本发明涉及分子遗传学中的遗传标记检测技术领域，具体涉及一种与羊肉质中水解氨基酸含量有关的羊myod1基因snp标志物及其应用。
背景技术：
我国是一个养羊大国，随着社会经济的不断发展，人们对羊肉的需求量日益增加，对羊肉质量的要求也不断提升。想要得到更高产、优质、美味的羊肉，就需要在养羊的源头上做好育种工作。我国早期的育种工作主要集中于表型选择。近年来，随着分子生物学的不断发展，分子选择正逐步成为一种可靠而有效的选择方法。在分子水平上，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)作为第3代遗传标记，具有数量多、形态丰富、分布广等优点，在畜禽遗传育种标记中被广泛应用。
对于人类而言，食品中必需氨基酸的含量越高，食品的营养价值就越高。人们需要的是优质美味的肉品资源。增加肉质中水解氨基酸的含量，可以显著提高肉质质量，改善肉品的鲜味和香味。因此选育羊肉质中水解氨基酸含量高的品种就显得格外重要。若能筛选出与羊肉质中水解氨基酸含量有关的snp作为生物标志物，并研制相应的试剂盒，为优质肉羊的育种工作提供了理论基础，为改善羊的肉质质量和风味提供可能。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种与羊肉质中水解氨基酸含量有关的羊myod1基因snp标志物及其应用。
本发明的技术方案如下：
根据羊基因型分析羊肉质中水解氨基酸的含量，确定所述羊肉质内水解氨基酸含量的高低与myod1基因的外显子1第596位脱氧核糖核苷酸基因型的关系，结果显示tt基因型的羊肉质中各水解氨基酸的含量显著高于ct基因型和cc基因型的羊(p<0.05)；由此，得到一种与羊肉质中水解氨基酸含量有关的羊myod1基因snp标志物，该标志物为myod1基因chr1:47533298位点(外显子1的596bp处)c-t的突变。
本发明还提供了一种用于检测前述snp标志物的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物myod1f(seqidno.1)、下游引物myod1r(seqidno.2)，具体序列为：
myod1f：5′-taaatagccctgggagcctagtgtg-3′；
myod1r：5′-gctccttgccctctcgtaaac-3′；
本发明还提供了一种用于检测前述snp标志物的检测方法，包括以下步骤：
(1)pcr扩增：以待测羊血液的基因组dna为模板、前述myod1f和前述myod1r为引物，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
前述pcr扩增的反应体系为：10μl的2×estaqmastermix，0.5μl的上游引物myod1f，0.5μl的下游引物myod1r，1μl的模板，8μl的ddh2o；
前述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火40s，35个循环；72℃延伸8min；
(2)鉴定pcr扩增产物：通过直接测序法对前述pcr扩增产物进行基因型鉴定，判定myod1基因外显子1第596位点的snp标志物的基因型；如果前述pcr扩增产物自5′末端起第596位的碱基均为c，则前述待测羊的基因型为cc基因型，如果前述pcr扩增产物自5′末端起第596位的碱基为c和t，则前述待测羊的基因型为ct基因型，如果前述pcr扩增产物自5′末端起第596位的碱基均为t，则前述待测羊的基因型为tt基因型。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定羊肉质中水解氨基酸含量的试剂盒，前述试剂盒中含有本发明提供的一种用于检测前述snp标志物的特异性引物。
作为一种优选的方案，前述试剂盒中还含有一段对比序，且所述对比序列为myod1基因外显子1第596位点上下游共862bp的基因序列(seqidno.3)。
本发明还提供了前述snp标志物、特异性引物、检测方法、试剂盒在鉴定或辅助鉴定羊肉质中高水解氨基酸含量方面的应用。
本发明还提供了前述snp标志物、特异性引物、检测方法、试剂盒在选育羊肉质中高水解氨基酸含量的种羊方面的应用。
本发明还提供了前述snp标志物、特异性引物、检测方法、试剂盒在羊育种方面的应用。
作为一种优选的方案，所述在羊育种方面的应用包括：利用前述特异性引物对羊肉质中myod1基因外显子1第596位点的基因型进行检测，选择羊肉质中水解氨基酸含量最高的tt基因型羊进行育种和培育。
本发明的有益效果在于：
①本发明提供的一种与羊肉质中水解氨基酸含量有关的羊myod1基因snp标志物的基因型与羊肉质中水解氨基酸含量具有显著相关性，用单因素方差法分析不同基因型羊肉质中各种水解氨基酸的含量表明，tt基因型的羊肉质中各水解氨基酸的含量显著高于ct基因型和cc基因型的羊(p<0.05)；
②可以准确、快速的鉴定出肉质中水解氨基酸含量高的羊，对羊的遗传育种和性能鉴定具有重要意义和应用价值。
③选育肉质中水解氨基酸含量高的羊，提升羊肉的风味和质量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.羊myod1基因snp标志物位点的筛选
(1)羊血液基因组dna的提取
采集来乾安牧业的阿骨羊(杜寒杂交羊)51只血液样本，样品采集后，保存于液氮中，之后采用axyprep血基因组dna试剂盒提取待测羊血液基因组dna。具体步骤如下：
1)血液的准备：采集羊血液于抗凝采血管中，得到抗凝全血；
2)加500μl的bufferap1细胞裂解液到1.5ml离心管中，之后在离心管中加入步骤1)制备的抗凝全血250μl，并用移液器来回吸注几次，以彻底溶解残留在吸头上的抗凝全血，之后盖紧离心管盖子，旋涡振荡10s；
3)之后在离心管中加100μl的bufferap2蛋白沉淀液，旋涡振荡10s，之后12000×g离心10min，获得滤液；
4)将制备管置于2ml离心管中，并将步骤3)中的滤液加入到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中；之后加700μl的bufferw1a，室温放置2min，12000×g离心30s，弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中；之后加800μl已加无水乙醇的bufferw2，12000×g离心1min，将制备管置回到原2ml离心管中，加500μlbufferw2，12000×g离心1min，弃滤液，将制备管置回原2ml离心管，12000×g离心1min；
5)将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100μl的bufferte，室温静置1min后12000×g离心1min，洗脱基因组dna，获得待测羊血液基因组dna，洗脱完成后，去除制备管，将装有待测羊血液基因组dna的1.5ml离心管置于-20℃冰箱内保存。
(2)pcr扩增
以步骤(1)获得的待测羊血液基因组dna为模板，采用上游引物myod1f5′-taaatagccctgggagcctagtgtg-3′和下游引物myod1r5′-gctccttgccctctcgtaaac-3′为引进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。其中，pcr扩增的反应体系为：10μl的2×estaqmastermix，0.5μl的上游引物myod1f，0.5μl的下游引物myod1r，1μl的模板，8μl的ddh2o；pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火40s，35个循环；72℃延伸8min。
(3)鉴定pcr扩增产物
1)pcr产物初步鉴定：吸取1μlpcr扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，之后用琼脂糖凝胶成像仪进行拍照检测，结果显示，扩增片段与对比序列的大小一致，且特异性好；
2)测序验证：将经过初步鉴定为阳性的pcr扩增产物送交测序公司进行测序。
(4)羊myod1基因snp标志物位点的获得
根据步骤(3)获得的所有测序结果，利用dnaman软件进行比对，得到差异位点即为snp位点。根据对比结果显示，myod1基因外显子1第596位脱氧核糖核苷酸为snp位点。
根据myod1基因外显子1的第596位点的碱基不同，将596位点的碱基均为c的个体的基因型命名为纯合cc基因型，碱基均为t的个体的基因型命名为纯合tt基因型，碱基为c和t的个体的基因型命名为杂合ct基因型。
2.羊myod1基因snp标志物与羊肉质中水解氨基酸含量的相关性分析
为确定羊myod1基因外显子1的第596位点与羊肉质中水解氨基酸的含量是否相关，采集来自乾安牧业的阿骨羊(杜寒杂交羊)51只血液样本为实验材料，采用步骤1中的方法根据myod1基因外显子1的第596位点的碱基不同，将样本分为cc基因型、tt基因型、ct基因型三组，之后对这51个样本进行羊肉质中水解氨基酸的含量的检测，最终根据羊肉质中水解氨基酸的含量检测结果与三组基因型进行相关性分析，具体实验过程及结果如下：
(1)myod1基因外显子1的第596位点的碱基的基因型检测
采用步骤1的方法对51只阿骨羊检测结果表明：51只阿骨羊中12只基因型为cc基因型，18只基因型为ct基因型，21只基因型为tt基因型。羊myod1基因在检测羊群中的基因型频率及等位基因频率结果如表1所示。
表1羊myod1基因在检测羊群中的基因型频率及等位基因频率
由表1可以看出tt纯合型远远高于cc纯合型和ct杂合型，等位基因t的分布高于等位基因c的分布。
(2)基因型与羊肉质中水解氨基酸含量的关联性分析
利用spss20.0软件对基因型和羊肉质中水解氨基酸的含量进行统计分析，并进行样本间多重比较，结果如表2所示。
表2羊myod1基因外显子1的单核苷酸多态性与羊肉质中水解氨基酸的关联性分析
备注：表中用不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)，数值用最小二乘均值±标准误。
从表2中可以看出，myod1基因外显子1的第596位点对羊肉质中水解氨基酸的含量有显著影响，tt基因型的羊肉质中水解氨基酸的含量显著高于ct基因型和cc基因型的羊。
所以在实际的羊育种中，选择tt基因型的羊进行育种，会得到具有更高水解氨基酸含量的优质肉羊。
综上所述，可以通过确定羊myod1基因外显子1的第596位点的基因型来确定待测羊为tt基因型、ct基因型或是cc基因型，从而鉴定或辅助鉴定羊肉质中水解氨基酸的含量，即tt基因型的待测羊肉质中水解氨基酸的含量显著高于ct基因型和cc基因型的待测羊。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110>吉林省农业科学院
<120>一种与羊肉质中水解氨基酸含量有关的羊myod1基因snp标志物及其应用
<130>2019
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
taaatagccctgggagcctagtgtg25
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gctccttgccctctcgtaaac21
<210>3
<211>862
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gtgtgaaggtaggggtggggaggccccagggcgctgccgcggctctcctcgccgtccgtc60
cctcaggcgggacaggaccggggagggtgaggaacagctggttatacattcagaccctca120
gtgctttgctatctcattgccggggctccagaaccgcagtaagtttctggcaacccctgc180
cgctgccgctgaggctgggcaaagccaggaccgcgccgccccacgccgggatatggagct240
gctgtcgccgccgctccgcgacgtagacttgacgggccccgacggctctctctgcaactt300
tgcaacagcggatgacttctatgatgacccgtgtttcgactccccggatctgcgcttctt360
cgaggacctggatccgcgcctcgtgcacgtgggcgcgctcctgaagccggaggaacactc420
gcacttccctgcagcggcgcacccggccccgggcgcgcgcgaggacgaacatgtgcgcgc480
gcccagcgggcaccaccaggcgggccgctgtttactgtgggcctgcaaggcgtgcaaacg540
caagacgactaacgccgaccgccgcaaggctgctaccatgcgcgagcggcgccgcttgag600
caaagtcaacgaggccttcgagacgctcaaacgctgcacgtctagcaacccaaaccagcg660
gctgcccaaggtggagatcctgcgcaacgccatccgctatatcgaaggcctgcaggcgct720
gcttcgcgaccaggacgccgcgcctcccggcgctgccgctgccttttacgcgcctggccc780
gttgccccccggccgcagcggcgaacactacagcggcgactcggacgcttccagcccgcg840
ctccaactgttccgacggcatg862