一类指示生长素浓度的转基因大豆的制作方法

本发明属于分子遗传学领域，提供了一类指示生长素浓度的转基因大豆及其应用。

背景技术：

生长素是一重要的植物激素。它参与植物生长和发育的各个进程，如植物胚细胞的发育、维管束的发育、侧根的形成、茎和侧枝的生长、花器官的发育等等，几乎囊括了植物生长的所有过程。其中生长素浓度的梯度分布与植物形态的建成有着密切的联系，合理的生长素梯度分布有利于植物器官原基的建立和形成。深入的研究生长素在植物各个器官中的分布和动态变化，这不尽有利于我们深入了解植物的生长发育机制，同时也能够为现实的农作物生产提供理论帮助。目前生长素可视化在模式植物拟南芥中得到了广泛的运用，但在作物上的运用仍比较少。因此，生长素在农作物中的可视化，为我们高效的开展农作物中的相关科研工作提供了有利的工具。

大豆作为我国重要的经济作物之一，它富含蛋白质和油脂，有非常高的营养价值。除此之外，大豆作为豆科作物的一类，它的根系能够与土壤微生物共生形成具有固氮功能的根瘤。根瘤的形成不仅仅能够促进植物自主的吸收空气中的氮气，还能够改善土壤的肥力，减少化肥的施用。因而，针对地上部分的大豆产量和品质的提升和地下部分结瘤固氮性能的提高都是科研工作者亟需解决的重要问题。在大豆根瘤的生长发育过程中，生长素发挥着必不可少的作用。根据已有的研究证明，生长素能够促进根瘤原基的形成，并且与细胞分裂素协同调控根瘤原基的细胞分裂。生长素过多的积累造成根瘤的无限生长，从而影响了豆科作物地上部分叶片和果实的营养分配；而生长素浓度过低也抑制了根瘤的起始。因而，保证合理的生长素浓度和分配对于获得高效结瘤的大豆植株提供了必要的基础。而生长素浓度和分布的可视化则是研究生长素途径必不可少的的手段之一。

本发明首次在大豆中创建了灵敏的反应生长素浓度的转基因大豆作物，与模式植物拟南芥以及模式豆科植物苜蓿中的生长素指示植株相比，该转基因大豆在根尖以及根瘤中的生长素指示较为一致。该转基因植株可普遍用于指示大豆体内生长素的浓度和梯度分布，操作简易并且结论准确，在科研上具有广泛的应用价值。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一类指示生长素浓度的转基因大豆。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

附图说明

图1为获得指示生长素浓度的转基因大豆的流程图。

图2为生长素关键基因启动子序列

其中，深色标注部分为dr5v2序列

图3为转基因大豆根对外源生长素的响应。

其中，将获得的转基因大豆dr5v2-gus置于gus染色液中37度染色4小时。对照组mock的生长素梯度基本集中分布在根尖干细胞区域，其他三种形式的生长素处理iaa(0.1μm)、naa(0.1μm)和iaa-asp(0.1μm)24小时后，根尖所示的生长素浓度显著增高并且分布区域扩散。

图4为转基因大豆根瘤对外源生长素的响应。

其中，将获得的转基因大豆dr5v2-gus置于gus染色液中37度染色4小时。对照组mock的生长素梯度基本集中分布在根瘤原基区域和维管束区域，其他三种形式的生长素处理iaa(0.1μm)、naa(0.1μm)和iaa-asp(0.1μm)24小时后，根尖所示的生长素浓度显著增高并且分布区域扩散。es:earlystage，根瘤发生的早期；ds:developmentalstage，根瘤发展和膨大时期；ms:maturationstage，根瘤成熟期。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供一种指示生长素浓度的转基因大豆的的获得方法，包括如下步骤：

(1)利用pcr扩增技术获得生长素关键基因启动子。

使用takaraprimestargxl高保真酶，利用合成的dr5v2片段为模板进行pcr扩增，正反向引物分别为：

attb-f:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaggatccaagcttccgacac

attb-r:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttctgcagtgtaattgtaactgtaaatagtaattgt

(2)利用gateway的分子克隆的方式将s1所获得的产物构建到pgwb633载体上

回收s1获取的pcr产物后，首先使用gatewaybp反应将获取的dr5v2启动子构建到pdonr221载体上，反应体系为：2μlpcr回收产物，2μlpdonr221,5μlddh2o，1μlbp酶。25度反应4小时后，从-80℃冰箱取出dh5a感受态并置于冰上，待dh5a解冻后，吸取5μl反应产物与dh5a感受态感受态混合均匀后在冰上静置30分钟,随后42℃水浴90秒,冰上静置2分钟,然后加入soc500μl，置于37℃摇床1小时,随后离心1分钟,转速为10000g。在超净台进行以下工作：弃部分上清，然后将重悬好的菌液涂在含卡那霉素的lb固体培养基上，最后置于37℃培养箱中培养12小时。12小时后，挑取单克隆菌落，置于含有卡那霉素的lb液体培养基，在37℃摇床中培养12小时以上直至液体变浑浊。随后提取重组后质粒pen-l1-dr5v2-l2，并送测序验证dna序列。

选取正确的pen-l1-dr5v2-l2质粒，利用gatewaylr反应将获取的dr5v2启动子构建到pgwb633载体上，反应体系为：2μlpen-l1-dr5v2-l2质粒，2μlpgwb633质粒,5μlddh2o，1μllr酶。25度反应4小时后，从-80℃冰箱取出dh5a感受态并置于冰上，待dh5a解冻后，吸取5μl反应产物与dh5a感受态感受态混合均匀后在冰上静置30分钟,随后42℃水浴90秒,冰上静置2分钟,然后加入soc500μl，置于37℃摇床1小时,随后离心1分钟,转速为10000g。在超净台进行以下工作：弃部分上清，然后将重悬好的菌液涂在含壮观霉素的lb固体培养基上，最后置于37℃培养箱中培养12小时。12小时后，挑取单克隆菌落，置于壮观霉素的lb液体培养基，在37℃摇床中培养12小时以上直至液体变浑浊。随后提取重组后的质粒pdr5v2:gus，并对质粒进行酶切验证。

(3)将s2所获得的质粒载体导入到eha101农杆菌中；

从-80℃冰箱取出eha101感受态并置于冰上，待eha101农杆菌解冻后，吸取3μls2所获得的质粒载体并注入其中，随后在冰上静置30分钟,置于液氮中1分钟,37℃5分钟,然后加入yeb500μl，置于28℃摇床3-4小时,随后离心1分钟,转速为10000g。接下来在超净台进行以下工作：首先，遗弃部分上清，然后将重悬好的菌液涂在含壮观霉素的yeb固体培养基上，最后置于28℃培养箱中培养48小时。

48小时后，在超净工作台中，挑取单克隆菌落，置于含壮观霉素的2mlyeb液体培养基中，在28℃摇床中培养13小时以上直至液体变浑浊。随后分别取1μl菌液为模板，正反向引物分别为：

pgwb633-f：aatcatcgcaagaccggcaa

pgwb633-r：aactggcatgacgtgggttt

进行pcr鉴定。若目标片段大小309bp，即表示s2所获得的质粒载体成功导入到eha101中。

(4)利用s3所获得的农杆菌用于侵染大豆；

取部分上述阳性克隆菌液涂在含壮观霉素的yeb固体培养基上，最后置于28℃培养箱中培养48小时。然后收集农杆菌对准备好的大豆进行浸染处理。

(5)将步骤s4所获得的产物进行植物组织培养；

将上述侵染好的大豆放置在脱分化培养基上培养4天，然后转移至再分化培养基上培养7天，然后再转移至含basta的抗性再分化培养基上培养14天，然后再转移至含植物激素和basta的抗性再分化培养基上培养28天，最后转移至根诱导培养基上培养。

(6)对s5所获得的组培苗进行植物抗性(basta)筛选，从而获得转基因大豆。

首先对s5所获得的组培苗进行植物抗性(basta)筛选，若植株并未枯死则表示可能为转基因大豆植株。随后对存活的植株进行dna粗提，并以之为模板，以pgwb633-f和pgwb633-r为引物，进行pcr鉴定。若目标片段大小309bp，即表示相应的植株为转基因植株。

实施例2

该实施例提供一种转基因大豆在指示生长素浓度中的应用，包括如下步骤：

(1)实施例1所述转基因大豆的培养

dr5v2转基因大豆种子播种于蛭石中，然后置于大豆生长间(25℃，光照时长14小时)进行萌发生长。种子播种后第10天，从蛭石中取出幼苗并将蛭石洗净，然后分别进行激素处理和结瘤处理。根部激素处理流程：将幼苗分为四组，每组3株；然后分别用含有dmso，iaa，naa，iaa-asp的全氮营养液进行培养，激素浓度为0.1μm，培养时长为24小时。结瘤处理流程：幼苗浸泡在含根瘤菌bxyd3的重悬液中2小时，随后将幼苗培养在低氮营养液中14天，期间每隔两天用koh调节溶液ph值，使之维持在5.8-6.0，每周更换一次营养液。根瘤菌侵染后第15天，对根瘤进行如上所述的激素处理。

大豆高氮(5300μmol/l)高磷(250μmol/l)钾(2.35mol/l)营养液配方

注：若结根瘤，使用低氮，则需添加ca和补充k

fe-edta配制(500ml):feso4·7h2o5.56g混合na2edta7.44g溶于水中，最后定容至500ml,并将ph值调至5.5

(2)gus染液配置

根部激素处理：剪取主根根尖。

根瘤激素处理：根据大豆根瘤生长发育的不同阶段进行取材。

每5mlgus染液中的成分有：2.5ml磷酸钠缓冲液，0.1ml铁盐溶液，2.4ml蒸馏水及溶解了5mgx-glu的二甲基酰胺50μl。其中，ph＝7的磷酸钠缓冲液成分为0.1m磷酸一氢钠和磷酸二氢钠及0.1％triton；铁盐溶液成分为5mm氰化铁和氰化亚铁。将样品浸泡在gus染液中，于37℃培养箱中进行4h染色处理，然后75％乙醇进行脱色处理，用显微镜观察染色情况

(3)结果

为了进一步验证dr5v2转基因植株能够对生长素响应，我们进行如上所述的激素处理。如附图3所示，染色结果显示：空白对照植株的根只有静止中心细胞和柱细胞被染成了蓝色；而在iaa-asp，naa，iaa处理后，静止中心细胞和柱细胞染色加深，甚至染色区域扩散至整个根冠。这说明dr5v2转基因植株能够对生长素响应。

为了进一步验证dr5v2转基因植株也能够指示根瘤发育过程中的生长素的变化，我们根据大豆根瘤生长发育的不同阶段进行取材染色。如附图4所示，dr5v2转基因植株能够指示根瘤发育过程中的生长素的变化。在根瘤的发育过程中，生长素先是累积在根瘤原基；随后在外皮层和维管束中均有累积；但在根瘤发育后期，生长素主要累积在维管束且其累积浓度减弱。此外，从不同处理间的染色情况中，我们也发现dr5v2指示的生长素浓度伴随iaa-asp，naa和iaa的处理，原本指示高浓度生长素积累的区域呈现更深的颜色，并且在早期根瘤发生(es)过程中根瘤原基起始细胞、成熟根瘤(ms)中的厚壁细胞层均出现生长素分布区域的扩张。这也说明dr5v2转基因植株能够指示根瘤发育过程中的生长素浓度变化。

有益效果：

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110>福建农林大学

<120>

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>435

<212>dna

<213>大豆

<400>1

atggccatccaccac

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