微流控芯片及外泌体提取方法与流程

本发明涉及微流控技术领域，特别是涉及一种微流控芯片及外泌体提取方法。

背景技术：

外泌体是直径为30nm-150nm的纳米级细胞外囊泡，它可以由体内或者体外培养的细胞分泌，并同时存在于尿液、血清、血浆、乳汁等人体体液中。近年来，外泌体被认为是重要的新兴临床诊疗的生物标志物，可以揭示细胞的生理信息，为临床诊断提供新方法。

现有的外泌体分离方法包括超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、商品化试剂盒沉淀法、聚合物沉淀法和免疫亲和法。然而，这些传统的外泌体提取方法都存在着一些问题，比如操作过程繁琐、提取纯度低和提取设备昂贵等。其中超速离心法对设备要求高，实验消耗的样品量较大，同时实验操作时间很长，纯度较低；沉淀法容易被其他共沉淀的物质污染，影响后期实验分析；免疫亲和法不能批量分离外泌体。

因此，针对上述技术问题，有必要提供一种微流控芯片及外泌体提取方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微流控芯片及外泌体提取方法。

为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：

一种微流控芯片，所述微流控芯片包括基底及位于基底上的微流通道层，所述微流通道层设有样本入口、样本出口、及连通于样本入口和样本出口之间的若干混合通道及磁腔室，所述磁腔室内设有磁盘。

作为本发明的进一步改进，所述样本入口包括第一样本入口、第二样本入口及第三样本入口，第一样本入口、第二样本入口及第三样本入口分别与混合通道及磁腔室相连通。

作为本发明的进一步改进，所述微流通道层包括依次设置的第一混合通道、第一磁腔室、第二混合通道、第二磁腔室、第三混合通道、第三磁腔室，所述第一混合通道与样本入口相连通，第三磁腔室与样本出口相连通，第一混合通道、第二混合通道及第三混合通道为s形嵌入式障碍混合通道。

作为本发明的进一步改进，所述基底为玻璃基底，微流通道层为pdms微流通道层。

本发明另一实施例提供的技术方案如下：

一种基于微流控芯片的外泌体提取方法，所述方法包括：

s1、在样本入口中通入血清和免疫磁珠悬浮液，在混合通道内混合反应得到捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于磁腔室内的磁盘上；

s2、在样本入口中通入缓冲液，冲洗混合通道内的杂质，而后在混合通道内通过缓冲液清洗捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于磁腔室内的磁盘上；

s3、在样本入口中通入洗脱液，在混合通道内混合反应，通过洗脱液分离免疫磁珠与外泌体，分离后的免疫磁珠富集于磁腔室内的磁盘上，于样本出口中提取纯化后的外泌体。

作为本发明的进一步改进，所述方法具体为：

s1、在第一样本入口和第二样本入口中分别通入血清和免疫磁珠悬浮液，在第一混合通道内混合反应得到捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于第一磁腔室内的磁盘上；

s2、在第三样本入口中通入缓冲液，冲洗混合通道内的杂质，而后释放第一磁腔室内的磁盘，在第二混合通道内通过缓冲液清洗捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于第二磁腔室内的磁盘上；

s3、在第三样本入口中通入洗脱液，释放第二磁腔室内的磁盘，在第三混合通道内混合反应，通过洗脱液分离免疫磁珠与外泌体，分离后的免疫磁珠富集于第三磁腔室内的磁盘上，于样本出口中提取纯化后的外泌体。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s1中，血清和免疫磁珠悬浮液的通入流速为4～6μl/min，通入时间为20～40min。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s2中，“冲洗混合通道内的杂质”过程中缓冲液的通入流速为5～15μl/min，通入时间为5～15min；“清洗捕获到外泌体的免疫磁珠”过程中缓冲液的通入流速为5～15μl/min，通入时间为5～15min。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s3中，洗脱液的通入流速为1～10μl/min，通入时间为5～15min。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s2中的缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。

本发明的有益效果是：

本发明能够连续、自动化、高效地提纯外泌体，样本剂量需求少、芯片体积小，携带方便；

微流控芯片提取外泌体的自动化程度高、分离时间短、效率高，提取过程中对外泌体造成的物理损害大大减少。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一具体实施例的微流控芯片中微流通道层的结构示意图；

图2为本发明一具体实施例中外泌体提取方法的流程示意图；

图3为本发明中免疫磁珠特异性捕获外泌体的原理图；

图4为本发明一具体实施例中微流控芯片提取的外泌体的电镜图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种微流控芯片，包括基底及位于基底上的微流通道层，微流通道层设有样本入口、样本出口、及连通于样本入口和样本出口之间的若干混合通道及磁腔室，磁腔室内设有磁盘。

本发明还公开了一种基于微流控芯片的外泌体提取方法，包括：

s1、在样本入口中通入血清和免疫磁珠悬浮液，在混合通道内混合反应得到捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于磁腔室内的磁盘上；

s2、在样本入口中通入缓冲液，冲洗混合通道内的杂质，而后在混合通道内通过缓冲液清洗捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于磁腔室内的磁盘上；

s3、在样本入口中通入洗脱液，在混合通道内混合反应，通过洗脱液分离免疫磁珠与外泌体，分离后的免疫磁珠富集于磁腔室内的磁盘上，于样本出口中提取纯化后的外泌体。

以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明中的外泌体是直径为30nm-150nm的纳米级细胞外囊泡，具有蛋白质和核酸内容的细胞分泌的脂质双层膜。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为“exosome”。

微粒控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。

免疫磁珠是一种粒径均匀的较小球体，通过微球与免疫配基结合制得。免疫磁珠的核心是一种性质稳定的超顺磁性材料，通常为金属小颗粒(fe3o4，fe2o3)，核心的外层包裹着高分子材料(如聚苯乙烯，聚氯乙烯)，最外层是免疫配基(如抗体、抗原、酶、dna等物质)。

参图1所示，本发明一具体实施例中的微流控芯片包括玻璃基底及位于玻璃基底上的聚二甲基硅氧烷(pdms)微流通道层，微流通道层设有样本入口、样本出口20、及连通于样本入口和样本出口之间的若干混合通道及磁腔室。

具体地，样本入口包括第一样本入口11、第二样本入口12及第三样本入口13，三个入口用于通入不同的样本，且三个样本入口分别与混合通道及磁腔室相连通。

微流通道层包括依次设置的第一混合通道31、第一磁腔室41、第二混合通道32、第二磁腔室42、第三混合通道33、第三磁腔室43，第一混合通道31与三个样本入口相连通，第三磁腔室43与样本出口20相连通。

本实施例中第一混合通道31、第二混合通道32及第三混合通道33均为s形嵌入式障碍混合通道，磁腔室内放置有直径4mm的磁盘。

相应地，本发明一具体实施例中的外泌体提取方法基于上述微流控芯片实现，第一样本入口11和第三样本入口13连接有第一微流泵，第一微流泵微流泵上有两个1ml的注射器，分别装有血清和免疫磁珠悬浮液。第二样本入口连接第二微流泵，第二微流泵上也有两个1ml的注射器，分别装有pbs缓冲液和外泌体洗脱液。

参图2所示，具体的外泌体提取方法包括：

s1、在第一样本入口11和第二样本入口12中分别通入血清和免疫磁珠悬浮液，在第一混合通道31内混合反应得到捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于第一磁腔室41内的磁盘上。

步骤s1中包括免疫磁珠捕获外泌体及对捕获到外泌体的免疫磁珠进行富集两个步骤。

具体地，将磁盘分别放置在第一磁腔室41、第二磁腔室42和第三磁腔室43中，第一样本入口11和第二样本入口12同时通入血清和免疫磁珠悬浮液，设置第一微流泵流速为5μl/min，持续时间为30分钟。血清与免疫磁珠在第一混合通道31中充分混合反应，免疫磁珠在此过程中特异性捕获外泌体，捕获原理参图3所示。第一微流泵工作30分钟后，停止流体流入。

当捕获到外泌体的免疫磁珠流经第一磁腔室41时被磁盘吸附。为了防止有极少量捕获到外泌体的免疫磁珠丢失，在第二磁腔室42和第三磁腔室43也放置磁铁，以提高外泌体的收集效率。

s2、在第三样本入口13中通入缓冲液，冲洗混合通道内的杂质，而后释放第一磁腔室41内的磁盘，在第二混合通道32内通过缓冲液清洗捕获到外泌体的免疫磁珠，并富集于第二磁腔室42内的磁盘上。

步骤s2主要用于冲洗通道内其他杂质和清洗捕获到外泌体的免疫磁珠。

具体地，捕获到外泌体的免疫磁珠成功的被富集于第一磁腔室41中，然而此时微通道内还有血清等其他物质。将第三样本入口12连接第二微流泵上的1ml装有pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)的注射器，设置第二微流泵流速为10ul/min，持续时间为10分钟；随后释放第一磁腔室41中的磁盘，在第二混合通道32中免疫磁珠与pbs缓冲液充分混合。

免疫磁珠流经第二磁腔室42时被磁盘吸附，完成杂质冲洗后，停止第二微流泵。

s3、在第三样本入口13中通入洗脱液，释放第二磁腔室42内的磁盘，在第三混合通道33内混合反应，通过洗脱液分离免疫磁珠与外泌体，分离后的免疫磁珠富集于第三磁腔室43内的磁盘上，于样本出口20中提取纯化后的外泌体。

步骤s3包括分离免疫磁珠与外泌体以及收集外泌体两个步骤。

具体地，将第三样本入口12连接第二微流泵上的1ml装有外泌体洗脱液的注射器。设置第二微流泵流速为5ul/min，持续时间为10分钟。捕获到外泌体的免疫磁珠与外泌体洗脱液在第三混合通道33中充分混合反应，从而实现免疫磁珠与外泌体的分离。

免疫磁珠与外泌体在第三混合通道内完成分离后流经第三磁腔室43，免疫磁珠在磁力的作用下富集于第三磁腔室43中，只有纯化的外泌体从样本出口20流出，完成外泌体分离、纯化收集。

其中，上述实施例中的三个混合通道设计为s形嵌入式障碍结构，且分别根据免疫磁珠对外泌体的捕获过程、免疫磁珠冲洗过程、免疫磁珠与外泌体分离过程设计三级混合通道。吸附过程中，磁腔室中放置磁盘对免疫磁珠进行吸附处理，磁铁的释放通过镊子取出即可。

本实施例中的微流控芯片可以进行进样，最小进样量为100ul，该装置体积小，便于携带。

参图4所示，为微流控芯片提取的外泌体的电镜图，可见，外泌体有典型的纳米级细胞外囊泡结构，直径在30nm-150nm范围内。

应当理解的是，上述实施例中各样本的通入流速和通入时间可以根据需要进行设置：

步骤s1中，血清和免疫磁珠悬浮液的通入流速为4～6μl/min，通入时间为20～40min；

步骤s2中，“冲洗混合通道内的杂质”过程中缓冲液的通入流速为5～15μl/min，通入时间为5～15min；“清洗捕获到外泌体的免疫磁珠”过程中缓冲液的通入流速为5～15μl/min，通入时间为5～15min；

步骤s3中，洗脱液的通入流速为1～10μl/min，通入时间为5～15min。

其他通入流速和通入时间的实施例此处不再一一举例进行说明。

由以上技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：

微流控芯片能够实现外泌体的提取，且芯片体积小，便于携带；

本发明能够连续、自动化、高效地提纯外泌体，样本剂量需求少、芯片体积小，携带方便；

微流控芯片提取外泌体的自动化程度高、分离时间短、效率高，提取过程中对外泌体造成的物理损害大大减少。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。