T细胞大批量生产的方法与流程

本发明属于细胞医疗技术领域，具体涉及一种t细胞大批量生产的方法。

背景技术：

随着car-t技术的发展与成熟，基于t细胞的个性化医疗已经逐渐为大众接受并成为对抗肿瘤的重要手段。当前国内的t细胞生产还是以传统的2d培养模式为主，3d培养也已经陆续开展，由于3d培养可以有效节约生产空间与降低生产成本，使得3d培养对于t细胞的大规模应用具有重要意义。

利用中空凝胶纤维管或凝胶囊对t细胞包裹后进行培养，将t细胞保存在凝胶内使其免受剪切力损害，可以提高单位体积内的t细胞密度，使t细胞培养产量极大提升。但是，t细胞移植具有个体特异性(hla)，不能对单一t细胞进行大规模培养，只能采用大批量小产量的生产模式，这样就造成了自动化生产与单种t细胞需求量较少之间的矛盾，造成自动化生产单种t细胞的成本过高，不能有效进行t细胞自动化生产，尽管自动化生产能够保证t细胞生产质量的稳定性。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术不足，提供了一种t细胞大批量生产装置及其方法，该装置可以大批量小产量地生产t细胞，能够保证t细胞的生产稳定性，能够降低t细胞的单种生产成本。

本发明的构思是：在一个模拟细胞外基质的凝胶中培养t细胞，通过凝胶包裹实现t细胞的高密度培养，通过自动补充营养与氧气和排出代谢废物使t细胞能够快速稳定地增殖；由于实现了t细胞的高密度培养，单一的t细胞培养装置非常小，可以在一个总集成培养系统中安装数十个、甚至上百个t细胞培养装置，实现t细胞大批量小产量的自动化生产模式，有效降低单种(hla)t细胞的生产成本，具体方案如下：

本发明还提供了一种上述t细胞大批量生产的方法，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)将t细胞包裹在模拟细胞外基质的海藻酸钠胶管中，通过调节钙离子浓度使海藻酸钠固化形成凝胶管；

(2)将凝胶管装载到不同的且并联的t细胞培养巢内，携带氧气与二氧化碳的营养液在系统压力趋动下主动通过每个独立t细胞培养巢的营养液输入管道的控制阀门进入到并联的t细胞培养巢内；

(3)营养液在t细胞培养巢对t细胞进行培养，代谢产物和剩余的营养液由营养液回收管道排出；

(4)营养液通过营养液输送管道上串联的气体交换器为营养液提供氧气与二氧化碳调节；

(5)通过调控阀门调节t细胞培养巢压力对t细胞进行压力训练，提高t细胞的耐压能力及入血后的成活率，t细胞扩增培养后收集即可应用。

优选的是，培养时设置的培养条件为：压力60-180mmhg，温度36.5-37.5℃，含氧量10-20ml/100ml培养液，二氧化碳45-55ml/100ml培养液。

本发明提供了一种用于大批量生产t细胞的t细胞大批量生产装置，包括若干t细胞培养巢，若干所述t细胞培养巢通过并联的方式连接，所述t细胞培养巢下端设置营养液输入管道，所述t细胞培养巢上端设置营养液回收管道，所述营养液输入管道与营养液输入总线连接并为培养的t细胞提供营养与氧气，所述营养液回收管道与营养液回收总线连接，所述营养液输入管道上设置气体交换器，所述气体交换器由气体交换膜分成液体区和气体区且液体区的两个开口串联在营养液输送管道中、而气体区分别设置气体输入管道和气体回收管道并分别与气体输入总线和气体输出总线连接。

优选的是，所述t细胞培养巢内设置气体传感器和t细胞代谢物传感器，所述气体传感器和t细胞代谢物传感器与数据接口连接。

在上述任一方案中优选的是，所述营养液输入管道和营养液回收管道上设置控制阀门。

在上述任一方案中优选的是，营养液输送管道中串联设置气体交换器，所述气体交换器的内部设置有气体交换膜并将气体交换器分为气体区与液体区，气体交换器的液体区直接串联在营养液输送管道中，而气体交换器的气体区通过气体交换膜与气体交换器的液体区分隔开，气体交换器的气体区设置气体输入管道和气体回收管道并透过气体交换膜为气体交换器的液体区内营养液提供氧气与二氧化碳。

在上述任一方案中优选的是，所述气体输入管道和气体回收管道上设置控制阀门。

在上述任一方案中优选的是，所述气体交换器可以与每个独立的t细胞培养巢串联并为t细胞生长提供氧气与二氧化碳，也可以串联在营养液循环管道上集中供给氧气与二氧化碳。

在上述任一方案中优选的是，所述营养液循环管道上设置循环泵。

t细胞培养巢是由盖子封闭的聚丙烯材质管子，管子下方有一个带有鲁尔接头的开口，盖子也是聚丙烯材质，有一个鲁尔接头的开口和一个安装传感器的密封接口，盖子与管子通过螺纹密封。

包裹细胞的材料主要是胶原蛋白、透明质酸、黏连蛋白、蛋白聚糖与生物相容性胶组成，胶液优选1-2％的海藻酸钠并通过钙化完成对细胞的包裹。

独立设置的t细胞培养巢需要连接四条总线，分别是营养液输入总线、营养液回收总线、气体输入总线、气体回收总线，只要在总集成培养系统中合理设置四条总线以及相应的控制阀门，每个独立的t细胞培养巢都可以并行接入总集成培养系统，实现t细胞的大批量自动化生产，具体的，每个t细胞培养巢都能够独立运行，通过管道与控制阀门分别营养液输入总线和营养液回收总线连接完成营养液的供给与排放，通过管道与控制阀门与气体输入总线和气体回收总线连接完成气体供给，保证每个t细胞培养单元都能够独立完成t细胞培养全过程，每个独立的t细胞培养巢在培养过程中不需要额外动力供给，仅依赖总线提供动力；气体传感器和t细胞代谢物传感器能够通过数据接口与控制平台配合完成t细胞增殖的营养与气体供给及代谢废物的排泄，t细胞培养巢安装于特制的安放底座中，特制的安放底座为t细胞培养巢提供安置位置且同时为t细胞生长提供恒温条件；t细胞培养巢上端通过管道与控制阀门与营养液回收总线连接，能够将t细胞代谢废物有效排出，下端直接与气体交换器连通，为t细胞生长提供新鲜营养液，t细胞培养巢内有气体传感器和t细胞代谢物传感器通过集成的数据接口与控制平台进行连接，完成t细胞培养的自动化控制；气体交换器由气体交换膜分成气体区与液体区两部分，气体区是无菌空气的流通区间，液体区是营养液的流通区间，可以通过调节无菌空气压力使氧气溶解在营养液中供给t细胞生长，气体交换器完成气体交换调控氧气与二氧化碳平衡，气体交换器可以与t细胞培养巢组装在一起，也可以集成统一进行营养液的气体交换；此外，本发明不仅仅局限于t细胞培养，也可以用于其他细胞种类需求大(hla特异性)、但细胞总量需求小的细胞培养，如：car-t、ips等。

与现有技术相比，本发明能够实现t细胞的大批量小产量生产，能够保证t细胞质量、能够有效降低生产成本，有效满足间t细胞市场需求。

附图说明

图1：独立的t细胞培养巢示意图；

图2：总集成培养系统及并列的t细胞培养巢示意图；

图3：简化的总集成培养系统示意图。

图中标注说明：1t细培养胞巢，2气体交换器，3控制阀门，4包裹t细胞的凝胶，5气体交换膜，6传感器组，7营养液输入管道，8营养液回收管道，9气体输入管道，10气体回收管道，11数据接口，12营养液循环管道，13循环泵，14加压泵，15营养液加液管道，16营养液回收总线，17营养液输入总线，18气体输入总线，19气体回收总线。

具体实施方式

为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。

如图1和图2所示，本发明提供了一种t细胞大批量生产的方法，利用并列排布大量t细胞培养巢1的总集成培养系统提供了一种t细胞大批量生产装置，包括若干t细胞培养巢1，若干所述t细胞培养巢1通过并联的方式连接，所述t细胞培养巢1上端设置营养液回收管道8，所述营养液回收管道8与营养液回收总线16通过控制阀门连接，所述t细胞培养巢1下端设置营养液输入管道7，所述营养液输入管道7与营养液输入总线17通过控制阀门连接，所述营养液输入管道7上独立设置气体交换器2且每个独立气体交换器2上的气体输入管道9分别与气体输入总线17通过控制阀门连接、每个独立气体交换器2上的气体输出管道10分别与气体回收总线18通过控制阀门连接，所述t细胞培养巢1内设置传感器组6，所述传感器组6包括气体传感器和t细胞代谢物传感器，所述气体传感器和t细胞代谢物传感器与数据接11连接；图2所示总集成培养系统中气体交换器2与每个独立的t细胞培养巢1直接串联并完成气体供给，可以满足并联的t细胞培养巢1中不同生长阶段t细胞的气体代谢需求差异。

如图3所示，本发明提供了一种t细胞大批量生产的方法，利用简化的总集成培养系统提供了一种t细胞大批量生产装置，包括若干t细胞培养巢1，若干所述t细胞培养巢1通过并联的方式连接，所述t细胞培养巢1下端设置营养液输入管道7，所述t细胞培养巢1上端设置营养液回收管道8，所述营养液输入管道7与营养液循环管道12通过控制阀门连接，所述营养液循环管道12与营养液加液管道15连接，所述加液管道15上设置加压泵14，所述营养液回收管道8与营养液回收总线16通过控制阀门连接，所述营养液循环管道12上设置气体交换器2，所述气体交换器2的两端分别设置气体输入管道9和气体回收管道10，所述气体输入管道9通过控制阀门与气体输入总线18连接，所述气体回收管道10通过控制阀门与气体回收总线19连接，所述t细胞培养巢1内设置传感器组6，所述传感器组6包括气体传感器和t细胞代谢物传感器，所述气体传感器和t细胞代谢物传感器与数据接11连接，所述营养液输入管道7、营养液回收管道8、气体输入管道9、气体回收管道10上设置控制阀门3，所述营养液循环管道12上设置循环泵13；图3所示简化的总集成培养系统中气体交换器2集中整合设置，串联在营养液循环管道12上，统一为各个独立的t细胞培养巢1进行气体供给，不再需要为每个独立的t细胞培养巢1配备气体交换器2，可以在总集成培养系统中设置更多的t细胞培养巢1，降低t细胞生产成本。

一种上述t细胞大批量生产的方法，主要包括以下过程：

s1将t细胞包裹在模拟细胞外基质的凝胶中；

s2将包裹t细胞的凝胶4装载到一个t细胞培养巢1中；

s3将t细胞培养巢1与传感器组6组装好，将营养液输入管道7通过控制阀门3与营养液循环管道12连接，将营养液回收管道8通过控制阀门3与营养液回收总线连接，将气体交换器2的气体输入管道9通过阀门与气体输入总线18连接，将气体交换器2的气体回收管道10通过阀门与气体回收总线19连接，将数据接口11与控制平台的相应接口连接；

s4营养液循环由循环泵13循环，加压泵14负责向营养液循环管道12注入营养液并保持营养液循环循环泵12具有恒定的压力；

s5在控制平台输入相应的培养参数，设备自动运行并完成t细胞培养，每个t细胞培养单元都是独立运行，为t细胞提供生长条件并排出代谢废物；

s6重复以上步骤可以进行其他(不同hla)t细胞自动培养；每个独立的t细胞培养单元都可以并行接入总集成培养系统，实现为t细胞的大批量自动化生产。

实施例1

一种上述t细胞大批量生产的方法，主要包括以下过程：

s1将t细胞包裹在模拟细胞外基质的海藻酸钠胶管中，通过调节钙离子浓度使海藻酸钠固化形成凝胶管；

s2将凝胶管装载到独立的(20毫升t细胞培养巢)t细胞培养单元中，安装在总集成培养系统的特制安放底座中；

s3按图1与图2将每个独立t细胞培养巢的四个管道接口分别与相应总线进行连接；

s4将t细胞培养单元的数据接口与总集成培养系统接口连接；

s5为特定的t细胞培养单元设定参数，由控制平台独立调控相应的t细胞培养单元自动进行t细胞培养，通过气体传感器和干细胞代谢物传感器及时有效地为t细胞生长提供氧气与营养并排出代谢废物；

s6全过程均使用总线提供动力，每个独立的t细胞培养单元不需要额外动力；

s7通过调控阀门调节t细胞培养巢压力可以对t细胞进行压力训练，提高t的耐压能力及入血后的成活率；

s8收获t细胞用于细胞治疗。

每种t细胞都是通过类同的方式进行扩增培养，简化了培养操作；通过与t细胞自动包裹设备、t细胞自动分离与分装设备的配合，有望实现t细胞的半自动培养及全自动培养。

实施例2

一种上述t细胞大批量生产的方法，主要包括以下过程：

s1将t细胞包裹在球形凝胶中；

s2将球形凝胶装载到独立的(20毫升t细胞培养巢)t细胞培养单元中，安装在总集成培养系统的特制安放底座中；

s3按图1与图2将每个独立t细胞培养巢的四个管道接口分别与相应总线进行连接；

s4将t细胞培养单元的数据接口与总集成培养系统接口连接；

s5为特定的t细胞培养单元设定参数，由控制平台独立调控相应的t细胞培养单元自动进行t细胞培养，通过气体传感器和干细胞代谢物传感器及时有效地为t细胞生长提供氧气与营养并排出代谢废物；

s6全过程均使用总线提供动力，每个独立的t细胞培养单元不需要额外动力；

s7通过调控阀门调节t细胞培养巢压力可以对t细胞进行压力训练，提高t的耐压能力及入血后的成活率。

s8收获t细胞用于细胞治疗。

每种t细胞都是通过类同的方式进行扩增培养，简化了培养操作；通过与t细胞自动包裹设备、t细胞自动分离与分装设备的配合，有望实现t细胞的半自动培养及全自动培养。

实施例3

一种上述t细胞大批量生产的方法，主要包括以下过程：

s1将t细胞包裹在模拟细胞外基质的海藻酸钠胶管中，通过调节钙离子浓度使海藻酸钠固化形成凝胶管；

s2将凝胶管装载到独立的t细胞培养单元(仅为20毫升t细胞培养巢)中，安装在总集成培养系统的特制安放底座中；

s3按图3(简化的总集成培养系统示意图)进行管道接口数据接口的正确连接；

s4为特定的t细胞培养单元设定参数，由控制平台独立调控相应的t细胞培养单元自动进行t细胞培养，通过气体传感器和干细胞代谢物传感器及时有效地为t细胞生长提供氧气与营养并排出代谢废物。

s5全过程均使用总线提供动力，每个独立的t细胞培养单元不需要额外动力。

s6通过调控阀门调节t细胞培养巢压力可以对t细胞进行压力训练，提高t的耐压能力及入血后的成活率。

s7收获t细胞用于细胞治疗。

每种t细胞都是通过类同的方式进行扩增培养，简化了培养操作；通过与t细胞自动包裹设备、t细胞自动分离与分装设备的配合，有望实现t细胞的半自动培养及全自动培养。

能力测试

t细胞培养单元的设定参数：温度为37±0.5℃，含氧量(包括溶解氧与结合氧)10-20ml/100ml培养液，含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)45-55ml/100ml培养液，压力范围60-180mmhg(模拟病人血压)。不同条件下培养t细胞的生理参数主要包括：细胞存活率、入血成活率、归巢能力三个指标，具体的：

a无压力培养、温度为37℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)10ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)45ml/100ml培养液时：细胞存活率为80％，入血成活率35％，归巢能力1％。

b无压力培养、温度为36.5℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)20ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)55ml/100ml培养液时：细胞存活率为85％，入血成活率40％，归巢能力5％。

c压力80mmhg培养、温度为37.5℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)10ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)55ml/100ml培养液时：细胞存活率为90％，入血成活率40％，归巢能力5％。

d压力120mmhg培养、温度为36.5℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)20ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)45ml/100ml培养液时：细胞存活率为96％，入血成活率60％，归巢能力15％。

e压力60mmhg培养、温度为37℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)20ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)45ml/100ml培养液时：细胞存活率为94％，入血成活率55％，归巢能力9％。

f压力180mmhg培养、温度为37.5℃、含氧量(包括溶解氧与结合氧)20ml/100ml培养液、含二氧化碳量(包括溶解态与结合态)45ml/100ml培养液时：细胞存活率为90％，入血成活率45％，归巢能力11％。

本领域技术人员不难理解，本发明的t细胞大批量生产的方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。