小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂的制作方法

本发明属于小胖威利综合征诊断研究领域，具体涉及小胖威利综合征长非编码rna标记物及检测试剂。
背景技术：
：小胖威利综合征(prader-willisyndrome，简称“pws”)是一种多系统紊乱的复杂临床综合征，新生儿发病率为1/12000到1/15000。2018年5月11日，国家卫生健康委员会、科学技术部、工业和信息化部、国家药品监督管理局、国家中医药管理局等五部委联合制定发布的《第一批罕见病目录》，包括小胖威利综合征等121种疾病被收入其中。小胖威利综合征主要的临床特征包括：新生儿或婴幼儿肌张力低下、发育缓慢、有明显的面部特征(窄面、前额窄、长头、杏仁眼)、童年期开始体重迅速增加、青春期发育迟缓、性腺发育不良，智力发育缓慢。临床上易将小胖威利综合征误诊为脑瘫、肌无力、简单性肥胖等或漏诊。pws患者的主要遗传类型有：父源染色体15q11-13区域缺失(65％～75％)、母源单亲二倍体(20％～30％)、印记中心微缺失或突变(1％～3％)、染色体平衡易位(<1％)。与常见疾病相比，罕见病的相关医学研究水平明显滞后。医学界对许多罕见病(例如小胖威利综合征)的发病机制认识受限，检测手段不足，更缺乏有效的治疗方法，因此不少患者及其家庭面临长期辗转求医而无法明确检测的困境；同时因医疗资源分布不均衡等原因，还有许多罕见病(例如小胖威利综合征)患者没有被及时确诊，耽误了治疗干预时间。因此建立简单、高效、易于操作、覆盖范围广的检测检测方法显得尤为重要。目前，检测检测小胖威利综合征的方法包括甲基化特异性扩增(methylation-specificpcr，ms-pcr)及甲基化特异性多重连接探针(methylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，ms-mlpa)。ms-pcr与ms-mlpa技术是利用15号染色体q11-q13区域基因印记中心(imprintingcenter，ic)在父源、母源染色体上甲基化情况存在差异这一分子特征来检测小胖威利综合征。以上两种方法存在样品投入量大、操作复杂、微缺失难以检测等缺点。开发新类型的小胖威利综合征检测标志物及相关试剂十分必要，对小胖威利综合征的及早检测与尽快干预治疗具有重要的意义。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种小胖威利综合征长非编码rna标记物及检测试剂。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5的任意一个或多个联合用于制备或筛选小胖威利综合征检测试剂的用途。所述多个是指两个、三个、四个或五个。在一种实施方式中，sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂用于小胖威利综合征的判断、诊断。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。需要说明的是，所述小胖威利综合征检测试剂并不限定为必须为液体形式。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncrna1的试剂、(2)特异性识别sno-lncrna2的试剂、(3)特异性识别sno-lncrna3的试剂、(4)特异性识别sno-lncrna4的试剂和(5)特异性识别sno-lncrna5的试剂。所述多项是指两项、三项、四项或五项。sno-lncrna1的核苷酸序列如seqidno.1所示。sno-lncrna2的核苷酸序列如seqidno.2所示。sno-lncrna3的核苷酸序列如seqidno.3所示。sno-lncrna4的核苷酸序列如seqidno.4所示。sno-lncrna5的核苷酸序列如seqidno.5所示。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna1的试剂选自特异性扩增sno-lncrna1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna1的引物对包括序列如seqidno.6所示的上游引物sno-lncrna1-qf1和序列如seqidno.7所示的下游引物sno-lncrna1-qr1。或者包括序列如seqidno.8所示的上游引物sno-lncrna1-qf2和序列如seqidno.9所示的下游引物sno-lncrna1-qr2。或者包括序列如seqidno.10所示的上游引物sno-lncrna1-qf3和序列如seqidno.11所示的下游引物sno-lncrna1-qr3。或者包括序列如seqidno.12所示的上游引物sno-lncrna1-qf4和序列如seqidno.13所示的下游引物sno-lncrna1-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna1的引物对为sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna2的试剂选自特异性扩增sno-lncrna2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna2的引物对包括序列如seqidno.14所示的上游引物sno-lncrna2-qf1和序列如seqidno.15所示的下游引物sno-lncrna2-qr1。或者包括序列如seqidno.16所示的上游引物sno-lncrna2-qf2和序列如seqidno.17所示的下游引物sno-lncrna2-qr2。或者包括序列如seqidno.18所示的上游引物sno-lncrna2-qf3和序列如seqidno.19所示的下游引物sno-lncrna2-qr3。或者包括序列如seqidno.20所示的上游引物sno-lncrna2-qf4和序列如seqidno.21所示的下游引物sno-lncrna2-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna2的引物对为sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna3的试剂选自特异性扩增sno-lncrna3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna3的引物对包括序列如seqidno.22所示的上游引物sno-lncrna3-qf1和序列如seqidno.23所示的下游引物sno-lncrna3-qr1。或者包括序列如seqidno.24所示的上游引物sno-lncrna3-qf2和序列如seqidno.25所示的下游引物sno-lncrna3-qr2。或者包括序列如seqidno.26所示的上游引物sno-lncrna3-qf3和序列如seqidno.27所示的下游引物sno-lncrna3-qr3。或者包括序列如seqidno.28所示的上游引物sno-lncrna3-qf4和序列如seqidno.29所示的下游引物sno-lncrna3-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna3的引物对为sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna4的试剂选自特异性扩增sno-lncrna4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna4的引物对包括序列如seqidno.30所示的上游引物sno-lncrna4-qf1和序列如seqidno.31所示的下游引物sno-lncrna4-qr1。或者包括序列如seqidno.32所示的上游引物sno-lncrna4-qf2和序列如seqidno.33所示的下游引物sno-lncrna4-qr2。或者包括序列如seqidno.34所示的上游引物sno-lncrna4-qf3和序列如seqidno.35所示的下游引物sno-lncrna4-qr3。或者包括序列如seqidno.36所示的上游引物sno-lncrna4-qf4和序列如seqidno.37所示的下游引物sno-lncrna4-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna4的引物对为sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna5的试剂选自特异性扩增sno-lncrna5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna5的引物对包括序列如seqidno.38所示的上游引物sno-lncrna5-qf1和序列如seqidno.39所示的下游引物sno-lncrna5-qr1。或者包括序列如seqidno.40所示的上游引物sno-lncrna5-qf2和序列如seqidno.41所示的下游引物sno-lncrna5-qr2。或者包括序列如seqidno.42所示的上游引物sno-lncrna5-qf3和序列如seqidno.43所示的下游引物sno-lncrna5-qr3。或者包括序列如seqidno.44所示的上游引物sno-lncrna5-qf4和序列如seqidno.45所示的下游引物sno-lncrna5-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna5的引物对为sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1。本发明的第二方面，提供特异性识别sno-lncrna1的试剂、特异性识别sno-lncrna2的试剂、特异性识别sno-lncrna3的试剂、特异性识别sno-lncrna4的试剂和特异性识别sno-lncrna5的试剂中的任一项或多项联合用于制备小胖威利综合征检测试剂盒的用途。所述多项是指两项、三项、四项或五项。在一种实施方式中，sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。需要说明的是，所述特异性识别sno-lncrna1的试剂、特异性识别sno-lncrna2的试剂、特异性识别sno-lncrna3的试剂、特异性识别sno-lncrna4的试和特异性识别sno-lncrna5的试剂并不限定为必须为液体形式。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna1的试剂选自特异性扩增sno-lncrna1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna1的引物对包括序列如seqidno.6所示的上游引物sno-lncrna1-qf1和序列如seqidno.7所示的下游引物sno-lncrna1-qr1。或者包括序列如seqidno.8所示的上游引物sno-lncrna1-qf2和序列如seqidno.9所示的下游引物sno-lncrna1-qr2。或者包括序列如seqidno.10所示的上游引物sno-lncrna1-qf3和序列如seqidno.11所示的下游引物sno-lncrna1-qr3。或者包括序列如seqidno.12所示的上游引物sno-lncrna1-qf4和序列如seqidno.13所示的下游引物sno-lncrna1-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna1的引物对为sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna2的试剂选自特异性扩增sno-lncrna2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna2的引物对包括序列如seqidno.14所示的上游引物sno-lncrna2-qf1和序列如seqidno.15所示的下游引物sno-lncrna2-qr1。或者包括序列如seqidno.16所示的上游引物sno-lncrna2-qf2和序列如seqidno.17所示的下游引物sno-lncrna2-qr2。或者包括序列如seqidno.18所示的上游引物sno-lncrna2-qf3和序列如seqidno.19所示的下游引物sno-lncrna2-qr3。或者包括序列如seqidno.20所示的上游引物sno-lncrna2-qf4和序列如seqidno.21所示的下游引物sno-lncrna2-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna2的引物对为sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna3的试剂选自特异性扩增sno-lncrna3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna3的引物对包括序列如seqidno.22所示的上游引物sno-lncrna3-qf1和序列如seqidno.23所示的下游引物sno-lncrna3-qr1。或者包括序列如seqidno.24所示的上游引物sno-lncrna3-qf2和序列如seqidno.25所示的下游引物sno-lncrna3-qr2。或者包括序列如seqidno.26所示的上游引物sno-lncrna3-qf3和序列如seqidno.27所示的下游引物sno-lncrna3-qr3。或者包括序列如seqidno.28所示的上游引物sno-lncrna3-qf4和序列如seqidno.29所示的下游引物sno-lncrna3-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna3的引物对为sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna4的试剂选自特异性扩增sno-lncrna4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna4的引物对包括序列如seqidno.30所示的上游引物sno-lncrna4-qf1和序列如seqidno.31所示的下游引物sno-lncrna4-qr1。或者包括序列如seqidno.32所示的上游引物sno-lncrna4-qf2和序列如seqidno.33所示的下游引物sno-lncrna4-qr2。或者包括序列如seqidno.34所示的上游引物sno-lncrna4-qf3和序列如seqidno.35所示的下游引物sno-lncrna4-qr3。或者包括序列如seqidno.36所示的上游引物sno-lncrna4-qf4和序列如seqidno.37所示的下游引物sno-lncrna4-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna4的引物对为sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna5的试剂选自特异性扩增sno-lncrna5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna5的引物对包括序列如seqidno.38所示的上游引物sno-lncrna5-qf1和序列如seqidno.39所示的下游引物sno-lncrna5-qr1。或者包括序列如seqidno.40所示的上游引物sno-lncrna5-qf2和序列如seqidno.41所示的下游引物sno-lncrna5-qr2。或者包括序列如seqidno.42所示的上游引物sno-lncrna5-qf3和序列如seqidno.43所示的下游引物sno-lncrna5-qr3。或者包括序列如seqidno.44所示的上游引物sno-lncrna5-qf4和序列如seqidno.45所示的下游引物sno-lncrna5-qr4。或者优选地，所述特异性扩增sno-lncrna5的引物对为sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1。本发明的第三方面，提供一种小胖威利综合征检测试剂盒，所述试剂盒中包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncrna1的试剂、(2)特异性识别sno-lncrna2的试剂、(3)特异性识别sno-lncrna3的试剂、(4)特异性识别sno-lncrna4的试剂、(5)特异性识别sno-lncrna5的试剂。所述多项是指两项、三项、四项或五项。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。在一种实施方式中，sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。需要说明的是，所述特异性识别sno-lncrna1的试剂、特异性识别sno-lncrna2的试剂、特异性识别sno-lncrna3的试剂、特异性识别sno-lncrna4的试和特异性识别sno-lncrna5的试剂并不限定为必须为液体形式。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna1的试剂选自特异性扩增sno-lncrna1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna1的引物对包括序列如seqidno.6所示的上游引物sno-lncrna1-qf1和序列如seqidno.7所示的下游引物sno-lncrna1-qr1。或者包括序列如seqidno.8所示的上游引物sno-lncrna1-qf2和序列如seqidno.9所示的下游引物sno-lncrna1-qr2。或者包括序列如seqidno.10所示的上游引物sno-lncrna1-qf3和序列如seqidno.11所示的下游引物sno-lncrna1-qr3。或者包括序列如seqidno.12所示的上游引物sno-lncrna1-qf4和序列如seqidno.13所示的下游引物sno-lncrna1-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna1的引物对为sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna2的试剂选自特异性扩增sno-lncrna2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna2的引物对包括序列如seqidno.14所示的上游引物sno-lncrna2-qf1和序列如seqidno.15所示的下游引物sno-lncrna2-qr1。或者包括序列如seqidno.16所示的上游引物sno-lncrna2-qf2和序列如seqidno.17所示的下游引物sno-lncrna2-qr2。或者包括序列如seqidno.18所示的上游引物sno-lncrna2-qf3和序列如seqidno.19所示的下游引物sno-lncrna2-qr3。或者包括序列如seqidno.20所示的上游引物sno-lncrna2-qf4和序列如seqidno.21所示的下游引物sno-lncrna2-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna2的引物对为sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna3的试剂选自特异性扩增sno-lncrna3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna3的引物对包括序列如seqidno.22所示的上游引物sno-lncrna3-qf1和序列如seqidno.23所示的下游引物sno-lncrna3-qr1。或者包括序列如seqidno.24所示的上游引物sno-lncrna3-qf2和序列如seqidno.25所示的下游引物sno-lncrna3-qr2。或者包括序列如seqidno.26所示的上游引物sno-lncrna3-qf3和序列如seqidno.27所示的下游引物sno-lncrna3-qr3。或者包括序列如seqidno.28所示的上游引物sno-lncrna3-qf4和序列如seqidno.29所示的下游引物sno-lncrna3-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna3的引物对为sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna4的试剂选自特异性扩增sno-lncrna4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna4的引物对包括序列如seqidno.30所示的上游引物sno-lncrna4-qf1和序列如seqidno.31所示的下游引物sno-lncrna4-qr1。或者包括序列如seqidno.32所示的上游引物sno-lncrna4-qf2和序列如seqidno.33所示的下游引物sno-lncrna4-qr2。或者包括序列如seqidno.34所示的上游引物sno-lncrna4-qf3和序列如seqidno.35所示的下游引物sno-lncrna4-qr3。或者包括序列如seqidno.36所示的上游引物sno-lncrna4-qf4和序列如seqidno.37所示的下游引物sno-lncrna4-qr4。优选地，所述特异性扩增sno-lncrna4的引物对为sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4。在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncrna5的试剂选自特异性扩增sno-lncrna5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncrna5的引物对包括序列如seqidno.38所示的上游引物sno-lncrna5-qf1和序列如seqidno.39所示的下游引物sno-lncrna5-qr1。或者包括序列如seqidno.40所示的上游引物sno-lncrna5-qf2和序列如seqidno.41所示的下游引物sno-lncrna5-qr2。或者包括序列如seqidno.42所示的上游引物sno-lncrna5-qf3和序列如seqidno.43所示的下游引物sno-lncrna5-qr3。或者包括序列如seqidno.44所示的上游引物sno-lncrna5-qf4和序列如seqidno.45所示的下游引物sno-lncrna5-qr4。或者优选地，所述特异性扩增sno-lncrna5的引物对为sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1。在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒还包括(6)小胖威利综合征阳性对照品和/或(7)小胖威利综合征阴性对照品。优选的，(1)所述阳性对照品为wth9细胞；(2)阴性对照品为h9p-ko细胞。实时荧光定量pcr反应的整体效率取决于rt反应和pcr扩增反应的效率。pcr扩增可指数放大rt效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。pcr扩增效率100％效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110％。该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。因此验证生物标志物的pcr扩增反应效率显得十分重要。进一步的，所述试剂盒还包括以下特征中的一项或多项：(1)用于检测特异性扩增sno-lncrna1的引物对扩增反应效率的引物对、(2)用于检测特异性扩增sno-lncrna2的引物对扩增反应效率的引物对、(3)用于检测特异性扩增sno-lncrna3的引物对扩增反应效率的引物对、(4)用于检测特异性扩增sno-lncrna4的引物对扩增反应效率的引物对、(5)用于检测特异性扩增sno-lncrna5的引物对扩增反应效率的引物对。优选的，所述(1)用于检测特异性扩增sno-lncrna1的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如seqidno.46所示的上游引物sno-lncrna1-l和序列如seqidno.47所示的下游引物sno-lncrna1-r；(2)用于检测特异性扩增sno-lncrna2的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如seqidno.48所示的上游引物sno-lncrna2-l和序列如seqidno.49所示的下游引物sno-lncrna2-r；(3)用于检测特异性扩增sno-lncrna3的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如seqidno.50所示的上游引物sno-lncrna3-l和序列如seqidno.51所示的下游引物sno-lncrna3-r；(4)用于检测特异性扩增sno-lncrna4的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如seqidno.52所示的上游引物sno-lncrna4-l和序列如seqidno.53所示的下游引物sno-lncrna4-r；(5)用于检测特异性扩增sno-lncrna5的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如seqidno.54所示的上游引物sno-lncrna4-l和序列如seqidno.55所示的下游引物sno-lncrna5-r。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)血液样品来源的sno-lncrnas是一种新型生物标志物，区别于传统的小胖威利综合征检测标志物---dna甲基化。该类新型rna标志物不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确。这些特征将提高小胖威利综合征检测的敏感性和特异性。该类rna标志物的成功开发有助于小胖威利综合征的检测，同时也为其他疾病生物标志物的研发提供借鉴意义。(2)通过检测血液中sno-lncrnas表达来检测人类小胖威利综合征是否发生的试剂盒是一种系统、全面的检测试剂盒。该试剂盒有特异、灵敏、快速和简单方便的特点。该试剂盒的应用有助于小胖威利综合征的检测，为临床医生快速检测小胖威利综合征患者、及时采取干预措施提供支持。(3)采用严密的设计和严格的评价体系。发明人基于前期研究成果，利用高通量测序等实验与技术对poly(a)-rna进行分析，发现正常人体内高表达而小胖威利综合征患者体内缺失表达的sno-lncrnas，且应用rt-qpcr的方法在小胖威利综合征患者血液样本中进行了验证；以上的方法与策略的应用保证了血液样品来源的sno-lncrnas能成为小胖威利综合征生物标志物，并加速了新型小胖威利综合征检测试剂盒的应用。(4)本发明经过广泛而深入的研究发现，可检测干血斑来源的血液样品长非编码rna标记物的表达量来诊断小胖威利综合征，使得长非编码rna标记物应用于小胖威利综合征新生儿筛查。附图说明图1：为sno-lncrnas分子标志物的基因信息与pcr引物识别序列位置图。图2：以sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5分子标志物联合作为生物标志物、pcr产物检测结果。图3：sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5分子标志物实时荧光定量pcr的标准曲线。图4：使用特异性pcr引物检测小胖威利综合征阳性对照品和阴性对照品中对应的分子标志物表达量的检测结果。图5：使用特异性pcr引物检测小胖威利综合征患者血液样品中对应的分子标志物表达量的检测结果。图6：利用roc曲线分析sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5区分正常人组和小胖威利综合征病患组时的敏感性及特异性。图7：测干血斑来源样品中sno-lncrna3的表达情况。图8：利用roc曲线分sno-lncrna3区分干血斑样品来源的正常人组和小胖威利综合征病患组时的敏感性及特异性。具体实施方式长非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是一类长度大于200个核苷酸，缺乏蛋白质编码能力的rna。lncrna能参与一系列的基因表达调控，具备复杂的生物学功能，并在生物学过程中发挥着重要作用，例如染色质修饰、x染色体失活、调控基因转录、蛋白翻译等。lncrna的异常表达调控会导致疾病的发生、如肿瘤、萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病。长非编码rnasno-lncrnas转录自pws核心区域，两端有小核仁rna(snorna)帽子结构，snornp与snorna结合形成稳定复合物，使得sno-lncrnas具有极高的稳定性。sno-lncrnas广泛存在于人体多种组织及细胞中，sno-lncrnas的表达缺失会导致pws疾病的发生。这些特征使得sno-lncrnas在小胖威利综合征检测与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。发明人经过长期研究发现了内含子来源的两端以小核仁rna(snorna)结尾的lncrna(sno-lncrnas)。在人类疾病小胖威利综合征紧密关联区域存在五个sno-lncrnas，分别命名为sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4、sno-lncrna5，它们在人源胚胎干细胞中表达量极高，且异常稳定。小胖威利综合征病人中15号染色体q11-q13区域基因表达缺失，最小核心缺失区域为108kb。正常情况下，sno-lncrnas等长非编码rna均产生自该区域。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1sno-lncrnas分子标志物的基因信息及特异性pcr引物的设计小胖威利综合征sno-lncrnas分子标志物组合包括5条长非编码rna，分别为sno-lncrna1，sno-lncrna2，sno-lncrna3，sno-lncrna4，sno-lncrna5，其染色体上定位(图1)及序列是在ncbigeneexpressionomnibus数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；accessionnumbergse38541)中获得的。小胖威利综合征长非编码rna分子标志物组合的检测试剂为多对特异性引物，该多对引物是通过primer3在线引物设计工具(http://primer3.ut.ee/)设计的，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。特异性引物的核苷酸序列如下：表1实施例2sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5分子标志物联合作为生物标志物pcr产物特异性检测2.1干细胞h9培养及rna的抽提干细胞h9培养在martigel包被的培养皿上，采用cm(fibroblast-conditionedmedium)培养基进行培养，该cm培养基为补加了4ng/ml的成纤维细胞生长因子(bfgf，lifetechnologies)的mef细胞培养基上清。将3.5cm培养皿贴壁生长的h9细胞用pbs洗两次后，加入1mltrizol试剂(invitrogen)，反复吹打直至细胞全部裂解。之后加入0.2ml氯仿，离心后rna处于上层水相，并将其转移到rnase-free的1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇混匀后离心，rna将形成片状沉淀于管底。75％乙醇漂洗两次后，室温晾干，加入适量的rnase-free水溶解。2.2rna反转录、rt-pcr及凝胶电泳反转录时，先用dnasei(ambion)去除基因组污染，然后用primescript逆转录试剂盒(takara)进行反转录，得到cdna，用超纯水稀释3-4倍，放-20℃保存。具体dnasei处理及反转录过程如下：弹匀2min，最高转速离心5min，取上清，可放-80℃保存。10μl5×primescriptbuffer2μlprimescriptrtenzyme0.5μloligodtprimer0.5μlrandom6mers2μldnaseitreatedrna500ngdepc-h20upto10μl37℃反应15min，85℃反应10min。以cdna为模板，利用表1中的特异性pcr引物生物标志物：sno-lncrna1特性引物对sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1、检测生物标志物sno-lncrna2特性引物对sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4、检测生物标志物sno-lncrna3特性引物对sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4、检测生物标志物sno-lncrna4特性引物对sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4以及检测生物标志物sno-lncrna5特性引物对sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1扩增待测dna片段。pcr反应体系如下：10μl2×taqmatermix(vazyme)5μlcdnatemplate0.5μlforwardprimer(10μm)0.4μlreverseprimer(10μm)0.4μlddh2oupto10μl反应条件如下：将pcr产物在1.5％的tae琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳分离，结果如图2所示。实施例3采用标准曲线评估扩增反应效率、灵敏度及可重复性实时荧光定量pcr反应的整体效率取决于rt反应和pcr扩增反应的效率。pcr扩增可指数放大rt效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。pcr扩增效率100％效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110％。该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。因此验证生物标志物的pcr扩增反应效率显得十分重要。反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。利用表2中的特异性pcr引物扩增待测dna片段，作为模板，比较不同sno-lncrnas特性引物对的扩增效率。以cdna为模板，利用表2中的特异性pcr引物扩增待测dna片段，与pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(rt-pcr反应体系及条件同实施例2)，并将相应条带割胶，用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(tiangen)回收，用nanodrop2000测定dna浓度。取10^8个核酸分子作为标准品起始模板量(原液)，将标准品连续依次进行10倍稀释，至10个核酸分子为止。用ddh2o连续稀释的样本核酸为模板，并进行实时荧光定量pcr分析。采用10μ1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。反应体系如下:扩增程序为：95℃10min,(95℃15s,60℃60s)*40个循环,溶解曲线分析。反应在abisteponeplusrealtimepcr仪上进行。数据处理以核酸量为x轴，以ct为y轴，绘制标准曲线(如图3所示)。检测生物标志物sno-lncrna1特性引物对sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1、检测生物标志物sno-lncrna2特性引物对sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4、检测生物标志物sno-lncrna3特性引物对sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4、检测生物标志物sno-lncrna4特性引物对sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4以及检测生物标志物sno-lncrna5特性引物对sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1pcr扩增反应效率在90％-110％的理想窗口内，同时也确定了实时荧光定量pcr可测量的模板量的范围，反映了样本检测的灵敏度；r2>0.99证明了其有极佳的相关度，样品具有极高的可重复性。表2实施例4测定分子标志物在小胖威利综合征阳性对照品和阴性对照品中的差异表达将wth9细胞作为阳性对照，h9p-ko细胞作为阴性对照，两种细胞均来自发明人前期研究成果(http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.10.007)。发明人首次将以上两种细胞用于小胖威利综合征检测相关实验。以上两种细胞的培养条件及方法、rna抽提方法和rna反转录反应体系及条件同实施例2。以上述cdna为模板，分别采用检测生物标志物sno-lncrna1特性引物对sno-lncrna1-qf1和sno-lncrna1-qr1、检测生物标志物sno-lncrna2特性引物对sno-lncrna2-qf4和sno-lncrna2-qr4、检测生物标志物sno-lncrna3特性引物对sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4、检测生物标志物sno-lncrna4特性引物对sno-lncrna4-qf4和sno-lncrna4-qr4以及检测生物标志物sno-lncrna5特性引物对sno-lncrna5-qf1和sno-lncrna5-qr1，进行实时荧光定量pcr分析。实时荧光定量pcr反应体系及条件同实施例2。从图4中可以看出，sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5在阴性对照品中的表达量明显低于阳性对照品。实施例5分析sno-lncrnas对小胖威利综合征的临床检测5.1全血样品采集及rna的抽提全血样品采集自浙江大学医学院附属儿童医院，采集时间为2018年7月。小胖威利综合征患者全血样品7例，正常人全血样品4例，对应作为小胖威利综合征组与正常对照组。上述所有标本的取得均获得试验对象同意及均通过组织伦理委员会的批准。取新鲜抗凝血液按1:3的比例加入血液rna稳定剂(tiangen)(如取300μl健康人新鲜全血加入900μl血液rna稳定剂)立即盖上管盖，上下颠倒混匀8-10次，室温放置2h。利用rnapreppure血液总rna提取试剂盒(tiangen)抽提全血rna(详细步骤及注意事项参考rnapreppure血液总rna提取试剂盒说明书)。5.2rna反转录rna反转录反应体系及条件同实施例2。5.3实时荧光定量pcr实时荧光定量pcr反应以上述cdna为模板，其他反应体系及条件同实施例4.从图5中可以看出，sno-lncrna2、sno-lncrna3和sno-lncrna4在小胖威利综合征组中的表达量明显低于正常对照组，利用t检验(t-test)，sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5的p值小于0.05，证明有显著性差异。如图6所示，我们进一步通过受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)评估sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3和sno-lncrna4区分小胖威利综合征组和正常组时的敏感性和特异性，结果表明它们的曲线下面积(areaundercurveroc，auc)都为1，sno-lncrna5的曲线下面积为0.96，具有极高的灵敏性和特异性，近似“金标准”。上述实验表明，本发明提供的标志物sno-lncrna1、sno-lncrna2、sno-lncrna3、sno-lncrna4和sno-lncrna5用于检测小胖威利综合征的检测性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，能够用于开发成小胖威利综合征的检测试剂盒。实施例6检测干血斑来源样品中sno-lncrna3以诊断小胖威利综合征6.1样品采集及rna抽提血样样品浙江大学医学院附属儿童医院，按照干血斑样品制备及保存要求制备干血斑样品。正常人干血斑样品4例，小胖威利综合征患者干血斑样品4例。上述所有标本的取得均获得试验对象同意及均通过组织伦理委员会的批准。将干血斑用放入rnasefree1.5ml离心管中，加入0.5mltrizol，室温静置30min，震荡摇匀，5min。加入0.1ml的氯仿，震荡摇均匀，4℃离心，12000r/min，15min；取150μl上清液移至新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇，加入1μlglycogen，-20°/-80°静置20min后，12000r/min4℃离心15min，弃上清；向沉淀中加入100μl的预冷75％乙醇漂洗沉淀，12000r/min4℃离心15min，弃上清；重复清洗一次后，12000r/min4℃离心，10sec，用枪吸去残液，室温干燥，约5min；干燥后，加入10μlrnase-freewater进行溶解。6.2rna反转录取上述rna4μl加入rnaasefree八连管中，加入4μlrnase-freewater，加入2μl5xprimescriptrtmastermix，混匀离心，37°，15min，85°，5sec。加入10μlrnase-freewater，将cdna稀释1倍。6.3实时荧光定量pcr检测以步骤6.2中所得cdna为模板，采用检测生物标志物sno-lncrna3特性引物对sno-lncrna3-qf4和sno-lncrna3-qr4，进行进行实时荧光定量pcr分析。具体地，取上述cdna0.5μl/靶基因，thunderbirdsybrqpcrmix(toyobo)5.2μl/靶基因，10μm检测引物0.4μl/靶基因，5.2μlrnase-freewater。扩增程序为：95℃10min,(95℃15s,60℃60s)*40个循环,溶解曲线分析。反应在abisteponeplusrealtimepcr仪上进行。从图7中可以看出，ssno-lncrna3在正常人干血斑对照品中的表达量明显高于小胖威利综合征患者干血斑样品。也就是说，ssno-lncrna3在小胖威利综合征组干血斑中的表达量明显低于正常人干血斑对照品。利用t检验(t-test)sno-lncrna3的p值小于0.05，证明有显著性差异。我们进一步通过受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)评估干血斑中的sno-lncrna3在区分小胖威利综合征组和正常组时的敏感性和特异性，结果如图8所示，曲线下面积(areaundercurveroc，auc)为1，具有极高的灵敏性和特异性，近似“金标准”。上述实验表明，本发明提供的标志物sno-lncrna3应用于干血斑样本检测小胖威利综合征的检测性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，能够用于开发成针对干血斑样本的小胖威利综合征的检测试剂盒。综上所述，本发明能够应用于新生儿小胖威利综合征筛查。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>小胖威利综合征长非编码rna标记物及检测试剂<150>2018111899739<151>2018-10-12<160>55<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2003<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1uggaucgaugaugaguccuccaaaaaaaacauuccuuggaaaagcugaacaaaaugagug60aaaacucauaccgucauucucaucggaacugagguccagcacauugcuuccucuggggcc120uuuacuagugagggacaacuuccacuagucccuauagguucuaacacccauggcguucac180aggugaaggucuccugucauauuacaaacauuccccccacuccccucccaaaaaaaggaa240cauuuccucugugucagguacacaggucagagagucauagggugacuggcugcucuguga300uggcauaguggccguggaaguggauggaaaugucgcaggcuuaggggaguguggggcugg360ccucggcuuggugagcucccaggaagggggaccuggaaaucgcugcgggcauccuugcau420agaggaccagguacguguuccaguucugcuuucaaggagagcaugaggcccaggccucag480acaguccuuggucuugaucuuugguuagcugaggacaggggagugccaagggugauaggg540gagagcgcacagcaauggauguuguggcagacagcuaaagccuuucugucccuccuuuca600cggucagucccagggggcccccagcacagacuuuuuucaccucucgagcugugagauucc660ugugguguuguggccaagccugggcaggaagguaccccagagaaaagguuguagagggcu720cacguggacaugcaugccaucaguggucuugggcugucauuugguggugaugggcuuucc780agggauuucucugguggaugacagguuggccauugggggucuucaagggcagguccuagg840gagcaugagggucgggcugaugccugugguccugggucacuccauucuuccuggcagagu900aguagaaguguccaucuuccuggaaauggucucuuggcccgccauugccaggcggcccca960ccugcugcagcucgugugagcaaauacugcucuggaucccauuucccgcuuugaaagcag1020cuuccaucccaaaggcguccagagggaaugugcccuggcccuggcccuggccugggacuc1080uccgaugggguccagucacacuuggcguauucauggagguccuugugcauuccaggcaac1140acaugugcaauaccaggggcacugccguggagagucucuugauuugggaugccuccucgc1200cuuuguguguuggcgauguuccaguauuggauucugcuacauccucagggcaaugaagcg1260uuucagcucacuuagccgguuugacaucauagugcagccaggacagccgugccacauugg1320cauggcacauaguugacuuaggacagucggaaaggguuggugguucuaugucucgcagcu1380cacuucauagcuguuugcauguaaaccuggugaugguguugagaugguguugacuugcug1440acguuggggugguugguagugcaguuaaguuggcugcaugaugggauguugccucagaug1500ucggugcagcgaagcccuguagguguguccaaugcaaggaaaaugaaagguggugugucc1560uguccaccuugucuuuagggguucaggcaggaauguccuguuggaaaacuagccauuccc1620uuuguguguccugaaggcauggugcgggcaugugaacugauuggaggaaggaagugugug1680ucuugagguccuuuggcuggguucagaagacugucucuggccuugaugccgugugccgug1740uuuaagaccaacgugguggccauugcaaaggugccuuccagugcaaguuuugguugguuu1800ggugucaggugugccuuaccugggagagcggcgagagacagugucuggucacgacauuau1860augccccguaaggaggacugugugcuugcaccgccaggggugcuggcuguuagucgaggg1920acaucaggccaaugucugucugaccccuaggucaaaauucgcauccuacugauugaaggc1980cuugggucucgagccuuuugguu2003<210>2<211>1191<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2uggaccaaugaugacuuccauacaugcauuccuuggaaagcugaacaaaaugagugggaa60cucuguacuaucaucuuaguugaacugagguccaccgggggcuauagagggacaacuguc120auuuuuuuugaugcccguugcaugaagcauucuuccaggcuuaggaagggauuccguuug180ggugaaggagagucacaggggaguugaggcuaugugcacaggacuucugucuacaaggcu240gggguagcacacaugcaguccgugggacuaggugaaugugcagguugcucagggagaguu300aaccuguagccugccucuggguggccaagauuguccuugacuccuggcucuggguuccca360caaccccuggaggaagacaaguaauugugcuugggaagagagaacaaggccauacuuuug420ccuuucuuuuuuucauucuuaguuugagaacaguggaguuccaaucaccuggcauagcuu480ucauguuguguuccaugcauugugaguacaugcauauggcaggaacacacagguucccac540ugcaagcugagccugauaggcaaggagucucuagcuuaaccccagcccaguguacgucaa600uggcuuccucauuaaaauugcauggcccuguagcuuuugugagugacauuauagguaucg660auguaaggguguugagagggaugcucaaugucagugcucuuuagugugcugaugcacuac720uacaagggcaccugagcccuuguccaugcauuucuguguccaaaaucagguaaagccaga780guuggguaucaaccagauacacugcaggggaucagaggacauggccuuuguguacugcac840aucugucagauuuucucaagcacacccguguuuccucuucaccucccacguggaagugau900gaauuggccaggaccauguuggugagggacaaucaucaucucauguuaaccucagagaag960ccaggaagcuccuggacacacaugguguaggcuuccuuggaggcuguuggaucucuccug1020aauguaagcaauuccuucccagugcacccugauuuuccucauuugcagaaacaaagauug1080uguguggaucgaugaugacuuccauauauacauuccuuggaaagcugaacaaaaugagug1140aaaacucuauaccgucauucucgucgaacugagguccagcacauuacucca1191<210>3<211>1249<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3uggaucgaugaugacuuccuuauauacauuccuuggaaagcugaacaaaaugagugaaaa60cucuauaccgucauccucgucgaacugagguccagcacauugcucuuacaggggcuagag120agagagggacaaauuucauuugaugaugcccauugcaccaagggguucuguccaggcuua180ggauggggucucguuugggcaaaggagaauggcaggggaguggaggcuauguacacagga240gauuccuuguuugaaggacucuauuugugaggccaggguaccacacaugcuguccgcagg300aguaggugaaugugcaguugcccaggaagaguuagccuguagccugccucugcauggcag360uuuguccuuggguccuggcucuggauuuccauguuccuuggaggaggauaggugauuuug420cuugagaagacagcacaguaccauacuuuuguuguuuuucugcucauuucaucguccauu480gaggacaaugaaguuguggucagcaggcauagcuuucaggccagcgugcccauguugugu540cccaugcauugugagcacaugcauguggcaugaacacauaggcugccacuccaagcugag600ucugauaggcaaugagacucuggcuuauccugaucccgguguagaucaaagucuucccag660uaggauugcauggccccgaggcuauugugagcugcauugcagguguggaagcaagggugu720ugagagggaugcucaacauuagugcucuuuagcgagaugaugcacuauaagggcacccug780aacccagacgugcaucccuauguacgugcauuucuguguccauaaauaguugaagccaga840cagccagauuccagauguaucgcagggggcuggaugacauggcccuugucaccuguguac900cugucugccuuucugaagcacgcuuguguuuccucuacaccucccagguagcauuggcau960ggaaggcaggcccauguuggugagggacaauuguuaucuugugugagccgcagggauacc1020aggaaaccccuggacacaaauggcaaaggcuucuuuggaaguuguuggaucccuucugca1080uguaagcaguu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