一种快速鉴定芽叶早生茶树种质的分子标记方法与流程

本发明属于茶树种质资源鉴定利用与新品种选育领域；具体涉及利用分子标记快速鉴定芽叶早生茶树种质。

背景技术：

茶树是叶用作物，其芽叶的萌发期（或开采期）是茶树的重要经济性状之一。早春气温较低，病虫害基本没有发生，茶园无化学农药使用，且茶树越冬芽积累了大量的有机化合物，因此“头春茶”品质最高，往往价格也较高，且越早上市，价钱越好。茶树芽叶的萌发期与生长环境、栽培管理措施及品种等相关，其中品种因素是基础。不同茶树种质的萌发期差异较大，有的早生种甚至比晚生种提前开采1个月左右，早生种具有更好的市场竞争力，因此早生茶树品种是茶树品种选育的目标之一。

茶树芽叶的萌发期是一个由多基因控制的复杂性状，易受环境条件影响，因此选育芽叶早生茶树品种需要多年、多点重复鉴定。传统方法在选择芽叶早生茶树品种时采用的是田间直接鉴定法，该方法需要在春季茶芽萌发季节观察记载其发芽期，经过茶树正常生长以及年份之间的重复鉴定，从种植茶树到获得鉴定结果往往需要多年(5～6年)。直接鉴定法存在鉴定周期长，鉴定程序复杂，需要耗费大量的人力、物力及财力的缺点。

分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。分子标记辅助育种可以缩短育种年限，加快育种进程，提高育种效率，弥补常规育种方法的缺点。前期，本项目组基于简化基因组测序技术（slaf-seq）及全基因组关联分析法（gwas）在茶树基因组中发现了一个与茶树芽叶萌芽期性状紧密连锁的snp标记位点（sc0002405-p269473），经生物信息学分析发现，该位点上、下游100kb基因组范围内存在7个编码蛋白的基因，包括3个未知功能蛋白基因，2个过氧化物酶基因，1个尿苷-5-磷酸合成酶基因，1个钙调素结合蛋白基因，其中过氧化物酶、尿苷-5-磷酸合成酶、钙调素结合蛋白均与芽叶萌发过程中的物质代谢紧密相关。对该snp位点等位变异分析后发现，“tt”基因型比“tc”、“cc”基因型平均萌芽期分别提早10天、12天，即该snp位点上的“tt”基因型是与茶树芽叶早生性状相关的有利基因型。基于上述发现，我们利用该snp标记附近的dna序列设计了一对dcaps标记引物，利用该引物对不同的茶树种质dna进行pcr扩增、电泳分离及基因型分析即可将芽叶早生茶树种质筛选出来，实现了芽叶早生茶树品种的分子标记辅助育种。

技术实现要素：

传统方法选育芽叶早生茶树品种采用的是田间直接鉴定法，该方法获得鉴定结果往往需要多年(5～6年)，存在鉴定周期长，鉴定程序复杂，需要耗费大量的人力、物力及财力的缺点。本方法通过测定茶树基因组dna特定位置上的分子标记基因型，经简单的实验操作和分析即可将芽叶早生茶树种质挑选出来，利用本发明方法鉴定芽叶早生茶树种质整个过程1个工作日内即可完成。首先，利用本发明鉴定芽叶早生茶树种质耗时短，效率高，可以节约茶树种质鉴定过程中人力、物力、财力；其次，本发明鉴定芽叶早生茶树种质非常方便，只要茶树上有叶片，任何时间均可鉴定，无需在春季茶芽萌发时进行鉴定；第三，本发明鉴定准确率高，应用本发明鉴定出的早生茶树种质准确率可达80%以上。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速鉴定芽叶早生茶树种质的dcaps标记引物，所述dcaps标记引物序列如下：

上游引物序列：5’-accaggccaagatcaagacaagaat-3’；

下游引物序列：5’-tcggaacaatagcactactaacggt-3’。

一种dcaps标记引物鉴定芽叶早生茶树种质的方法，具体包括以下步骤：

（1）茶树种质叶片基因组dna提取；

（2）pcr扩增；

（3）利用限制性内切酶ecorⅰ酶切pcr扩增产物；

（4）电泳检测酶切产物并获得电泳图谱；

（5）分析待测种质电泳图谱。

步骤（1）所述茶树种质叶片基因组dna提取的具体操作为：

1）将研钵中加入3ml1.5%ctab溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0ml研磨溶液转入2.0ml离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次；所述1.5%ctab溶液中，含有终浓度1.5wt%ctab，0.1mtris，20mmoledta，1.4mnacl，所述1.5%ctab溶液的ph为8.0。

2）冷却后，加入600ul的氯仿/异戊醇溶液，混匀，12000r/min，离心15min；

3）吸上清，转入新的1.5ml离心管，重复2）步骤1次；

4）吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/l的naac和1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min；

5）12000r/min，10min，弃上清；

6）加入75%v/v的乙醇溶液洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干；

7）加入50ulddh2o溶解，即为基因组dna。

步骤（2）所述pcr扩增的反应体系为：ddh2o16μl，10×buffer3μl，10mmoll^-1dntp3μl，mgcl22μl，10μmoll^-1上、下游引物各1.5μl，0.5utaq酶1μl，模板基因组dna2μl。

步骤（2）所述pcr热循环程序为：94℃预变性5min，使模板dna充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，重复35个热循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。

步骤（3）所述酶切反应体系为：ecorⅰ限制性内切酶1μl，10×hbuffer5μl，dna1μg，灭菌水补齐至50μl；37℃酶切1h。

步骤（5）所述分析待测种质电泳图谱方法为：将待测茶树种质资源电泳图谱与早生茶树种质资源标准电泳图谱比较，如果图谱一致，则判定该待测茶树种质为芽叶早生茶树种质。

本发明的优点在于：

本发明与直接鉴定法相比，能快速鉴定早生茶树种质，减少不必要的投入，提高早生茶树种质鉴定的效率。其次，由于本发明是对茶树品种的dna分子标记基因型进行鉴定，因此无需在春季茶芽萌发季节进行鉴定，只要茶树上有叶片，任何时间均可鉴定。第三，本发明鉴定准确率高，应用本发明鉴定出的早生茶树种质准确率可达80%以上。该技术可作为筛选芽叶早生茶树种质的新方法。

附图说明

图1为芽叶早生茶树种质资标准电泳图谱。

图2为茶树新品种福云6号电泳图谱。

图3为茶树新品种春桃香电泳图谱。

图4为茶树新品种紫观音电泳图谱。

具体实施方式

1、芽叶早生茶树种质标准电泳图谱

芽叶早生茶树种质标准电泳图谱如图1所示。

2、分析待测种质资源电泳图谱：将待测茶树种质电泳图谱与早生茶树种质标准电泳图谱（图1）比较，如果图谱一致，则判定该待测茶树种质为芽叶早生茶树种质。

具体实施例：

实施例1、茶树新品种福云6号的判定

1、茶树种质叶片基因组dna提取

1）将研钵中加入3ml1.5%ctab(1.5%ctab，0.1mtris，20mmoledta，1.4mnacl，ph8.0)溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0ml研磨溶液转入2.0ml离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

2）冷却后，加入600ul的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min，离心15min。

3）吸上清，转入新的1.5ml离心管，重复2）步骤1次。

4）吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的naac(3mol/l)和1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。

5）12000r/min，10min，弃上清。

6）加入75%的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。

7）加入50ulddh2o溶解，即为dna。

、dcaps标记引物的合成

上游序列（5’-3’）：accaggccaagatcaagacaagaat。

下游序列（5’-3’）：tcggaacaatagcactactaacggt。

、pcr扩增

1）pcr反应体系：ddh2o16μl，10×buffer3μl，dntp(10mmoll^-1)3μl，mgcl22μl，上、下游引物(10μmoll^-1)各1.5μl，taq酶1μl(0.5u)，模板dna2μl。

2）pcr热循环程序：94℃预变性5min，使模板dna充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，重复35个热循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。

、利用限制性内切酶ecorⅰ酶切pcr扩增产物

1）反应体系：ecorⅰ限制性内切酶1μl，10×hbuffer5μl，dna1μg，灭菌水补齐至50μl。

2）反应温度与时间：37℃酶切1h。

、电泳检测酶切产物并获得电泳图谱

1）1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压100v，电泳时间30min，eb浸染15min。

2）bio-radgeldoc2000凝胶成像系统拍照记录电泳结果，获得茶树种质资源电泳图谱（图2所示）。

将图2与芽叶早生茶树种质标准电泳图谱比较，发现茶树种质福云6号电泳图谱与标准电泳图谱一致，则判定茶树种质福云6号是芽叶早生茶树种质。

实施例2、茶树新品种春桃香的判定

1、茶树种质叶片基因组dna提取

1）将研钵中加入3ml1.5%ctab(1.5%ctab，0.1mtris，20mmoledta，1.4mnacl，ph8.0)溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0ml研磨溶液转入2.0ml离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

2）冷却后，加入600ul的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min，离心15min。

3）吸上清，转入新的1.5ml离心管，重复2）步骤1次。

4）吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的naac(3mol/l)和1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。

5）12000r/min，10min，弃上清。

6）加入75%的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。

7）加入50ulddh2o溶解，即为dna。

、dcaps标记引物的合成

上游序列（5’-3’）：accaggccaagatcaagacaagaat。

下游序列（5’-3’）：tcggaacaatagcactactaacggt。

、pcr扩增

1）pcr反应体系：ddh2o16μl，10×buffer3μl，dntp(10mmoll^-1)3μl，mgcl22μl，上、下游引物(10μmoll^-1)各1.5μl，taq酶1μl(0.5u)，模板dna2μl。

2）pcr热循环程序：94℃预变性5min，使模板dna充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，重复35个热循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。

、利用限制性内切酶ecorⅰ酶切pcr扩增产物

1）反应体系：ecorⅰ限制性内切酶1μl，10×hbuffer5μl，dna1μg，灭菌水补齐至50μl。

2）反应温度与时间：37℃酶切1h。

、电泳检测酶切产物并获得电泳图谱

1）1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压100v，电泳时间30min，eb浸染15min。

2）bio-radgeldoc2000凝胶成像系统拍照记录电泳结果，获得茶树种质资源电泳图谱（图3所示）。

将图3与芽叶早生茶树种质资标准电泳图谱比较，发现春桃香茶树新品种电泳图谱与标准电泳图谱不一致，则判定春桃香不是芽叶早生茶树种质。

实施例3、茶树新品种紫观音的判定

1、茶树种质叶片基因组dna提取

1）将研钵中加入3ml1.5%ctab(1.5%ctab，0.1mtris，20mmoledta，1.4mnacl，ph8.0)溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0ml研磨溶液转入2.0ml离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

2）冷却后，加入600ul的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min，离心15min。

3）吸上清，转入新的1.5ml离心管，重复2）步骤1次。

4）吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的naac(3mol/l)和1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。

5）12000r/min，10min，弃上清。

6）加入75%的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。

7）加入50ulddh2o溶解，即为dna。

、dcaps标记引物的合成

上游序列（5’-3’）：accaggccaagatcaagacaagaat。

下游序列（5’-3’）：tcggaacaatagcactactaacggt。

、pcr扩增

1）pcr反应体系：ddh2o16μl，10×buffer3μl，dntp(10mmoll^-1)3μl，mgcl22μl，上、下游引物(10μmoll^-1)各1.5μl，taq酶1μl(0.5u)，模板dna2μl。

2）pcr热循环程序：94℃预变性5min，使模板dna充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，重复35个热循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。

、利用限制性内切酶ecorⅰ酶切pcr扩增产物

1）反应体系：ecorⅰ限制性内切酶1μl，10×hbuffer5μl，dna1μg，灭菌水补齐至50μl。

2）反应温度与时间：37℃酶切1h。

、电泳检测酶切产物并获得电泳图谱

1）1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压100v，电泳时间30min，eb浸染15min。

2）bio-radgeldoc2000凝胶成像系统拍照记录电泳结果，获得茶树种质资源电泳图谱（图4所示）。

将图4与芽叶早生茶树种质资标准电泳图谱比较，发现紫观音茶树新品种电泳图谱与标准电泳图谱不一致，则判定紫观音不是芽叶早生茶树种质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院茶叶研究所

<120>一种快速鉴定芽叶早生茶树种质的分子标记方法

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