扩张型心肌病致病基因TTN75250位点突变及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种突变基因及应用，特别涉及人扩张型心肌病致病基因ttnc.75250c>t突变及在扩张型心肌病诊断及治疗中的应用。
背景技术：
：扩张型心肌病为进行性疾病，临床特征为左或右心室或双侧心室扩大，心肌肥大、心肌间质纤维化、心内膜纤维化等。该病临床表现多样化，部分患者会伴有房颤、室上性心动过速、短阵室性心律失常、房室传导阻滞、心脏骤停、不明原因猝死、房间隔缺损、双心室扩张、s型室间隔形状、同心双心室肥大和左室致密化不全等症状。扩张型心肌病的致病原因与感染、免疫、代谢、心肌缺血、中毒及遗传因素有关。发病率为1.1-1.2/10万，婴儿的发病率高。过去认为大多数扩张型心肌病病例是散发或特发的，但现在发现家族性的至少占40%～60%。扩张型心肌病的遗传方式主要为：常染色体线性遗传约为90%，x染色体连锁遗传约占5%-10%，其他遗传方式如常染色体阴性遗传和线粒体遗传的患者也有少量报道。目前通过家族性扩张型心肌病连锁分析已定位26个连锁染色体区段，发现超过30多个致病基因，主要包括心肌肌节蛋白基因、z盘蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、钙调蛋白基因及其他基因。本发明通过新一代高通量测序技术检测全基因组方位内基因外显子区域突变发现了扩张型心肌病新的致病基因突变，该突变可以作为扩张型心肌病临床诊断分子标志物，还可作为扩张型心肌病新型药物研发的靶点。技术实现要素：本发明的目的是寻找并公开了扩张型心肌病新致病基因。本发明的另一个目的是提供用于扩张型心肌病新致病基因ttnc.75250c>t突变检测的试剂盒。本发明是通过如下技术方案来实现的：本发明发明采用新一代高通量测序技术检测扩张性心肌病家系全基因组范围内外显子区域基因突变，发现ttn基因（nm_001267550）外显子326存在1个无义突变（p.r25084x）与扩张型心肌病有关。本发明接下来设计合成ttnc.75250c>tsanger测序的pcr引物，提取扩张型心肌病家系成员外周血dna，通过sanger测序验证ttnc.75250c>t与扩张型心肌病关系。本发明所述的ttnc.75250c>t可以作为扩张型心肌病临床诊断分子标志物。本发明所述的ttnc.75250c>t可以作为扩张型心肌病新型药物研发的靶点。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.本发明找到了了一种扩张型心肌病新的致病疾病ttnc.75250c>t。2.本发明公开了扩张型心肌病新的致病疾病ttnc.75250c>tsanger测序检测试剂盒。3.本发明ttnc.75250c>t可以作为扩张型心肌病风险预测及临床诊断分子标志物。4.本发明ttnc.75250c>t可以作为扩张型心肌病新型药物研发的靶点。附图说明图1扩张型心肌病家系图。具体实施方式本发明实施例中所用的实验材料、试剂及试剂配方如下：主要实验材料：1.人外周血标本：本发明涉及的扩张型心肌病家系的外周血。2.引物：本发明所有引物均在生工生物(上海)股份有限公司合成。主要试剂：1.dna提取、建库及高通量测序试剂：dneasyblood&tissuekitdna提取试剂盒购自qiagene公司，kapahtplibrarypreparationkit试剂盒购自illumina公司，nimblegenseqcapezhybridizationandwashkit试剂盒购自roche公司，nimblegenseqcapezchoicelibrary试剂盒购自roche公司，kapa2×hifilibraryamplificationkit试剂盒购自illumina公司。2.sanger测序试剂：sapmix购自thermofisherscientific，测序试剂（bigdye）及甲酰胺（hi-di）购自abi。下面详细介绍具体实施方式。实施例1家系图绘制及样本收集1、家系图绘制收集整理该家系成员的基本信息，患病状态，绘制家系图。家系图见图1。共收集该家系80位成员信息，先证者在家系图中位置为ⅲ5，男性，45岁。2、样本收集收集扩张型心肌病先证者及其家系成员的外周血样本。共收集外周血样本12例，他们在家系图中的位置见表1。表1扩张型心肌病家系外周血标本信息编号位置性别年龄患病状态1ⅲ5男45患病2ⅲ12女48患病3ⅲ25男38患病4ⅲ28男43患病5ⅲ30男36未患病6ⅲ31女40未患病7ⅳ5男24未患病8ⅳ12男13未患病9ⅳ33男12未患病实施例2新一代高通量测序技术检测扩张性心肌病家系全基因组范围内外显子区域基因突变本实施例选择先证者(ⅲ5)及其家系成员对照样本(ⅲ31)进行新一代高通量测序鉴定扩张型心肌病致病基因。具体实施方法如下：1、dna提取(1)取血液300ul，放入1.5ml的离心管中。加180ulbufferatl，加20μlproteinasek，震混离心，放在56℃至完全消化，进行第二步。(2)加200µlbufferal，震混离心，放在56℃10min。(3)加200µl乙醇(96–100%)，震混离心。(4)将上一步所得溶液转入吸附柱中，离心机6000g离心1min，弃废液及收集管。(5)将吸附柱放在新的2ml收集管中加500µlbufferaw1，离心机中6000g离心1min，弃废液及收集管。(6)将吸附柱放在新的2ml收集管中加500µlbufferaw2，离心机中20,000g离心3min，弃废液及收集管。(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml或2ml的离心管中。(8)洗脱dna：向吸附膜的中间部位加200µlbufferae，室温（15～25℃）放置1min，离心机中6000g离心1min。(9)浓度检测：使用qubit3.0进行浓度测定，合格后，进行文库制备。2、文库制备：(1)小片段文库制备a)样本准备：取200-1000ng的gdna样本，用ddh2o将体积补足58ul，然后打断。b)末端修复：按照如下体系配置末修mix，加入样本后将1.5ml离心管置于20℃thermomixer中温浴30min，反应结束后使用1.7×agencourtampurexpreagent进行纯化，然后立即进行下步实验。c)加a：按照下表配置加amix，加入上步末修纯化产物后，将1.5ml离心管置于30℃thermomixer中温浴30min，反应结束后使用1.8×agencourtampurexpreagent进行纯化，然后立即进行下步实验。d)加adaper：mix配制完成后，加入上步加a纯化产物，震荡混匀离心，将1.5ml离心管置于20℃thermomixer中温浴15min。反应结束后使用1.0×agencourtampurexpreagent进行纯化，最后溶解在22uleb中。使用qubit3.0检测连接产物浓度。试剂名称加入体积加a纯化后产物beadswithdna30μl5xkapaligationbuffer10μlkapat4dnaligase5μladapter5μltotalvolume50μle)pcr反应：按如下体系配置pcr体系并上机扩增。试剂名称加入体积加adapter纯化后产物20μl2xkapahifihotstartreadymix25μl10xkapalibraryamplificationprimermix5μltotalvolume50μlf)pcr产物的纯化回收：使用1×agencourtampurexpreagent纯化回收反应体系中的dna，溶于25ul的ddh2o中。小片段文库制备完成。(2)外显子文库制备a)杂交：将文库及对应p7引物进行pooling，加入封闭序列及p5引物后抽干；加入杂交buffer及探针（外显子芯片），杂交64-72hs；b)杂交后捕获：配置洗脱试剂，进行洗脱操作；c)捕获后扩增：按照kapa扩增试剂盒要求，配置pcr体系，并上机进行扩增富集，扩增产物使用0.9×agencourtampurexpreagent纯化回收，溶于25ul的eb中。文库制备完成，准备进行下步文库质控。3、文库质控(1)准备凝胶染料mix；(2)在2100芯片中加入凝胶染料mix；(3)在2100芯片中加入markers；(4)在2100芯片中加入ladder和样本，并上机运行；(5)数据处理及分析。4、文库上机仪器类型：illuminahiseqx-ten，上机流程：参照illumina《illuminahiseqx-tensystemguide》进行，步骤如下：(1)准备一个新的试剂夹盒：解冻并检查；(2)准备一个新的流动槽：置于室温下，打开包装并检查；(3)稀释文库并使其变性；(4)将稀释文库装到试剂夹盒中；(5)从软件界面选择sequence（测序），启动运行设置步骤；(6)装入流动槽；(7)清空并重新装入废试剂容器，装入缓冲液夹盒和试剂夹盒；(8)查看运行参数和自动检查结果，选择start（开始）；(9)通过控制软件界面、basespace上的“run（运行）”选项卡或使用sequencinganalysisviewer的联网计算机监控运行。(10)测序完成后，仪器自动清洗。5、基因数据分析经过集分子生物学注释、生物学、遗传学及临床特征分析为一体的遗传病精准诊断云平台系统分析筛选，结合致病突变数据库、正常人基因组数据库、已知的四千种遗传病临床特征数据库及基因数据分析算法，对数十万个基因变异进行分级，变异分级采用三要素分级体系。遗传变异的致病性评估主要依据美国医学遗传学及基因组学学会（acmg）于2015年发布的《序列变异解读标准和指南》。6、实验结果经过数据分析，本实施例发现1个致病可能性较高的基因变异和2个致病证据不充分但不排除致病可能的变异。结果如下：(1)致病可能性较高的基因变异表2扩张型心肌病致病可能性较高的基因变异该ttn变异基于omim、hgmd、clinvar数据库未发现疾病相关性报道，属于新致病基因。在正常人数据库(dydf、dbsnp、千人基因组、千人南方、千人北方、exac)中未见收录。该变异为截断突变，该变异先证者为杂合子，对照家系成员为野生型，符合常染色体显性遗传发病机制。(2)致病证据不充分，但不排除致病可能的变异表3扩张型心肌病致病证据不充分但不排除致病可能的基因变异实施例3sanger测序验证本实施采用sanger测序技术对实施例2种发现的候选致病基因在实施例1收集的样本中进行验证。具体实施方法如下：1、dna提取(1)取血液300ul，放入1.5ml的离心管中。加180ulbufferatl，加20μlproteinasek，震混离心，放在56℃至完全消化，进行第二步。(2)加200µlbufferal，震混离心，放在56℃10min。(3)加200µl乙醇(96–100%)，震混离心。(4)将上一步所得溶液转入吸附柱中，离心机6000g离心1min，弃废液及收集管。(5)将吸附柱放在新的2ml收集管中加500µlbufferaw1，离心机中6000g离心1min，弃废液及收集管。(6)将吸附柱放在新的2ml收集管中加500µlbufferaw2，离心机中20,000g离心3min，弃废液及收集管。(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml或2ml的离心管中。(8)洗脱dna：向吸附膜的中间部位加200µlbufferae，室温（15～25℃）放置1min，离心机中6000g离心1min。2、扩增pcr：根据ttn基因所验证位点序列设计引物，采用pcr方法进行扩增。pcr反应条件为：95℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃链延伸30s，扩增30个循环；最后72℃补充延伸10min。pcr的体系均为50μl。引物序列见表1。表4ttn基因所验证位点分析引物序列3、pcr产物酶解：使用sapmix对扩增产物进行纯化。取pcr产物3μl，加入2μlsapmix，混匀。将反应管放到pcr仪运行酶解程序。酶解程序为：37℃60min，80℃15min，4℃保存。4、测序pcr：测序引物采用采用pcr扩增引物reverseprimer，引物序列见表1。选取pcr酶解产物3μl，测序试剂（bigdye）1μl和测序引物2μl进行pcr反应。pcr反应条件为：95℃变性1min;95℃变性10s,50℃退火5s，60℃延伸1min，扩增25个循环；最后4℃保存。5、测序产物纯化：(1)在每孔加入16μl醋酸钠-乙醇混合物（3mnaac：无水乙醇=1:15），剧烈震荡，避光静置15min，4℃12000g离心30min，吸去上层液体。(2)加入70μl70%遇冷乙醇，剧烈震荡，4℃12000g离心15min，吸去上层液体。(3)加入70μl70%遇冷乙醇，温和颠倒数次混匀，4℃12000g离心5min，吸去上层液体。(4)让酒精在室温挥发干净，加入10μlhi-di溶解dna。(5)变性：95℃变性2min，4℃保存，准备上机检测。6、上机检测：使用abi3500测序仪对纯化产物进行毛细管电泳。7、序列分析：基因序列分析采用dnastar软件进行序列分析和比对。8、实验结果sanger测序验证结果见表5。在本家系样本中，所有患有扩张型心肌病样本均携带ttnc.75250c>t突变，而所有的未患病样本均不携带ttnc.75250c>t突变，为野生型cc，进一步证实实施例2中二代测序发现的该基因为扩张型心肌病致病基因。该变异可导致生物多肽链的编码提前终止，该变异尚未见文献报道，为扩张型心肌病新的致病基因。尽管实施例2中鉴定myh6c.3883g>c和dspc7916g>a为致病可能的变异，但在本家系其他样本sanger测序鉴定中，ⅲ12、ⅲ25、ⅲ28患病样本检测均为野生型（gg），说明这两个变异不是扩张型心肌病的致病基因。表5扩张型心肌病候选致病基因sanger测序验证结果当前第1页12