本发明涉及农作物病毒病害的分子检测技术，属于农业科学
技术领域：
：，具体涉及一段cwmv复制酶区域致病相关功能域。
背景技术：
：：在中国冬麦区，禾谷多黏菌传播的小麦病毒病病原为大麦黄花叶病毒属(bymovirus)的小麦黄花叶病毒(wheatyellowmosaicvirus,wymv)和真菌传杆状病毒属(furovirus)的中国小麦花叶病毒(chinesewheatmosaicvirus,cwmv)，小麦黄花叶病爆发年份对病区小麦安全生产造成严重影响。wymv在我国分布广泛，cwmv虽然在分布上局限于山东、江苏等少数地区，但近几年的田间调查表明cwmv有较明显的扩张趋势。病毒在植物细胞内绝对寄生需要寄主细胞提供能量、物质、场所，这种对寄主极端依赖造成的干扰及寄主防卫反应引起的生理变化会引起急性或慢性的植物病害。当病毒的侵染引起宿主生理异常和且出现病害症状时，才被认为具有致病作用。植物病毒编码的所有蛋白如复制酶、运动蛋白、外壳蛋白等均有可能是病毒的致病因子，复制酶导致的寄主致病性已在多种植物病毒中报道过，如李痘病毒(plumpoxvirus,ppv)，油菜花叶病毒(oilseedrapemosaicvirus,ormv)，葡萄扇叶病毒(grapevinefanleafvirus,gflv)和辣椒轻斑驳病毒(peppermildmottlevirus,pmmov)。同时，病毒编码的多肽也可能是宿主植物的致病决定因子。例如，引起幼苗黄化综合症的柑橘衰退病毒(citrustristezavirus，ctv)的致病因子位于该病毒基因组的3’末端。celiar.a.duff-farrier等人通过构建结合凤果花叶病毒(pepinomosaicvirus，pepmv)两个株系(eu和ch)基因组分的嵌合病毒侵染性克隆，证明了pepmv的致病决定因子为cpn端的第11-26个氨基酸。cwmv基因组包含两条正义单链rna，其编码复制酶的基因位于rna1上，分别编码分子量为153kda和212kda两个复制相关蛋白。其中p212由p153和p55两部分组成，p153有三个功能域，包括具有甲基转移酶活性的区域、可变区和具有解旋酶活性区域；p55为依赖于rna的rna聚合酶(rna-dependentrnapolymerase,rdrp)，与病毒复制相关；病毒体外翻译时存在一定几率使得p153和p55融合成一个大的通读蛋白p212，作为一个rna复制复合体行使功能。土传小麦病毒病是我国冬麦区的重要病害之一，鉴于传播介体禾谷多黏菌的休眠孢子壁厚，抗逆性强，化学药剂效果较差，目前防治土传小麦病毒病的最重要方式是鉴定和推广抗性品种，而目前对cwmv具有抗性的小麦品种较少。因此鉴定明确cwmv的致病因子及机理，将为发展和推广土传病毒病高抗的小麦品种提供理论依据。技术实现要素：本发明提供了一段cwmv复制酶区域致病功能区，其表示为式i：x1-mfhngtcelpkdsafldytadnsgtwmygkpsrfghsygvgfsldt-x2i其中x1为heamwylqckivsdrttlrsiiddhlrg(seqidno.10)或缺失；x2为：rqrvskcelvklmwnhdsrgqvnqkpvntrafqylllselsfmmnemiiyrnlqqvmrkrertkqaritlrdgvpgcgkstwilnnanpt(seqidno.11)或缺失。优选的，式i为seqidno.2，其对应的核苷酸序列为seqidno.1。本发明提供的克隆seqidno.1所用的引物组为：153-f(seqidno.5)：5’-cctgcagcacgaggcgatgtggtat-3’153-r(seqidno.6)：5’-cctgcagtgtgggatttgcattgttc-3’进一步的本发明提供了所述cwmv复制酶区域致病功能域的鉴定方法，所述方法为利用烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,trv)介导的基因沉默体系，鉴定了cwmv复制酶区域致病因子序列，进一步实验明确了致病因子为多肽，同时筛选了最短有效致病多肽。进一步优选的，所述cwmv复制酶区域致病相关功能域的鉴定方法为：步骤1：将ncbi中cwmvrna1(genbank:aj012005.1)的复制酶p153分为五个多肽序列(p153-1至p153-5)，并将编码这5个多肽和rdrp(p55)相应的正义链核苷酸序列分别构建到trv载体(trv-rna2)中，并与trv-rna1农杆菌共浸润本氏烟，设置trv:00浸润烟草为对照，持续观察本氏烟症状表型，结果表明农杆菌浸润后，与对照相比较，仅trv:p153-4能明显加重本氏烟的病症。步骤2：将p153-4的反向互补序列用同样的方法构建到trv载体，发现其并无增强trv致病性的能力；将p153-4序列中对应p153的8个有效翻译起始密码子及其5’端的延伸序列进行缺失突变(trv:cw1-7m1至trv:cw1-7m7)，并通过农杆菌共浸润法侵染本氏烟；侵染后，观察本氏烟的症状，证实cw1-7m1与cr1-7(cw1-7)引发的trv增强症状，cw1-7m2至cw1-7m7均和对照症状无明显区别；表明p153-4的有效致病相关因子为多肽。优选的，式i为seqidno.4为致病因子最短有效序列为p153第939-984个氨基酸(vrpep)，其对应的核苷酸序列为seqidno.3。致病因子同样可有效增强马铃薯x病毒(potatovirusx,pvx)在本氏烟上的侵染和复制。本发明提供的克隆seqidno.3所用的引物组为：vrpep-f(seqidno.7)：5’-cctgcagatgtttcacaatggaacttgt-3’vrpep-r(seqidno.8)：5’-cctgcagttacgtgtccagtgaaaaacc-3’。为进一步明确cwmvp153-4的最短有效致病相关多肽，本发明采用的方法为：在cw1-7p2的基础上对其5’端序列进行了翻译提前终止，分别构建了trv:cw-pep1，trv:cw-pep2，trv:cw-pep3，trv:cw-pep4四个重组载体(图3)，并通过农杆菌浸润本氏烟；观察烟草症状，表明cw-pep1，cw-pep2及cw-pep3三个多肽的表达均能引起烟草矮缩，茎基部坏死等症状，而cw-pep4则不能引起上述症状的发生；因此p153-4的最短有效致病多肽为cw-pep3(vrpep)，vrpep的氨基酸序列为seqidno.4。我们利用同样方法检测了vrpep对另一种病毒载体pvx的致病性影响，结果表明vrpep同样能增强pvx在本氏烟上的症状(图5)。分子手段对表达vrpep本氏烟中的病毒积累量进行检测，rt-qpcr和westernblot检测表明trv和pvx在转录水平和蛋白水平的表达均显著高于对照(图4，图5)。更为优选的，所述一种cwmv复制酶区域致病因子的筛选方法包括步骤：1、将ncbi中cwmvrna1(genbank:aj012005.1)的复制酶p153分为五个多肽序列，(p153-1至p153-5)，并将编码这5个多肽和rdrp(p55)的相应正义链核苷酸序列分别构建到trv载体(trv-rna2)中，并与trv-rna1农杆菌共浸润本氏烟，设置trv:00浸润烟草为对照，持续观察本氏烟症状表型。结果表明农杆菌浸润7天后，与对照相比较，仅trv:p153-4能明显加重本氏烟的病症(图1)，该有效致病相关因子的核苷酸序列为seqidno.1，氨基酸序列为seqidno.2。本发明提供的克隆该有效致病相关因子所用的引物组为：153-f(seqidno.5):5’-cctgcagcacgaggcgatgtggtat-3’153-r(seqidno.6):5’-cctgcagtgtgggatttgcattgttc-3’2、为明确cwmvp153-4序列的有效致病相关因子为多肽或病毒小干扰rna(vsirna)，将p153-4的反向互补序列用同样的方法构建到trv载体，发现其并无增强trv致病性的能力。另外我们将p153-4序列中对应p153的8个有效翻译起始密码子及其5’端的延伸序列进行缺失突变(trv:cw1-7m1至trv:cw1-7m7，trv:cw1-7p2，图2)，并通过农杆菌共浸润法侵染本氏烟。侵染7天后，观察本氏烟的症状，结果表明除了cw1-7m1与cr1-7(cw1-7)引发的trv增强症状外，cw1-7m2至cw1-7m7均和对照症状无明显区别。同时，如果突变过程中保留第二个atg(cw1-7p2)时，其在烟草上对trv症状的增强能力又重新恢复，表明p153-4的有效致病因子为多肽，而非vsirna，同时第二个起始密码子对其致病性具有重要作用。3、为进一步明确cwmvp153-4的最短有效致病多肽，本实验在cw1-7p2的基础上对其5’端序列进行了翻译提前终止，分别构建了trv:cw-pep1，trv:cw-pep2，trv:cw-pep3，trv:cw-pep4四个重组载体(图3)，并通过农杆菌浸润本氏烟。侵染7天后观察烟草症状，结果表明cw-pep1，cw-pep2及cw-pep3三个多肽的表达均能引起烟草矮缩，茎基部坏死等症状，而cw-pep4则不能引起上述症状的发生。因此p153-4的最短有效致病多肽为cw-pep3，共46个氨基酸。由于cw-pep3位于p153蛋白的变异区(variableregion,vr)，因此命名为vrpep。vrpep的核苷酸序列为seqidno.3，氨基酸序列为seqidno.4，对应于cwmv复制酶蛋白p153的第939-984个氨基酸。vrpep所用的引物组为：vrpep-f(seqidno.7):5’-cctgcagatgtttcacaatggaacttgt-3’vrpep-r(seqidno.8):5’-cctgcagttacgtgtccagtgaaaaacc-3’。4、我们利用同样方法检测了vrpep对另一种病毒载体pvx的致病性影响，结果表明vrpep同样能增强pvx在本氏烟上的症状(图5)。分子手段对表达vrpep本氏烟中的病毒积累量进行检测，rt-qpcr和westernblot检测表明trv和pvx在转录水平和蛋白水平的表达均显著高于对照(图4，图5)。本发明的有益效果为：在cwmv复制酶p153区域鉴定了一段具有致病功能的序列cr1-7(cw1-7)，进一步的实验明确了其有效致病因子为46个氨基酸的多肽vrpep。除trv外，vrpep还能够促进pvx在本氏烟上的侵染和复制，表明vrpep增强病毒致病的能力可能具有非特异性。本研究得到的结果将有助于为发展土传病毒病新的抗病策略提供思路。附图说明图1为cwmv复制酶上的致病序列在本氏烟上引起的症状图；其中trv:p153-4表示trv表达p153-4；trv:00为对照。图2p153-4缺失突变示意图。图3cw1-7p2翻译提前终止示意图，其中cw1-7pep4在本氏烟上的表达无法加重trv症状。图4vrpep促进trv对本氏烟的系统侵染；a：trv:vrpep农杆菌浸润本氏烟7天后的症状；b，c：rt-qpcr及westernblot检测trvcp在trv:00和trv:vrpep中的积累量。图5vrpep促进pvx对本氏烟的系统侵染；a：pvx:vrpep农杆菌浸润本氏烟5天后的症状；b，c：rt-qpcr及westernblot检测pvxcp在pvx:gus和pvx:vrpep中的积累量。具体实施方式下面结合具体实施方案对本发明做进一步的说明，这些实施例应被理解为仅为本发明的最佳实例，而非以任何方式限制本发明，凡在本发明原则之内所做的任何改进、修饰和等同替换，均应包含在本发明的范围之内。实施例1：trizol法提取totalrna及cdna文库的建立感染cwmv的小麦样品采集于山东荣成感病试验田。取小麦叶片组织2g于液氮中研磨，用trizol(invitrogen)方法提取小麦叶片的totalrna，经甲醛变性凝胶电泳检测质量符合要求后，按照iiqrtsupermixforqpcr(vazyme)试剂盒说明书将符合要求的rna逆转录为高质量的cdna。实施例2：引物设计利用dnaman软件分析病毒载体trv的多克隆位点及cwmvrna1复制酶基因，在用于筛选致病因子的引物序列前加入psti的序列及其保护碱基，即cctgcag。具体引物列表见表1。表1.trv载体构建的引物序列实施例3：目的片段的扩增及回收用上述设计所得引物，以感病小麦cdna为模板，进行扩增反应；扩增体系为感病小麦cdna1μl，2×pcrbufferforkodfxneo25μl，2mmdntps10μl，primmer-f1μl，primmer-r1μl,kodfxneo(1u/μl)1μl，，dh2o16μl。pcr反应条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃30min，35cycles，72℃10min。扩增产物于2％的琼脂糖凝胶150伏电泳40min，经核酸染料染色，凝胶成像仪观察分析扩增结果。若扩增谱带明显，并具有特异性，在长波紫外灯下切取特异的扩增谱带，按照svgelandpcrclean-upsystem试剂盒说明书进行回收，回收产物在与tsingke公司t载体pclone007进行连接。连接产物转化大肠杆菌后在氨苄青霉素抗性的lb平板上筛选阳性克隆。pcr对随机挑取平板上的菌落进行鉴定，含有大小正确片段的质粒去测序，验证序列的正确性。实施例4：重组载体构建沉默载体pash18质粒psti酶切处理后再进行磷酸化，反应体系为载体质粒5μg，10×fastdigestbuffer5μl，fastdigestpsti5μl，nuclease-freewater补足50μl，37℃处理30min后，加入去磷酸化酶thermosensitivealkalinephosphatase，37℃再处理30min。实施例3中所述含有目的基因(正义链和反义链)的t载体经过psti酶切出的目的片断，在t4连接酶作用下，分别与上述酶切处理的沉默载体pash18进行连接，连接产物转化大肠杆菌并在含有四环素抗性的平板上筛选阳性克隆。并成功转化到大肠杆菌中。实施例5：农杆菌共浸润烟草取上述连接成功的表达载体质粒500ng，加入到农杆菌感受态eha105中，电转后用含有kan和rif抗生素的lb平板筛选阳性克隆。将含有目的基因重组载体质粒的农杆菌与trv-rna1农杆菌菌液经无菌水及瞬时转染液洗脱重悬，将od值调到1.0后，按1：1的体积比混匀。选取苗龄约3周的本氏烟植株，用注射器针头在第三、四片叶子的背面刺一个小孔，用去针头的注射器从小孔处将菌液慢慢浸润烟草叶片。做好标记，将本氏烟置于正常生长环境下培养(24℃，16h光照，8h黑暗)，持续观察植株症状。实施例6：荧光定量pcr(rt-qpcr)根据trvrdrp和pvxcp基因的序列，设计特异性定量引物，内参基因为烟草ubc。引物序列见表2。表2.rt-qpcr涉及引物及序列table2.primerssequencesinvolvedinrt-qpcr参照chamqtmqpcrmastermix说明书进行定量pcr检测，10μl检测体系如下：将上述试剂依次加入384孔定量板(appliedbiosystems)中，混匀后，在实时荧光定量pcr仪中按照以下程序进行反应：共做3次独立实验，每次3个生物学重复，各生物学重复均做两个技术重复。结果采用2-δδct的相对定量方法分析，各基因mrna的表达量对持家基因ubc的表达量进行归一化。实施例7：westernblot取trv系统侵染7dpi的本氏烟叶片及pvx系统侵染5dpi的本氏烟叶片分别进行westernblot检测，实验方法同2.2.10。westernblot检测trv的积累量所用一抗为trvcp，1:5000稀释；二抗为anti-rabbitigg(transgenbiotech)，检测pvx积累量所用一抗为pvxcp，1:5000稀释；二抗为anti-rabbitigg(transgenbiotech)。序列表<110>宁波大学<120>一段cwmv复制酶区域致病相关功能域及其筛选方法<160>35<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>492<212>dna<213>artificial<220>当前第1页12当前第1页12