一种海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂、制备方法及应用与流程

技术领域：

本发明属于除草剂技术领域，涉及一种海洋真菌来源fusarisetin类除草剂、制备方法及应用。

背景技术：
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我国是农业大国，农作物病虫草害严重危害农业生产，每年造成巨大的经济损失。传统的化学农药虽然在一定程度上减少这些危害，但是由此带来的环境污染、食品安全和病原抗性等问题日益严重。特别是对于除草剂而言，现有的除草剂毒性大，对环境污染严重，而且能够对农作物产生药害，因此研发新型生物除草剂迫在眉睫。现有的生物除草剂大多为复配生物除草剂，如cn201310367156.9公开了一种复配生物除草剂及其使用方法，为生物除草剂和有机酸复配应用技术；所述生物除草剂包括了利用孢子、菌丝和代谢物类型；所述有机酸选自草酸、乙酸或甲酸；所述生物除草剂与有机酸的质量比为1:0.02～1:4，使用时可将生物除草剂与有机酸一起配置水剂进行喷洒，也可分别进行喷洒；cn201510917947.3涉及以植物提取液为主要活性成分的植物源生物除草剂及其制备方法，该生物除草剂通过以下原料制备而成：狼毒20-40份，鬼臼35-50份，百部20-30份，苍术43-50份，仲烷基磺酸钠2-4份，三乙醇胺1.5-1.8份；cn201510334784.6公开了一种生物除草剂菌克阔的固体颗粒及其制备方法。所述的固体颗粒由固体基质、齐整小核菌菌丝团、粘合剂和水为原料制粒所得；所述固体基质、齐整小核菌菌丝团、粘合剂和水的重量比为30：35～55：0.4～12：12～16；所述固体基质选自水稻秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、加拿大一枝黄花秸秆、甘蔗秸秆、大豆秸秆、稻壳、棉籽壳、园林枯枝或锯木屑中的任意一种或多种，所述的粘合剂选自白炭黑或糯米粉，利用液体发酵技术，生产菌丝，耗时缩短至固体发酵的一半以上。将微生物农药活性物菌丝包覆在固体粉末材料中形成颗粒制剂，从而起到延长贮藏期，提高药效，减少使用量。

海洋具有高压、高盐、低溶氧、寡营养和少光等特殊的环境条件，造就了海洋微生物在生存繁殖、新陈代谢等方面的特异性，因而能够产生许多结构新颖、生物活性多样显著的次级代谢产物。近年来，人们逐渐把目光投向了资源丰富、环境独特的海洋，期望从海洋环境中筛选出新型生物农药，用于植物病虫草害的生物防治，其中，海洋真菌被认为是活性天然产物发现的最佳储库。截至目前，除申请人外，还没有报道过海洋真菌除草活性的研究。fusarisetin类化合物是一类新颖的含有decalin(6/6)和tricyclic(5/5/5)的五环体系化合物，2011年韩国课题组首次报道，并且发现了该类化合物具有很强的抑制肿瘤细胞增殖作用，但并未公开其除草作用。本发明发现了两个结构新颖的fusarisetin类化合物，并且首次报道了该类化合物的除草活性。

技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，针对目前在除草剂方面十分缺少的生物除草剂，设计提供一种海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂、制备方法及应用，从海洋真菌木贼镰刀菌(fusariumequiseti)当中分离鉴定出两个结构新颖的fusarisetin类化合物fusarisetinsc(化合物1)和d(化合物2)，其中fusarisetind为首个具有6/6十氢化萘和5/5二环嵌合的fusarisetin类化合物；同时发现了新化合物和已知化合物fusarisetinsa(化合物3)和b(化合物4)对反枝苋等双子叶植物的除草活性。

为了实现上述目的，本发明所述海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂包括fusarisetinsa、fusarisetinsb、fusarisetinsc和fusarisetinsd，其中fusarisetinsa、fusarisetinsb为现有技术中已知的化合物，fusarisetinsc的分子式为c21h27no5,分子量为373.44,无色单斜晶体,其晶体参数为α＝90.00°,β＝95.281(10)°,γ＝90.00°,空间群为c2,z＝4,dx＝1.196mg/m³,μ＝0.694mm^-1,andf(000)＝800，晶体尺寸为0.08×0.07×0.07mm³，reflectionscollected/unique为6383/2896[r(int)＝0.0556]，r1＝0.0607,wr2＝0.1313(i>2σ(i))，flackparameter(弗朗克常数)为0.0(5)；fusarisetind的晶体数据为c22h31no5,分子量为389.22,无色油状单斜晶体,其晶体参数为α＝90.00°,β＝94.435(4)°,γ＝90.00°,空间群p21,z＝4,dx＝1.236mg/m³,μ＝0.705mm^-1,andf(000)＝840，晶体尺寸为0.12×0.11×0.11mm³，reflectionscollected/unique:8355/5693[r(int)＝0.0199]，r1＝0.0459,wr2＝0.1026(i>2σ(i))，flackparameter(弗朗克常数)为0.0(2)。

本发明制备fusarisetin类除草剂的具体过程为：

(1)将木贼镰刀菌(fusariumequiseti)采用大米固体培养基发酵培养100瓶，其中每瓶80g大米加120ml水，28℃发酵培养30d得到发酵后的木贼镰刀菌；

(2)将发酵后的木贼镰刀菌采用乙酸乙酯浸泡三次，每次浸泡2小时后真空浓缩得到乙酸乙酯提取物；

(3)将乙酸乙酯提取物经过减压柱梯度洗脱(0–100％石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯–甲醇0–100％)后按照极性由小到大的顺序得到六个组分fr.1-fr.6；

(3)将组分fr.3经过ods反相硅胶柱洗脱(溶剂比例为30–90％甲醇-水)，然后通过凝胶柱层析sephadexlh-20(二氯甲烷/甲醇,体积比1/1)，按照极性由小到大的顺序得到得到八个组分fr.3-1–fr.3-8；将组分fr.3-6通过高效液相色谱法(hplc，55％meoh–h2o)分离得到5.0mg化合物1即得到fusarisetinsc；

(4)将组分fr.4经过正向硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝20/80to100/0)，按照极性由小到大的顺序得到五个组分fr.4-1–fr.4-5，再将组分fr.4-2经过ods反相硅胶柱30–90％甲醇–水洗脱，然后通过凝胶柱层析sephadexlh-20(二氯甲烷/甲醇,体积比,1/1)，按照极性由小到大的顺序得到九个组分fr.4-2-1–fr.4-2-9，将组分fr.4-2-6再经过高效液相色谱40％乙腈–(水+0.1％三氟乙酸)纯化得到化合物3和4，即为fusarisetinsa、fusarisetinsb；

(5)将组分fr.5经过ods反相硅胶柱层析(洗脱梯度30–80％甲醇–水)，按照极性由小到大的顺序得到八个组分fr.5-1–fr.5-8，其中的组分fr.5-7经过sephadexlh-20凝胶柱层析(二氯甲烷：甲醇(体积比,1:1))分离和高效液相色谱(60％甲醇–水)制备，得到化合物2，即fusarisetind。

本发明将所述海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂用于除草的具体过程为：先将反枝苋等双子叶植物种子用3％-5％次氯酸钠(naclo)溶液消毒5-15min，用无菌水冲洗几次，除去次氯酸钠，再将化合物用甲醇溶解，配制成0.2mg/ml和0.05mg/ml的溶液，然后在24孔板中放入滤纸，每孔加入200μl化合物溶液，待溶剂挥发后，每孔加入200μl无菌水，密封后放入光照培养箱28℃，12h光照，12h黑暗培养，4天后统计发芽率和根茎生长情况。

本发明所述海洋真菌fusariumequisetigly27genbank(ncbi)登录号为ky945342所述海洋真菌已于2017年7月3日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号是cgmcc14348，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明与现有技术相比，设计的fusarisetin类除草剂为新型海洋微生物源除草剂，针对反枝苋等双子叶植物，对其种子萌发和根茎生长具有明显的抑制作用。对移栽的农作物来说，对幼苗无明显毒副作用。

附图说明：

图1为本发明所述海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂的分子结构图，其中(a)为化合物1，(b)为化合物2，(c)为化合物3，(d)为化合物4。

图2为本发明所述化合物1的x-ray结构图。

图3为本发明所述化合物3的x-ray结构图。

图4为本发明所述化合物1的氢谱(500mhz，cd3od)图。

图5为本发明所述化合物1的碳谱(125mhz，cd3od)图。

图6为本发明所述化合物1的氢谱(500mhz，dmso-d6)图。

图7为本发明所述化合物1的碳谱(125mhz，dmso-d6)图。

图8为本发明所述化合物1的高分辨质谱图。

图9为本发明所述化合物2的氢谱(500mhz，cd3od)图。

图10为本发明所述化合物2的碳谱(125mhz，cd3od)图。

图11为本发明所述化合物2的氢谱(500mhz，dmso-d6)图。

图12为本发明所述化合物2的碳谱(125mhz，dmso-d6)图。

图13为本发明所述化合物2的高分辨质谱图。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

本实施例所述海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂包括fusarisetinsa、fusarisetinsb、fusarisetinsc和fusarisetinsd，其中fusarisetinsa、fusarisetinsb为现有技术中已知的化合物，fusarisetinsc的分子式为c21h27no5,分子量为373.44,无色单斜晶体,其晶体参数为α＝90.00°,β＝95.281(10)°,γ＝90.00°,空间群为c2,z＝4,dx＝1.196mg/m³,μ＝0.694mm^-1,andf(000)＝800，晶体尺寸为0.08×0.07×0.07mm³，reflectionscollected/unique为6383/2896[r(int)＝0.0556]，r1＝0.0607,wr2＝0.1313(i>2σ(i))，flackparameter(弗朗克常数)为0.0(5)；fusarisetind的晶体数据为c22h31no5,分子量为389.22,无色油状单斜晶体,其晶体参数为α＝90.00°,β＝94.435(4)°,γ＝90.00°,空间群p21,z＝4,dx＝1.236mg/m³,μ＝0.705mm^-1,andf(000)＝840，晶体尺寸为0.12×0.11×0.11mm³，reflectionscollected/unique:8355/5693[r(int)＝0.0199]，r1＝0.0459,wr2＝0.1026(i>2σ(i))，flackparameter(弗朗克常数)为0.0(2)。

本实施例制备fusarisetin类除草剂的具体过程为：

(1)将木贼镰刀菌(fusariumequiseti)采用大米固体培养基发酵培养100瓶，其中每瓶80g大米加120ml水，28℃发酵培养30d得到发酵后的木贼镰刀菌；

(2)将发酵后的木贼镰刀菌采用乙酸乙酯浸泡三次，每次浸泡2小时后真空浓缩得到乙酸乙酯提取物；

(3)将乙酸乙酯提取物经过减压柱梯度洗脱(0–100％石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯–甲醇0–100％)后按照极性由小到大的顺序得到六个组分fr.1-fr.6；

(3)将组分fr.3经过ods反相硅胶柱洗脱(溶剂比例为30–90％甲醇-水)，然后通过凝胶柱层析sephadexlh-20(二氯甲烷/甲醇,体积比1/1)，按照极性由小到大的顺序得到得到八个组分fr.3-1–fr.3-8；将组分fr.3-6通过高效液相色谱法(hplc，55％meoh–h2o)分离得到5.0mg化合物1即得到fusarisetinsc；

(4)将组分fr.4经过正向硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝20/80to100/0)，按照极性由小到大的顺序得到五个组分fr.4-1–fr.4-5，再将组分fr.4-2经过ods反相硅胶柱30–90％甲醇–水洗脱，然后通过凝胶柱层析sephadexlh-20(二氯甲烷/甲醇,体积比,1/1)，按照极性由小到大的顺序得到九个组分fr.4-2-1–fr.4-2-9，将组分fr.4-2-6再经过高效液相色谱40％乙腈–(水+0.1％三氟乙酸)纯化得到化合物3和4，即为fusarisetinsa、fusarisetinsb；

(5)将组分fr.5经过ods反相硅胶柱层析(洗脱梯度30–80％甲醇–水)，按照极性由小到大的顺序得到八个组分fr.5-1–fr.5-8，其中的组分fr.5-7经过sephadexlh-20凝胶柱层析(二氯甲烷：甲醇(体积比,1:1))分离和高效液相色谱(60％甲醇–水)制备，得到化合物2，即fusarisetind。

本实施例将所述海洋真菌来源新型fusarisetin类除草剂用于除草的具体过程为：先将反枝苋等双子叶植物种子用3％-5％次氯酸钠(naclo)溶液消毒5-15min，用无菌水冲洗几次，除去次氯酸钠，再将化合物用甲醇溶解，配制成0.2mg/ml和0.05mg/ml的溶液，然后在24孔板中放入滤纸，每孔加入200μl化合物溶液，待溶剂挥发后，每孔加入200μl无菌水，密封后放入光照培养箱28℃，12h光照，12h黑暗培养，4天后统计发芽率和根茎生长情况。

本实施例所述海洋真菌fusariumequisetigly27genbank(ncbi)登录号为ky945342所述海洋真菌已在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号是cgmcc14348。

实施例1：

本实施例通过核磁、质谱、红外、紫外、振动圆二色谱和x-ray单晶衍射确定fusarisetinsc–d(化合物1–2)的结构，化合物2为首个报道的具有6/6十氢化萘和5/5二环嵌合的fusarisetin类化合物，fusarisetinsc–d(化合物1–2)的波谱数据如下：

fusarisetinc(1):无色晶体；[α]²⁰d+15.0(浓度0.25,甲醇)；紫外(甲醇)λmax(logε)202(3.42)nm；氢谱和碳谱数据如表1所示；高分辨质谱m/z372.1825[m-h]^-(c21h27no5的理论值,372.1816).；

fusarisetind(2):无色油状；[α]²⁰d-9.2(浓度0.13,甲醇)；紫外(甲醇)λmax(logε)200(3.19)nm；氢谱和碳谱数据如表2所示；高分辨质谱m/z390.2278[m+h]⁺(c22h32no5的理论值,390.2275)。

表1：fusarisetinc的¹hnmr(500mhz,δinppm,jinhz)和¹³cnmr(125mhz,δinppm)数据

表2：fusarisetind的¹hnmr(500mhz,δinppm,jinhz)和¹³cnmr(125mhz,δinppm)数据

实施例2：

本实施例采用反枝苋和生菜种子作为活性靶标，测试其除草活性，结果如表3所示，具体过程为：

先将反枝苋等双子叶植物种子用3％-5％次氯酸钠(naclo)溶液消毒5-15min，用无菌水冲洗几次，除去次氯酸钠，再将化合物用甲醇溶解，配制成0.2mg/ml和0.05mg/ml的溶液，然后在24孔板中放入滤纸，每孔加入200μl化合物溶液，待溶剂挥发后，每孔加入200μl无菌水，密封后放入光照培养箱28℃，12h光照，12h黑暗培养，4天后统计发芽率和根茎生长情况。

表3：化合物1–4(200μg/ml)对于反枝苋和生菜根芽生长抑制作用

其中“gp”草甘膦.长度<2.0mm认为没有萌发.“-”没有明显的抑制作用。