一种芋螺毒素的纯化方法与流程

本发明涉及一种多肽纯化方法，特别涉及一种芋螺毒素的纯化方法。

背景技术：

芋螺毒素(ctx)，由海洋腹足纲软体动物芋螺的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。每种芋螺的毒液中可能含50～200个活性多肽。不同种芋螺所含活性肽各不相同，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。芋螺毒素多数由10～40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型。

与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性及易于合成等突出优点。它们能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道，不仅可直接作为药物，还可作为理想的分子模板用于发展新药先导化合物，对研究神经生物学也具有重要意义。研究中的疾病治疗范围包括慢性疼痛、癫痫、心血管疾病、精神障碍、运动障碍、痉挛、癌症以及中风等。多种具有强神经肌肉阻断作用的芋螺毒素应用于临床麻醉手术的辅助药物也在进行研究，喉部肌肉的快速麻痹有助于气管内插管等手术。

对于以往芋螺毒素活性环肽的人工合成中，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象，随着hplc的技术成熟，纯化体系的不断完善，工艺的不断成熟，完善的hplc体系已经成为分离此类物质的主要手段。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种芋螺毒素的纯化方法，主要解决现有纯化方法回收率低的技术问题。通过调节溶液的ph，实现样品的分离。本方法确定了分离最佳流程，从而得到高纯度的多肽。该方法分离效果好，多肽活性高。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种芋螺毒素的纯化方法，包括以下步骤：

（1）在芋螺毒素样品中加入纯化水搅拌超声，调节ph值为碱性，超声搅拌溶解直至澄清，用微孔滤膜过滤待用；

（2）将上述样品加入到装有聚合物填料的反相色谱系统；洗脱流动相a相为质量百分浓度0.2-0.3%hac，流动相b相为乙腈；

（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长；

（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用；

（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相a相为质量百分浓度0.1%tfa，流动相b相为乙腈；

（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。

所述聚合物填料为ps-10um-300a。洗脱流动相a相优选质量百分浓度0.3%hac。调节ph值优选为7-8。

本发明的有益效果是：通过调节溶液的ph和二次纯化，实现样品的分离。本方法确定了分离最佳流程，从而得到高纯度的多肽。该方法分离效果好，多肽活性高。

附图说明

图1为实施例1产品hplc图。

图2为实施例2产品hplc图。

图3为实施例3产品hplc图。

图4为实施例4产品hplc图。

具体实施方式

实施例1

（1）在芋螺毒素样品中加入纯化水搅拌超声，调节ph值为7。超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm微孔滤膜过滤待用；

（2）将上述样品加入到装有聚合物填料ps-10um-300a的反相色谱系统；洗脱流动相a相为质量百分浓度0.3%hac，流动相b相为乙腈；

（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长。梯度：流动相b为15-45%；流速：50ml/min；检测波长：220nm；

（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用；

（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相a相为质量百分浓度0.1%tfa，流动相b相为乙腈；

（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。称重后计算回收率为23.4%。产品hplc谱图参见图1。

实施例2

（1）在芋螺毒素样品中加入一定量纯化水搅拌超声，调节ph值为8。超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm微孔滤膜过滤待用；

（2）将上述样品加入到装有聚合物填料ps-10um-300a的反相色谱系统；洗脱流动相a相为质量百分浓度0.3%hac，流动相b相为乙腈；

（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长。梯度：流动相b为15-45%；流速：50ml/min；检测波长：220nm；

（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用；

（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相a相为质量百分浓度0.1%tfa，流动相b相为乙腈；

（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。称重后计算回收率为22.6%。产品hplc谱图参见图2。

实施例3

（1）在芋螺毒素样品中加入一定量纯化水搅拌超声，调节ph值为7。超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm微孔滤膜过滤待用；

（2）将上述样品加入到装有聚合物填料ps-10um-300a的反相色谱系统；洗脱流动相a相为质量百分浓度0.2%hac，流动相b相为乙腈；

（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长。梯度：流动相b为15-45%；流速：50ml/min；检测波长：220nm；

（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用；

（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相a相为质量百分浓度0.1%tfa，流动相b相为乙腈；

（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。称重后计算回收率为20.4%。产品hplc谱图参见图3。

实施例4

（1）在芋螺毒素样品中加入一定量纯化水搅拌超声，调节ph值为8。超声搅拌溶解直至澄清，用0.45μm微孔滤膜过滤待用；

（2）将上述样品加入到装有聚合物填料ps-10um-300a的反相色谱系统；洗脱流动相a相为质量百分浓度0.2%hac，流动相b相为乙腈；

（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长。梯度：流动相b为15-45%；流速：50ml/min；检测波长：220nm；

（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用；

（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相a相为质量百分浓度0.1%tfa，流动相b相为乙腈；

（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。称重后计算回收率为21.6%。产品hplc谱图参见图4。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种芋螺毒素的纯化方法，主要解决现有纯化方法回收率低的技术问题。技术方案如下：一种芋螺毒素的纯化方法，包括以下步骤：（1）在芋螺毒素样品中加入纯化水搅拌超声，调节pH值为碱性。超声搅拌溶解直至澄清，用微孔滤膜过滤待用。（2）将上述样品加入到装有聚合物填料的反相色谱系统；洗脱流动相A相为质量百分浓度0.2‑0.3%HAC，流动相B相为乙腈。（3）设置洗脱梯度、流速及检测波长。（4）收集目标馏分，减压旋蒸后待用。（5）上述馏分用反相高效液相色谱进行二次纯化，流动相A相为质量百分浓度0.1%TFA，流动相B相为乙腈。（6）收集目标馏分，减压旋蒸冻干。

技术研发人员：徐红岩;秦敬国
受保护的技术使用者：江苏吉泰肽业科技有限公司
技术研发日：2019.05.09
技术公布日：2019.08.02