本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌增效剂及其在制备枯草芽孢杆菌菌剂中的应用。
背景技术：
烟草黑胫病和烟草赤星病是烟草生产上的重要病害，病害防治严重依赖化学防治，但是化学防治存在诸多弊端。首先是造成环境污染和农药残留；其次是产生抗药性，防治效果下降，防治成本增加；三是药剂受环境影响大，防治效果不理想。相对于化学防治，生物防治不仅环境友好，而且具有效果较理想等特点，一直是研究热点之一。
枯草芽孢杆菌tpb55对多种病害有较好防效，尤其对烟草赤星、黑胫病及白粉病的防效与生产主用药剂相当，并且具有促进植物生长、提高烟叶品质，增加种植效益等特点。将其加工成制剂，进行烟草病害防治具有较好应用前景。
微生物农药的剂型加工相比普通化学药剂更困难，特别是活体微生物农药。其中重要影响因素就是微生物对外界环境因素如温度、湿度和光照等比较敏感，制剂贮存稳定性差，并且在施用后也容易受到环境因素影响而使药效不能很好地发挥。另外，在一般情况下，生物制剂的生物活性相比化学农药有一定差距。
微生物加工成制剂的另一个难点在于，其与各种助剂的相容性一般比化学农药差，某些助剂可能完全不能使用。
技术实现要素：
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌增效剂及其在制备枯草芽孢杆菌菌剂中的应用。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌增效剂，所述枯草芽孢杆菌增效剂包括如下质量份的组分：0.5～1.5份黄原胶、1～3份荧光素钠、1～3份荧光增白剂cbs-x、1～3份二丁基羟基甲苯、6～9份蔗糖和2～3份硝酸钾。
优选的，所述枯草芽孢杆菌增效剂还包括如下质量份的组分：2～4份十二烷基硫酸钠、1～3份亚甲基双萘磺酸钠和1～3份聚氧乙烯甘油醚。
优选的，所述枯草芽孢杆菌增效剂包括如下质量份的组分：1份黄原胶、2份荧光素钠、2份荧光增白剂cbs-x、2份二丁基羟基甲苯、7.5份蔗糖、2.5份硝酸钾、3份十二烷基硫酸钠、2份亚甲基双萘磺酸钠和2份聚氧乙烯甘油醚。
本发明提供了上述枯草芽孢杆菌增效剂在制备枯草芽孢杆菌菌剂中的应用。
优选的，在所述枯草芽孢杆菌菌剂中，所述枯草芽孢杆菌增效剂与枯草芽孢杆菌原粉的质量比为20～30：60～90。
优选的，所述枯草芽孢杆菌原粉的制备方法包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期，得到活化菌种；
(2)将所述活化菌种按种子罐培养基的体积比8～12％接种量接入种子罐，种子罐培养至对数生长期，得到种子液；
(3)将所述种子液按生产罐培养基的体积比8～12％接种量接入生产罐，生产罐培养至最终生物量≥1010cfu/g，芽孢形成率≥97％，发酵完成，得到培养液；
(4)将所述培养液过滤后喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌原粉。
优选的，步骤(2)所述种子罐培养用培养基配方为：葡萄糖8～12g/l、蛋白胨2～4g/l、mgso40.3～0.7g/l、酵母膏1～2g/l，牛肉膏1～2g/l；培养条件为：溶氧量15～18％，搅拌速度150～250rpm，发酵温度30～32℃。
优选的，步骤(3)所述生产罐培养用培养基配方为玉米粉15～25g/l、豆饼粉40～60g/l、mgso4·7h2o0.4～0.6g/l，mnso4·h2o8～12g/l；培养条件为：溶氧量15-18％，搅拌速度150～250rpm，发酵温度30～32℃。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌菌剂，所述枯草芽孢杆菌菌剂包括如下质量份的组分：70～80份枯草芽孢杆菌原粉、0.5～1.5份黄原胶、1～3份荧光素钠、1～3份荧光增白剂cbs-x、1～3份二丁基羟基甲苯、6～9份蔗糖、2～3份硝酸钾、2～4份十二烷基硫酸钠、1～3份亚甲基双萘磺酸钠和1～3份聚氧乙烯甘油醚。
优选的，所述枯草芽孢杆菌菌剂包括如下质量份的组分：76份枯草芽孢杆菌原粉、1份黄原胶、2份荧光素钠、2份荧光增白剂cbs-x、2份二丁基羟基甲苯、7.5份蔗糖、2.5份硝酸钾、3份十二烷基硫酸钠、2份亚甲基双萘磺酸钠和2份聚氧乙烯甘油醚。
有益效果：本发明提供了一种枯草芽孢杆菌增效剂，所述枯草芽孢杆菌增效剂包括如下质量份的组分：0.5～1.5份黄原胶、1～3份荧光素钠、1～3份荧光增白剂cbs-x、1～3份二丁基羟基甲苯、6～9份蔗糖和2～3份硝酸钾。其中，黄原胶、荧光素钠和荧光增白剂cbs-x相互配合，能对枯草芽孢杆菌起到良好的抗紫外线保护作用；二丁基羟基甲苯能对枯草芽孢杆菌起到良好的抗氧化作用；蔗糖和硝酸钾能分别作为枯草芽孢杆菌的碳源和氮源，在本发明所述比例下能对枯草芽孢杆菌的抑菌活性起到明显增效作用。另外，上述各组分均与枯草芽孢杆菌具有良好的生物相容性。
本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌增效剂在制备枯草芽孢杆菌菌剂中的应用，将所述枯草芽孢杆菌增效剂与枯草芽孢杆菌原粉按20～30：60～90的质量比混合，制得的枯草芽孢杆菌菌剂贮藏稳定性显著提高，对烟草重要真菌病害烟草赤星和黑胫病有良好防效，且能促进枯草芽孢杆菌在烟草根际定殖。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55，于2008年12月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.2843。
具体实施方式
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌增效剂，包括如下质量份的组分：0.5～1.5份黄原胶、1～3份荧光素钠、1～3份荧光增白剂cbs-x、1～3份二丁基羟基甲苯、6～9份蔗糖和2～3份硝酸钾。
本发明所述枯草芽孢杆菌增效剂包括黄原胶、荧光素钠、荧光增白剂cbs-x、二丁基羟基甲苯、蔗糖和硝酸钾。在本发明中，按质量份计，所述黄原胶的用量为0.5～1.5份，优选为1份；所述荧光素钠的用量为1～3份，优选为2份；所述荧光增白剂cbs-x的用量为1～3份，优选为2份；所述二丁基羟基甲苯(bht)的用量为1～3份，优选为2份；所述蔗糖的用量为6～9份，优选为7.5份；所述硝酸钾的用量为2～3份，优选为2.5份。在本发明中，所述黄原胶、荧光素钠和荧光增白剂cbs-x用作枯草芽孢杆菌的紫外线保护剂，能对枯草芽孢杆菌起到良好的抗紫外线保护作用；二丁基羟基甲苯能对枯草芽孢杆菌起到良好的抗氧化作用；蔗糖和硝酸钾能分别作为枯草芽孢杆菌的碳源和氮源，在本发明所述比例下能对枯草芽孢杆菌的抑菌活性起到明显增效作用。另外，上述各组分均与枯草芽孢杆菌具有良好的生物相容性。
本发明所述枯草芽孢杆菌增效剂优选还包括十二烷基硫酸钠、亚甲基双萘磺酸钠(分散剂nno)和聚氧乙烯甘油醚(润湿剂mf)。在本发明中，按质量份计，所述十二烷基硫酸钠的用量优选为2～4份，更优选为3份；所述亚甲基双萘磺酸钠的用量优选为1～3份，更优选为2份；所述聚氧乙烯甘油醚的用量优选为1～3份，更优选为2份。在本发明中，十二烷基硫酸钠、亚甲基双萘磺酸钠和聚氧乙烯甘油醚的作用分别依次是悬浮作用、分散作用和润湿作用，且这三种组分均与枯草芽孢杆菌具有良好的生物相容性。
本发明对上述枯草芽孢杆菌增效剂中的各组分来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。
本发明提供了上述枯草芽孢杆菌增效剂在制备枯草芽孢杆菌菌剂中的应用。优选的，所述应用包括将所述枯草芽孢杆菌增效剂与枯草芽孢杆菌原粉混合。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌增效剂与枯草芽孢杆菌原粉混合的质量比优选为20～30：60～90，更优选为24：76。按本发明所述比例制备得到的枯草芽孢杆菌菌剂能最大程度地发挥增效剂对枯草芽孢杆菌的紫外线保护、防氧化及抑菌增效作用。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌原粉的制备方法，优选包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期，得到活化菌种；
(2)将所述活化菌种按种子罐培养基的体积比8～12％接种量接入种子罐，种子罐培养至对数生长期，得到种子液；
(3)将所述种子液按生产罐培养基的体积比8～12％接种量接入生产罐，生产罐培养至最终生物量≥1010cfu/g，芽孢形成率≥97％，发酵完成，得到培养液；
(4)将所述培养液过滤后喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌原粉
在本发明中，步骤(1)所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌tpb55，由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：cgmccno.2843。
在本发明中，步骤(2)所述种子罐培养用培养基配方优选为：葡萄糖8～12g/l、蛋白胨2～4g/l、mgso40.3～0.7g/l、酵母膏1～2g/l，牛肉膏1～2g/l；更优选为：葡萄糖10g/l、蛋白胨3g/l、mgso40.5g/l、酵母膏1.5g/l，牛肉膏1.5g/l。培养条件优选为：溶氧量15～18％，搅拌速度150～250rpm，发酵温度30～32℃；更优选为：溶氧量16～17％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃。
在本发明中，步骤(3)所述生产罐培养用培养基配方优选为玉米粉15～25g/l、豆饼粉40～60g/l、mgso4·7h2o0.4～0.6g/l，mnso4·h2o8～12g/l；更优选为：20g/l、豆饼粉50g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·h2o10g/l。培养条件优选为：溶氧量15-18％，搅拌速度150～250rpm，发酵温度30～32℃；更优选为：溶氧量16～17％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌菌剂，所述枯草芽孢杆菌菌剂包括如下质量份的组分：70～80份枯草芽孢杆菌原粉、0.5～1.5份黄原胶、1～3份荧光素钠、1～3份荧光增白剂cbs-x、1～3份二丁基羟基甲苯、6～9份蔗糖、2～3份硝酸钾、2～4份十二烷基硫酸钠、1～3份亚甲基双萘磺酸钠和1～3份聚氧乙烯甘油醚。优选的，所述枯草芽孢杆菌菌剂包括如下质量份的组分：76份枯草芽孢杆菌原粉、1份黄原胶、2份荧光素钠、2份荧光增白剂cbs-x、2份二丁基羟基甲苯、7.5份蔗糖、2.5份硝酸钾、3份十二烷基硫酸钠、2份亚甲基双萘磺酸钠和2份聚氧乙烯甘油醚。
本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂整体上相较于现有常规菌剂贮藏期稳定性提高，田间定殖能力增加，对病害防治效果增加。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
称取1g黄原胶、2g荧光素钠、2g荧光增白剂cbs-x、2g二丁基羟基甲苯、7.5g蔗糖和2.5g硝酸钾。然后将上述称取获得的原料混合均匀，控制加工温度在25℃左右，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，得到枯草芽孢杆菌增效剂。
实施例2
称取1g黄原胶、2g荧光素钠、2g荧光增白剂cbs-x、2g二丁基羟基甲苯、7.5g蔗糖、2.5g硝酸钾、3g十二烷基硫酸钠、2g亚甲基双萘磺酸钠和2g聚氧乙烯甘油醚。然后将上述称取获得的原料混合均匀，控制加工温度在25℃左右，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，得到枯草芽孢杆菌增效剂。
实施例3
(1)制备200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌tpb55原粉：
①将枯草芽孢杆菌bacillussubtilistpb55试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
②将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10％接种量接入30l种子罐，培养至对数生长期；种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/l、蛋白胨3g/l、mgso40.5g/l、酵母膏1.5g/l，牛肉膏1.5g/l；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；
③将种子液按生产罐培养基的体积比10％接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为：玉米粉20g/l、豆饼粉50g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·h2o10g/l；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；培养至最终生物量为1010cfu/g，芽孢形成率达97％以上，发酵完成；
④发酵完成后，培养液出罐，过滤，喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌tpb55原粉。
(2)称取步骤(1)制备得到的枯草芽孢杆菌tpb55原粉76g，然后将实施例2制备得到的枯草芽孢杆菌增效剂(共24g)与枯草芽孢杆菌tpb55原粉混合均匀，控制加工温度在25℃左右，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，得到枯草芽孢杆菌菌剂。
实施例4
(1)制备200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌tpb55原粉：
①将枯草芽孢杆菌bacillussubtilistpb55试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
②将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10％接种量接入30l种子罐，培养至对数生长期；种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/l、蛋白胨3g/l、mgso40.5g/l、酵母膏1.5g/l，牛肉膏1.5g/l；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；
③将种子液按生产罐培养基的体积比10％接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为：玉米粉20g/l、豆饼粉50g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·h2o10g/l；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；培养至最终生物量为1010cfu/g，芽孢形成率达97％以上，发酵完成；
④发酵完成后，培养液出罐，过滤，喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌tpb55原粉。
(2)称取步骤(1)制备得到的枯草芽孢杆菌tpb55原粉76g；称取1g黄原胶、2g荧光素钠、2g荧光增白剂cbs-x、2g二丁基羟基甲苯、7.5g蔗糖、2.5g硝酸钾、3g十二烷基硫酸钠、2g亚甲基双萘磺酸钠和2g聚氧乙烯甘油醚。然后将上述称取获得的全部原料混合均匀，控制加工温度在25℃左右，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，得到枯草芽孢杆菌菌剂。
实施例5
采用含药培养基法测定增效剂对枯草芽孢杆菌离体抑菌活性的影响：
取稀释好的枯草芽孢杆菌次生代谢物3ml，加入冷却至45℃的27ml的pda培养基中，制成所需要终浓度的含药培养基平板。然后从培养7天的烟草黑胫病病原菌、烟草赤星病病原菌菌落边缘制取6mm直径菌丝块，移至各系列含药培养基上，菌丝面朝下，每处理3次重复。处理完毕，置于28℃的恒温生化培养箱中培养。5d后调查菌落直径，并计算抑菌率。试验结果见表1。
表1显示，枯草芽孢杆菌对烟草黑胫病病原菌和烟草赤星病病原菌都有较好抑制效果，并且随着枯草芽孢杆菌浓度增加，抑制效果随之增加。按设计添加实施例2提供的增效剂(tpb55:增效剂80:20)，枯草芽孢杆菌抑菌效果有一定提高。针对烟草黑胫病病原菌，添加增效剂的3个浓度的抑制效果分别比未加增效剂相应浓度枯草芽孢杆菌抑菌效果提高7.18％、14.35％和4.22％。针对烟草赤星病病原菌，添加增效剂的3个浓度的抑制效果分别比未加增效剂相应浓度枯草芽孢杆菌抑菌效果提高5.48％、4.11％和4.43％。
表1增效剂对枯草芽孢杆菌离体抑菌活性增效作用影响
实施例6
(1)增效剂对枯草芽孢杆菌tpb55室温下贮存情况的影响
向枯草芽孢杆菌tpb55室菌剂中加入实施例2提供的增效剂，室温贮存360d，芽孢含量变化情况见表2。
表2显示：增效剂能够明显提高枯草芽孢杆菌tpb55可湿性粉剂在室温下贮藏芽孢存活率。在室温环境下贮藏360d后，助剂处理枯草芽孢杆菌菌剂芽孢存活率为74.19％，较不添加增效剂提高9.9％。
表2助剂对枯草芽孢杆菌tpb55菌剂贮藏期存活率的影响(％)
(2)增效剂对枯草芽孢杆菌tpb55防治烟草赤星病效果的影响
烟草赤星病防治试验于2017年安排在青岛市即墨烟田，烤烟品种为nc89。2017年移栽期为5月17日，在发病初期开始施药。于7月20日、7月30日和8月7日连续喷施添加实施例2提供的增效剂的tpb55菌剂(tpb55:增效剂80:20)，以不添加增效剂的tpb55菌剂400倍液为对照，以40％菌核净可湿性粉剂500倍液为药剂对照，以清水为空白对照。小区面积66.7m2，每小区植烟100株。于7月20日、8月17日各调查一次病情指数。试验结果见表3。
表3表明，tpb55菌剂同增效剂复配后，对烟草赤星病的防治效果高于不添加增效剂处理，防治效果与生产主用药剂菌核净相当。生产中用于防治赤星病时，每亩125克用量为佳，在田间尚未发病或发病初期使用，间隔7～10天，连续用药2～3次。
表3tpb55菌剂对烟草赤星病的田间防治效果(2017)
(3)增效剂对枯草芽孢杆菌tpb55防治烟草黑胫病效果的影响
防治烟草黑胫病试验于2017年安排在中国农科研烟草所即墨实验站黑胫病病圃进行，试验用地为平原田块，土壤为淋溶褐土。6月8日移栽，行距100cm，株距30cm，所有实验小区的栽培条件一致。7月5日人工接种黑胫病菌菌谷5克/株。栽培管理按照试验田统一生产规范进行，符合当地科学的农业实践(gap)。施药3次，移栽时蘸根，移栽后2次，即6月15日和6月27日，使用方法为灌根，亩用药液量为50升，每株100ml。7月15日，至对照黑胫病达到中等程度发病时调查。试验结果见表4。
表4表明，tpb55添加实施例2提供的增效剂后，对烟草黑胫病病的防治效果优于单独使用tpb55。生产中用于防治黑胫病时，每亩125克用量为佳，在移栽时浸根1h，移栽后7～10天灌根1次，移栽后15～20天再灌根一次。
表4tpb55菌剂对烟草黑胫病的田间防治效果(2017)
(4)增效剂对枯草芽孢杆菌tpb55菌剂根际定殖情况的影响
利用gfp标记的tpb55菌株测定其烟草根际定殖情况，结果如表5所示。表5显示：实施例2提供的增效剂能显著提高tpb55菌株在烟草根际的定殖能力。
表5增效剂对枯草芽孢杆菌tpb55菌剂根际定殖的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。