本发明涉及一种有机化学合成方法，具体地说是一种以3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b合成1-n-乙基小诺霉素的方法。
背景技术：
硫酸依替米星(1-n-乙基庆大霉素c1a硫酸盐)是我国科研人员自行研制的，拥有自主知识产权的高效、低毒、抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素，是唯一获得国家一类新药证书的抗感染药物。其制剂硫酸依替米星注射液适用于对其敏感的大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、枸橼酸杆菌、肠杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、嗜血流感杆菌、绿脓杆菌和葡萄球菌等引起的各种感染，临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效：
呼吸道感染：如急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区肺部感染等；
肾脏和泌尿生殖系统感染：如急性肾盂肾炎、膀胱炎、慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等；
皮肤软组织和其它感染：如皮肤及软组织感染，外伤、创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。
药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大的关系。
目前，硫酸依替米星制备方法主要包括以下文献：
1-n-乙基小诺霉素结构式如下：
该化合物在h.wang,zj.zhang,f.fei,isolationandstructurecharacterizationofrelatedimpuritiesinetimicinsulfatebylc/esi-msnandnmr,journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis[j].55(2011),902-907.文献中已经有所报道，根据该文献，1-n-乙基小诺霉素是硫酸依替米星原料药以及制剂中残留的主要杂质之一，在越来越严格的技术标准的今天，1-n-乙基小诺霉素已经成为必须予以检测和控制的杂质之一了，但现有技术没有公开纯度高的1-n-乙基小诺霉素的标准品出售，也无相应的制备方法文献报道。在硫酸依替米星原料药及其制剂的质量标准提高研究过程中，不可避免的需要使用到杂质对照品。因此，开发一种1-n-乙基小诺霉素的制备工艺并对之进行纯化处理，以达到标准品的要求，对于提高药品质量，提高临床用药的安全性具有重大的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种1-n-乙基小诺霉素的制备方法。
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：
(1)向乙腈，乙酸酐和浓硫酸混合溶液中，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b，加热回流后，蒸馏出乙腈；
(2)反应液降温至0～10℃，加入二氯甲烷和乙醛，在0～10℃下反应，随后加入硼氢化钾、硼酸缓冲液，继续反应，反应后常压加热浓缩；
(3)向浓缩液中加入氢氧化钠溶液，常压加热蒸馏，蒸出部分溶剂，在加入氢氧化钠溶液，加热回流，反应完毕，体系降至室温，过滤得到滤液；
(4)除盐后通过分离得到目标产物1-n-乙基小诺霉素。
其中，步骤(1)中的乙酸酐与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比2:1～9:1；浓硫酸与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比0.05:1～1.5:1，加热温度在80～100℃回流1-3h。优选的，步骤(1)中的乙酸酐与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比4:1～8:1；浓硫酸与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比0.09:1～1.2:1，加热温度在90℃回流2h。
其中，步骤(2)中的乙醛与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比1:1～4:1，硼酸缓冲溶液调节溶液的ph值至8～11，硼氢化钾与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比4:1～8:1。优选的，步骤(2)中的乙醛与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比1.5:1，硼酸缓冲溶液调节溶液的ph值至10，硼氢化钾与3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b的摩尔比5:1～6.5:1。
其中，步骤(3)中加热温度在110～140℃，回流20～25h。优选的，步骤(3)中加热温度在125℃，回流24h。
其中，步骤(4)中分离是先通过制备液相分离得到1-n-乙基小诺霉素。
优选的，本发明的制备方法，包括以下步骤：
(1)在装有带干燥管的回流冷凝管的100ml干燥圆底烧瓶中，投入乙腈8-16ml，乙酸酐0.65-2.9ml，浓硫酸0.01-0.04ml，搅拌均匀后，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b2g，加热至回流，反应2h。，为减压浓缩除去溶剂乙腈；
(2)降温至0～10℃，投入二氯甲烷10-24ml，然后在0～10℃条件下，滴加乙醛0.2-0.8ml，搅拌0.5-2h，加硼氢化钾0.2-1g，反应0.2-1h，加硼酸缓冲液1-5ml，搅拌1-3h；
(3)加入10％氢氧化钠搅拌0.5-2h，，常压加热蒸馏至液温100℃，蒸出部分溶剂，在加入20％氢氧化钠溶液8-12ml，加热回流12-48h，降温至室温，真空抽滤得到滤液；
(4)滤液用无盐水稀释，通入层析分离柱中上样，用纯化水洗柱，20-60％乙醇洗脱有机相，浓缩，浓缩液加氨水混匀，通入层析分离柱中上样，收集有效成分，浓缩，浓缩液通过制备液相方法进行分离，收集有效成分，浓缩。
本发明所述的1-n-乙基小诺霉素的合成路线，如下所示：
步骤1
步骤2
上述合成路线中出现的化合物1-5的中文名称：
化合物1：3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b
化合物2：2′,4′,5″-三乙酯-3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b
化合物3：2′,4′,5″-三乙酯-3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基-3-亚乙基庆大霉素c2b
化合物4：2′,4′,5″-三乙酯-3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基-3-乙基庆大霉素c2b
化合物5：1-n-乙基小诺霉素
上述化合物1-5，1,5是已知化合物(化合物1在“一种高纯度的3,2″,6″-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b膜分离(cn103374047)”文献中有所报道，化合物5在“h.wang,zj.zhang,f.fei,isolationandstructurecharacterizationofrelatedimpuritiesinetimicinsulfatebylc/esi-msnandnmr,journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis[j].55(2011),902-907.”文献中有所报道)，2,3,4是未知化合物。
本发明的制备方法，相对于现有的工艺而言，具有以下有益效果：
目前并没有1-n-乙基小诺霉素相关合成工艺的报道，本发明作为唯一1-n-乙基小诺霉素的合成工艺，其合成路线简单，操作便利，用时短，成本低，对环境污染小，通过本发明的方法制备得到的1-n-乙基小诺霉素具有纯度高达到98％和收率高达到80％等特点，对于提高药品质量，提高临床用药的安全性具有重大的意义。
具体实施方案
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制
实施例1、1-n-乙基小诺霉素
a、在装有带干燥管的回流冷凝管的100ml干燥圆底烧瓶中，投入乙腈10ml，乙酸酐2.5ml，浓硫酸0.04ml，搅拌均匀后，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b2.0g，加热至回流，反应2h。改为蒸馏装置常压加热蒸出溶剂乙二醇二甲醚。
b、降温至0～10℃，投入二氯甲烷9ml，然后在0～10℃条件下，滴加乙醛0.2ml，搅拌1h。加硼氢化钾0.5g，反应0.5h，加硼酸缓冲液3ml(1.0g硼酸加去离子水3.0ml搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph＝10)，搅拌1.5h。
c、加入10％氢氧化钠搅拌0.5h，，常压加热蒸馏至液温100℃，蒸出部分溶剂。加入20％氢氧化钠溶液2ml，加热回流24h，降温至室温，真空抽虑得滤液。
d、滤液用无盐水稀释，通入层析分离柱大孔树脂柱中上样，用纯化水洗柱，40％乙醇洗脱有机相，浓缩。浓缩液通过制备液相根据中国药科大学开发的方法进行分离，收集有效成分，浓缩得到1-n-乙基小诺霉素，其纯度为98％，收率为80％。
实施例2、1-n-乙基小诺霉素
a、在装有带干燥管的回流冷凝管的100ml干燥圆底烧瓶中，投入乙腈10ml，乙酸酐2.5ml，浓硫酸0.02ml，搅拌均匀后，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b2.0g，加热至回流，反应2h。减压浓缩除去溶剂乙二醇二甲醚。
b、降温至0～10℃，投入二氯甲烷9ml，然后在0～10℃条件下，滴加乙醛0.2ml，搅拌1h。加硼氢化钾0.5g，反应0.5h，加硼酸缓冲液3ml(1.0g硼酸加去离子水3.0ml搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph＝10)，搅拌1.5h。
c、加入10％氢氧化钠搅拌0.5h，，常压加热蒸馏至液温100℃，蒸出部分溶剂。加入20％氢氧化钠溶液2ml，加热回流24h，降温至室温，真空抽虑得滤液。
d、滤液用无盐水稀释，通入层析分离柱中上样，用纯化水洗柱，40％乙醇洗脱有机相，浓缩。浓缩液通过制备液相根据药大方法进行分离，收集有效成分，浓缩得到1-n-乙基小诺霉素，其纯度为98％，收率为40％。
实施例3、高纯度标准品1-n-乙基小诺霉素的制备
a、在装有带干燥管的回流冷凝管的100ml干燥圆底烧瓶中，投入乙腈10ml，乙酸酐2.5ml，浓硫酸0.04ml，搅拌均匀后，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b2.0g，加热至回流，反应2h。改为蒸馏装置常压加热蒸出溶剂乙二醇二甲醚。
b、降温至0～10℃，投入二氯甲烷9ml，然后在0～10℃条件下，滴加乙醛0.2ml，搅拌1h。加硼氢化钾0.5g，反应0.5h，加硼酸缓冲液3ml(1.0g硼酸加去离子水3.0ml搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph＝10)，搅拌1.5h。
c、加入10％氢氧化钠搅拌0.5h，，常压加热蒸馏至液温100℃，蒸出部分溶剂。加入20％氢氧化钠溶液2ml，加热回流24h，降温至室温，真空抽虑得滤液。
d、滤液用无盐水稀释，通入层析分离柱大孔树脂柱中上样，用纯化水洗柱，40％乙醇洗脱有机相，浓缩。
取除盐浓缩液，用超纯水稀释浓度为10mg/ml，采取中国药科大学开发的方法进行制备液相分离，收集有效成分。
中国药科大学开发的方法：
色谱柱：gemininxc18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：a相：水-氨水-冰醋酸(96：3.6：0.4)，b相：甲醇，梯度洗脱(程序见tab.1)；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；elsd参数：漂移管温度：105℃；载气流速：2.6l/min；gain值：1。
tab.1流动相梯度
实施例4、1-n-乙基小诺霉素的应用实例，
硫酸依替米星原料药的合成：
a、在装有带干燥管的回流冷凝管的100ml干燥圆底烧瓶中，投入乙腈10ml，乙酸酐2.5ml，浓硫酸0.04ml，搅拌均匀后，加入3,2″,6″,-n,n,n-三乙酰基庆大霉素c2b2.0g，加热至回流，反应2h。改为蒸馏装置常压加热蒸出溶剂乙二醇二甲醚。
b、降温至0～10℃，投入二氯甲烷9ml，然后在0～10℃条件下，滴加乙醛0.2ml，搅拌1h。加硼氢化钾0.5g，反应0.5h，加硼酸缓冲液3ml(1.0g硼酸加去离子水3.0ml搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph＝10)，搅拌1.5h。
c、加入10％氢氧化钠搅拌0.5h，，常压加热蒸馏至液温100℃，蒸出部分溶剂。加入20％氢氧化钠溶液2ml，加热回流24h，降温至室温，真空抽虑得滤液。
d、滤液用无盐水稀释，通入层析分离柱大孔树脂柱中上样，用纯化水洗柱，40％乙醇洗脱有机相，浓缩。浓缩液通过制备液相根据中国药科大学开发的方法进行分离，收集有效成分，浓缩得到1-n-乙基小诺霉素，其纯度为98％，收率为80％。
硫酸依替米星原料药的检测方法：
供试品溶液的配制：
取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含依替米星0.25mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
标准品溶液的配制：
分别取依替米星对照品和本品标准品各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.025mg的混合溶液
检测：
将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算依替米星原料药中杂质1-n-乙基小诺霉素的残留量。
举例如下：称取1-n-乙基小诺霉素6.56mg，稀释至25ml，取定量的硫酸依替米星原料药稀释至25ml。根据以上数据及峰面积可以计算出硫酸依替米星原料药中杂质1-n-乙基小诺霉素的残留量。
色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，以0.2mol/l三氟乙酸(含0.05％五氟丙酸，1.5g/l无水硫酸钠，0.8％(v/v)的50％氢氧化钠溶液，用50％氢氧化钠调节ph值至3.5)-乙腈(96:4)为流动相，柱温为35℃，流速为每分钟1.0ml，用积分脉冲安培电化学检测器检测，检测电极为金电极(推荐使用3mm直径)，参比电极为ag/agcl复合电极，钛合金对电极，四波形检测电位，柱后加碱(50％氢氧化钠溶液1→25，推荐流速每分钟0.5ml)。