PIK3CA基因g.1792224821G>A突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用的制作方法

本发明属于医学与生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌中pik3ca基因g.1792224821g>a位点突变及其在辅助制备乳腺癌诊断试剂中的应用。

背景技术：

乳腺癌是全世界妇女目前面临的最为常见的恶性肿瘤，也是引起女性死亡的重要病因。自90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的2倍多，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症，癌症死亡原因位居第六，且年轻化趋势显著。虽然早期检查及诊断技术的提高，手术及综合辅助治疗的进步，使得患者的预后有较明显改善，但是总生存率并不理想。对于特定的分子亚型，由于对药物的原发或继发耐药、甚至缺乏特定的治疗靶点，使得部分中晚期病人缺乏有效的治疗手段。因此，寻找发生有效的肿瘤标志物对于提高乳腺癌的诊断和预测发生、发展及改善预后具有重要的临床指导意义。

肿瘤标志物可以有效地作为临床诊断依据，可以监听高位人群、早期诊断、指导治疗、判断治疗疗效、检测复发及转移，是肿瘤患者的重要检查指标。乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程，包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。pik3ca基因是近年来被发现除p53突变和her-2扩增之外最常见和最重要的乳腺癌中的突变基因，突变比率高达40％，其突变可导致多条信号通路在不同水平发生调控异常，从而促进肿瘤细胞的增殖和存活。

磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶双重活性，调节细胞增殖、存活、迁移、凋亡和细胞周期等多种生物学功能。pik3ca基因编码ⅰ类pi3k催化亚单位p110α，其定位于3q26.3，包含21个外显子，编码1068个氨基酸。现有研究显示，应用pcr或基因测序的方法检测组织中pik3ca基因的突变情况，可提高肿瘤诊断的敏感性；pik3ca基因突变的肿瘤细胞对pi3k抑制剂更敏感，特异性地针对pik3ca突变的靶向治疗可有效降低恶性肿瘤的发病率和死亡率。尽管pik3ca突变对乳腺癌的诊治及预后的影响还需进一步研究，但从目前已有的研究数据可以看出pik3ca高频突变和突变热点区域的发现对于乳腺癌基因诊断以及靶向治疗的选择具有重要的临床意义。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因、检测该突变基因的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，以便用于早期诊断乳腺癌。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因，其野生型pik3ca基因序列如seqidno:1所示，其突变型pik3ca基因如seqidno:2所示，突变型pik3ca基因序列与野生型pik3ca基因序列具有g.1792224821g>a位点突变。

进一步的，一种用于检测上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物的序列如seqidno:3所示，所述特异性引物的下游引物的序列如seqidno:4所示；用于检测erbb2基因g.1792224821g>a位点突变；所述pik3ca基因g.1792224821g>a位点突变是指突变位点在seqidno:1序列的第161位碱基g突变为a。

进一步的，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因的特异性引物。

本发明的有益效果如下所述：pik3ca基因g.1792224821ga突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用，通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

附图1为一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因位点g.1792224821g>a突变体检测凝胶电泳图；

附图2为一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因位点g.1792224821g>a突变体的基因测序图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如附图1至2所述的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因，其野生型pik3ca基因序列如seqidno:1所示，其突变型pik3ca基因如seqidno:2所示，突变型pik3ca基因序列与野生型pik3ca基因序列具有g.1792224821g>a位点突变。

本研究采用pcr扩增和sanger测序技术在52例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有2例患者存在pik3ca基因组第3号染色体的1792224821位置发生碱基g到a碱基的突变，该基因在ncbl参考数据库grch38.p12中的编号为nc_000003.12(179148114～179240093)。随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在500例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳腺癌患者中，存在1例患者携带该突变；在500例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。为进一步提高该突变致乳腺癌的可靠性，我们建立了正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性1000名(35岁～65岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为49岁)，经追踪随访查出2例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

以上研究所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g.179224821g>a，该突变发生于第3号染色体的179224821位置，该基因在ncbl参考数据库grch38.p12中的编号为nc_000003.12(179148114～179240093)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如seqidno:1所示，pik3ca基因突变相对应的序列如seqidno:2所示，其中突变位点在seqidno:1序列的第161位由碱基g突变为a。

seqidno:1

aagcaaaggtacctagtaaagtttttaactattttaaaggcttgaagagtgtcgaattatgtcctctgcaaaaaggccactgtggttgaattgggagaacccagacatcatgtcagagttactgtttcagaacaatgagatcatctttaaaaatggggatggtaaggaagagtattaatgagcttatgatgcatgaatttagctatctttttatacacaggatatttatgaaccatgaaaactactgaaagccatttaaggaatatacacatgtgataaaatatgtaatatttatcagatgtcttgacctttgaaatatgcatgtataatcaatgaaaagaaaagaagtactaggtttagatcagaag

seqidno:2

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该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。

一种用于检测上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物的序列如seqidno:3所示，所述特异性引物的下游引物的序列如seqidno:4所示；用于检测erbb2基因g.1792224821g>a位点突变；所述pik3ca基因g.1792224821g>a位点突变是指突变位点在seqidno:1序列的第161位碱基g突变为a。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的pik3ca突变基因的特异性引物。

具体的，本发明的检测方法是利用人类pik3ca基因不同基因型的特异性序列位点的改变，设计出针对突变位点的引物序列，进行聚合酶链反应来完成的。

本发明采用sanger测序方法，用pcr扩增引物，对pik3ca基因进行突变检测；其中pcr扩增引物的上游引物的序列如为seqidno:3所示，下游引物的序列如seqidno:4所示。

其具体的实施方式如下所述：

dna模板的制备，采用购置的试剂盒提取全血基因组dna，具体步骤如下：

(1)取无菌2.0ml离心管一只，加入1ml细胞裂解液；

(2)轻轻震荡然经edta抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μl血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5～6次混匀；

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2～3次混匀)；

(4)12000rpm室温离心5分钟；

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出；

(6)使用涡旋振荡器(votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15秒)；

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μl。用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μl并重复置于37℃孵育；

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μl，用涡旋振荡器剧烈震荡10～20秒；

(9)12000rpm室温离心5分钟；

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μl室温异丙醇的2.0ml离心管中；

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状dna形成沉淀；

(12)12000rpm室温离心1分钟；

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5～10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净；

(15)向离心管中加入50～100μl的dna溶解液，轻轻混匀；

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估dna提取效果，nanodrop核酸仪检测含量，定量到20～50ng/μl，-20℃保存。

pik3ca基因g.179224821g>a突变基因检测技术方案：

仪器：veriti96型pcr仪、bio-radgeldocxr+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：qiaampdna提取试剂盒(德国qiagen公司)；dnaisolationkit提取试剂盒(北京pelfreez公司)；pcr缓冲液、dntp、taq酶(美国abi公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(ncbi)genbank记录的pik3ca基因(序列号:nc_000003.12)，通过oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列为f:5’-atcatctttaaaaatggggata-3’(seqidno:3)和r:5’-atatttcaaaggtcaagacatc-3’(seqidno:4)，扩增产物片段长度为180bp；

(2)反应总体积：50μl，含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，taq聚合酶(1u/μl)1.0μl，mgcl2终浓度2.0mmol/l，dntp终浓度200nmol/l，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/l，并加消毒双蒸水至总体积50μl；

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着57℃退火30秒，72℃延伸30秒分钟，共35个循环；

(3)pik3ca基因g.179224821g>a突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，pcr产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示pcr产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，m：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：pik3ca基因g.179224821g>a突变样本；

(4)扩增产物纯化：本研究采用takara公司的agarosegeldnapurificationkit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的pcr产物进行纯化回收，准备测序；

(5)sanger测序与结果判断：纯化后pcr产物在abi3730型全自动dna测序仪上进行测序。将测序结果与pik3ca野生型参考序列(ncbireferencesequence:nc_000003.12)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为pik3ca基因显示g.179224821g>a突变。

用于乳腺癌辅助诊断突变位点试剂盒的制作：

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于pcr扩增和sanger测序扫描检测技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.179224821g>a突变位点的引物序列为seqidno:3和seqidno:4)，该试剂盒还可以包括pcr反应常用的试剂，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

相关突变位点寡核苷酸引物序列如表1所示。

表1

其中*f＝正向引物序列；r＝反向引物序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>无锡市第五人民医院

<120>pik3ca基因g.1792224821g>a突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>homosapiens

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