检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟对人不致病，不属于人畜共患病，但猪感染后发病率和病死率可高达100％。目前，asf的实验室检测方法主要包括间接免疫荧光试验、elisa、pcr等。间接免疫荧光试验虽属标准检测方法，但操作繁琐，很难在条件一般的实验室开展，因此目前的检测仍以pcr等常规分子生物学方法为主。然而，这些常规分子生物学方法大多需要与电泳、荧光或测序等技术结合，且以大型仪器和熟练专业技能的操作人员为前提，无法满足兽医基层或现场的快速检测需要。

环等温扩增是一种核酸扩增新技术，其特点是仅需针对靶基因6个区域的特异引物，在恒温条件即可完成扩增，不需热变性、热循环等过程。为了方便结果判别，通常在lamp反应体系中加入金属离子指示剂，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等，通过反应管的颜色变化观察结果。但遗憾的是，目前这些颜色变化之间色差不大，且通常需要较长的反应时间(60min)。专利《一种检测非洲猪瘟病毒环介导等温的扩增方法》(申请号：201610023649.4，申请日：2016-01-14；公开号：cn105463135a，公开日：2016-04-06)将lamp技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需在反应后开盖加入sybrgreeni进行结果判别，容易产生气溶胶污染。专利《一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法》(申请号：201811085469.4，申请日：2018-09-18；公开号：cn109295255a，公开日：2019.02.01)将lamp技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需借助仪器进行结果判别。专利《一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用》(申请号：201910036166.1，申请日：2019.01.15；公开号：cn109628644a，公开日：2019.04.16)将lamp技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需在反应体系中额外添加mncl2进行结果判别。已有研究表明，在lamp反应体系中额外添加mncl2会降低反应的特异性。

技术实现要素：

本发明的目的首先是提供了一种非洲猪瘟病毒的lamp引物组，其次是提供该lamp快速检测试剂盒，再次是提供该试剂盒的检测方法。

当dna聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的dna双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的ph值降低。基于lamp反应的这个特性，我们通过调整lmap反应体系的缓冲液成分，并在反应体系中添加ph指示剂，在不改变原有lamp反应体系基本组成的基础上，建立了新型比色法lmap检测技术。针对兽医诊断领域缺乏可用于现场使用的asfv快速检测方法这一问题，我们进一步通过设计和筛选针对asfvp72基因的引物组，组装了asfv比色法lamp快速检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

一种检测非洲猪瘟病毒的lamp引物组，由外引物f3和外引物b3、内引物fip和内引物bip、环引物loopb组成；

所述外引物f3的核苷酸序列为：5’-acatgtccgaacttgtgc-3’；

所述外引物b3的核苷酸序列为：5’-tgtaacccctgaaatacaca-3’；

所述内引物fip的核苷酸序列为：

5’-gtctgctcttaaatggcccattg-gatgaggattttgatcggagat-3’；

所述内引物bip的核苷酸序列为：

5’-agtttttcatcgtggtggttattgt-tgtaaaacgcgttcgctt-3’；

所述环引物loopb的核苷酸序列为：5’-cctgcgttttatggacacgta-3’。

一种检测非洲猪瘟病毒的lamp试剂盒，包括上述的检测非洲猪瘟病毒的lamp引物预混液，其中外引物f3终浓度为0.2mmol/l；外引物b3终浓度为0.2mmol/l；内引物fip终浓度为1.6mmol/l；内引物bip终浓度为1.6mmol/l；环引物loopb终浓度为0.4mmol/l。

进一步地，该试剂盒还包括lamp反应预混液(2×)，其中(nh4)2so4终浓度为10mmol/l；kcl终浓度为50mmol/l；tween-20终浓度为0.1％；甲酚红终浓度为0.12mmol/l；koh终浓度为4mmol/l；dntp终浓度为0.8mmol/l；bstwarmstarttmdna聚合酶终浓度为0.32u/μl；mgso4终浓度为6mm。

上述的引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒中的应用。

一种检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒/使用上述引物组或试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

4)使用所述的引物组配置引物混合液，其中外引物f3终浓度为0.2mmol/l；外引物b3终浓度为0.2mmol/l；内引物fip终浓度为1.6mmol/l；内引物bip终浓度为1.6mmol/l；环引物loopb终浓度为0.4mmol/l。

5)配置lamp反应预混液(2×)，其中(nh4)2so4终浓度为10mmol/l；kcl终浓度为50mmol/l；tween-20终浓度为0.1％；甲酚红终浓度为0.12mmol/l；koh终浓度为4mmol/l；dntp终浓度为0.8mmol/l；bstwarmstarttmdna聚合酶终浓度为0.32u/μl；mgso4终浓度为6mm。

6)使用引物混合液和lamp反应预混液(2×)对待测样品进行lamp扩增，得到扩增产物；反应体系为25μl，其中引物混合液6.5μl，lamp反应预混液(2×)10μl，待测样品dna2.0μl，dnasefreewater4.0μl。

4)结果判读：直接肉眼判读，

a)阴性：若扩增产物呈现红色，证明待测样品没有非洲猪瘟病毒感染；

b)阳性：若扩增产物呈现黄色，证明待测样品为非洲猪瘟病毒感染。

进一步地，步骤6)中反应条件包括：恒温反应的时间为40min；恒温反应的温度为64℃。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果：

1)由于lamp检测方法成本低廉，在64℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的pcr仪，因此本发明提供的试剂盒使用成本低。

2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，可以在40min内完成反应。

3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，通过肉眼观察颜色直接进行判定，无需进行复杂操作。

4)本发明提供的试剂盒特异性好，对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪肾上皮细胞传代系pk-15、猪丹毒杆菌、副猪嗜血杆菌血清5型、猪链球菌血清2型的基因组dna都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到470拷贝的非洲猪瘟病毒p72基因。

5)本发明提供的lamp检测试剂盒可快速、敏感的检测非洲猪瘟病毒，该试剂盒操作简单、成本低廉、反应快速、结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

该试剂盒特异性强，敏感性高，重复性好，预期可满足asfv现场快速检测的需求。本发明使得非洲猪瘟病毒的检测过程更加方便、快速、灵敏。该检测试剂盒在整个使用过程不需要复杂仪器，核酸样品制备与扩增程序简便，容易在兽医基层建立与开展。

附图说明

图1是本发明提供的lamp试剂盒特异性实验中的结果图。

图2是本发明提供的lamp试剂盒敏感性试验结果图。

具体实施方式

以下将配合实施例并结合附图来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例中所涉及的材料：

a)非洲猪瘟病毒p72基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；bstwarmstart^tmdna聚合酶购自newengland公司；mgso4(100mm)购自newengland公司；koh购自sigma公司；甲酚红购自macklin公司；(nh4)2so4购自sigma公司；kcl购自sigma公司；tween-20购自sigma公司；病毒核酸提取试剂盒购自magen(美基)生物(r4410-03)；伪狂犬病活疫苗(bartha-k61株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗(lg株)；pk-15细胞购自上海拜力生物技术有限公司；

b)以下生物材料均已在文献“副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重pcr方法的建立与应用.中国兽医学报,2009(9):第1155-1157页.”中公开：血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌。

实施例1lamp引物的设计和合成

根据引物设计原则，针对非洲猪瘟病毒p72基因的保守区域序列，应用lamp引物在线设计软件primerexplorerv5进行内引物和外引物的设计，按照我们的经验保证引物的gc含量在40％～60％之间。根据经验筛选理论值最优的引物组后，继续应用软件primerexplorerv5进行环引物的设计。序列如表1所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μm，-20℃保存。

表1非洲猪瘟病毒的lamp检测引物组

实施例2lamp引物在检测待测病毒中的应用

一、核酸标准品的制备

将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的非洲猪瘟病毒p72基因进行核酸浓度测定后，用超纯水稀释至10ng/μl的浓度(4.7×10⁸拷贝)，作为核酸标准品。

二、lamp检测方法的建立

以浓度为1ng/μl的浓度(4.7×10⁷拷贝)的非洲猪瘟病毒p72基因为模板，应用筛选获得的理论值最优的1套引物(如表1所示)，按照表2配置反应体系，并在64℃反应40分钟。

表2非洲猪瘟病毒lamp检测反应体系

三、lamp检测方法的特异性

使用猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪肾上皮细胞传代系pk-15、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌的基因组dna为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为64℃反应40分钟。得到的结果如图1所示：其中：t1是以猪伪狂犬病毒基因组dna为模板的检测结果；t2是以猪圆环病毒2型基因组dna为模板的检测结果；t3是以猪肾上皮细胞传代系pk-15基因组dna为模板的检测结果；t4是以猪胸膜肺炎放线杆菌基因组dna为模板的检测结果；t5是以血清5型副猪嗜血杆菌基因组dna为模板的检测结果；t6是以血清2型猪链球菌基因组dna为模板的检测结果；7是空白对照；8是以非洲猪瘟病毒p72基因为模板的检测结果；以猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪肾上皮细胞传代系pk-15、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌的基因组dna分别为模板的反应产物呈现紫红色，以非洲猪瘟病毒p72基因为模板的反应产物呈现黄色，结果显示检测体系的特异性良好，可特异的检测到非洲猪瘟病毒。

四、lamp检测方法的敏感性

取10μl浓度为10ng/μl的浓度(4.7×10⁷拷贝)的非洲猪瘟病毒p72基因dna，依次加入90μl的灭菌纯水进行10倍梯度稀释，各取2μl稀释后样品液进行lamp检测(反应体系如表2所示；除了模板有变化，反应条件均为64℃反应40分钟)与oie推荐的荧光定量pcr方法进行检测。

比较lamp检测法与oie推荐的荧光定量pcr检测方法的敏感性。结果如图2所示，图2a是本发明提供的lamp试剂盒敏感性试验结果图；m1为4.7×10⁷拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m2为4.7×10⁶拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m3为4.7×10⁵拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m4为4.7×10⁴拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m5为4.7×10³拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m6为4.7×10²拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m7为47拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m8为4.7拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；图2b是本发明利用oie推荐的荧光定量pcr方法进行敏感性试验的结果图；其中，m1为4.7×10⁷拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m2为4.7×10⁶拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m3为4.7×10⁵拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m4为4.7×10⁴拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m5为4.7×10³拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m6为4.7×10²拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m7为47拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；m8为4.7拷贝的非洲猪瘟病毒orf2基因；lamp检测法最低可以检测到470拷贝的非洲猪瘟病毒p72基因dna，比oie推荐的荧光定量pcr的敏感低10倍。但相比之下，本发明提供的新型比色法lamp试剂盒操作更加简单(等温反应)，而且用时更短(只需40min)，结果比较直观(肉眼判别)。

在本发明中关键试剂为甲酚红，lamp反应的发生可促进体系ph值由碱性变成酸性，甲酚红的加入可使反应管由红色变为黄色，这种色差的变化更明显，更能清晰的指示反应结果。

本方法的关键参数为反应时间短，仅需40min，灵敏度高，结果判定直观(阳性黄色，阴性红色)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>检测非洲猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法

<130>2019

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5