujikuroi同源性最高(homology,99％/510bp,basedon18SrDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18SrDNA序列的同源性高于99％，鉴定菌基本属于对照菌。实施例4：生理生化鉴定利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对95种碳源的代谢情况：将菌株接种于PDA平板培养基，28℃恒温培养5d，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(FF-IF)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至75％T/FF(参考值：75％±3％)。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在BiologFF微孔鉴定板的各孔中，每孔100μl。将微孔鉴定板放在28℃培养箱中，分别在培养24h、48h、72h、96h、168h和240h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。综合考虑Biolog读数仪读取的各时间点数据，给出24h鉴定结果。将野生菌种按照上述方法进行生理生化鉴定，利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对95种碳源的代谢情况，综合考虑Biolog读数仪读取的各时间点数据，给出24h鉴定结果，见表3。表3：菌株GA-251对BiologFF板上95种碳源的利用能力Notes:+,positive；-,negative；B,borderline实施例5：高产GA3菌株电镜观察(1)菌种培养：用接种环挑取斜面保藏菌种液，PDA平板划线，28℃培养5d，挑取长好的菌种块接入种子培养基，250rpm，28℃培养2d，待处理。(2)菌体处理：(a)取1mL菌丝种子液分装在2.5％戊二醛中，4℃冰箱过夜放置。(b)第二天将过夜的菌体4000-5000rpm离心2min。(c)加磷酸缓冲液每隔15min后吸出缓冲液，尽量不要吸出菌体，缓冲液量随意，重复三次。(d)加锇酸，静置1.5h。(e)重复步骤b。(f)加30％、50％、70％、80％、90％、95％的乙醇，每隔15min吸出乙醇。(g)加入无水乙醇，保存，SEM观察。将土豆平板(PDA)上28℃培养5d的GA-251菌株按所述方法处理，进行SEM扫描电镜分析，结果如图2。采用型号为SU-8010SEM扫描电镜，图中的放大倍数为1000倍，在扫描电镜下观察菌株的形态特征为菌丝光滑，密集，纵横交错。实施例6：突变菌GA-251发酵产GA3(1)斜面的制备：将实施例1制备的高产赤霉素的藤仓赤霉菌突变株接种至斜面培养基中，28℃培养3-7天，待气生菌丝长满斜面可转接至种子液。(2)种子液的制备：挑取步骤(1)中的一小块菌接种至种子培养基中，28℃，250rpm培养48h，获得种子液。种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min。(3)发酵培养250mL规格摇瓶装样40mL发酵培养基，发酵时按体积浓度1-4％接种种子液，28℃，250rpm发酵培养168h。发酵过程中，其发酵液中GA3含量变化如图3，发酵液中pH变化如图4；突变菌干重变化如图5。发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉6g/L，花生粉5g/L，K2SO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。上述突变菌通过摇瓶发酵生产，按照实施例7方法检测，所得发酵液中GA3含量为2100mg/L。实施例7：GA3的HPLC检测方法取实施例6方法制备的发酵液，按发酵液离心，12000rpm离心5min，取上清用0.45μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。检测方法：色谱柱为C18柱(150×4.6mm)，柱温32℃，流速0.6mL/min，进样量20μL，色谱保留时间30min，检测波长为210nm。GA3的出峰时间为14min。其中流动相配制方法：0.5mL磷酸用水稀释到1L，取该溶液600mL与400mL甲醇混合；GA3产量计算方法：从BBILifeSciences公司购买GA3的标准品，用甲醇配制不同浓度(0mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L)的GA3标准溶液，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和GA3标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝28123X-50.41，R2＝0.999(其中Y为GA3的浓度，X为峰面积)。将未知浓度的GA3样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出浓度，标准曲线结果如图6所示。实施例8：摇瓶发酵体系发酵温度优化将实施例5中发酵温度分别改为25℃、28℃、30℃、32℃、37℃，其它操作同实施例6，按照实施例7检测方法检测发酵液GA3，结果如图7所示。发酵温度在28℃最佳，于168小时达到最高产量约2.1g/L。当温度超过30℃时，GA3产量低于最佳温度的产量。序列表<110>浙江工业大学<120>高产赤霉素GA<sub>3<sub>的藤仓赤霉菌突变株及其应用<160>1<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>510<212>DNA<213>Fusariumfujikuroi<400>1ggtccggccgggcctttccctctgtggaaccccatgcccttcactgggtgtggcggggaa60acaggacttttactgtgaaaaaattagagtgctccaggcaggcctatgctcgaatacatt120agcatggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctaggaccgccgta180atgattaatagggacagtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttgga240tttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaac300gaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccg360actagggatcggacggtgttattttttgacccgttcggcaccttacgagaaatcaaagtg420cttgggctccagggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggc480accaccaggggtggagcctgcggcttaatt510当前第1页1 2 3