一种具有调节B淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽及其制备方法与流程

本发明属于营养品技术领域，具体涉及一种具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽及其制备方法。

背景技术：

b淋巴细胞是人体免疫系统的重要调节因子，它的功能包括刺激反应，抗原呈递，分泌炎症因子和抗体，既可以通过细胞免疫，也可以通过体液免疫的方式进行免疫反应，帮助机体抵抗病原物质的入侵。不仅如此，b免疫细胞还有助于帮助机体组织创伤后修复，包括骨裂，皮肤创伤修复等。此外，b淋巴细胞还能显著地促进神经组织在疤痕组织下面和内部的增长，使这些修复的机体具有正常的生理功能。在老人，孩童，病人等特殊人群中，由于机体免疫功能的下降，因此通过膳食补充调节b淋巴细胞的活性对保持健康起着重要作用。

酪蛋白是乳制品中蛋白的主要成分，在牛乳中占总蛋白质的80—85％，在羊奶中酪蛋白含量稍低，为74—80％。酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，人体在食用乳清蛋白后，效用启动的较快，可以在健身运动前后食用，富含支链氨基酸，它可以在运动期间使蛋白在肌肉中穿梭，或是让它立即成效，当然因为消化的较快，所以在身体里也不会保持太久。另一方面，由于酪蛋白的溶解性显著低于乳清蛋白，食用酪蛋白可能造成消化不良反应。使用微生物或者生物酶在体外水解酪蛋白，增加其可溶性和易消化性是一种增加其营养价值的方法。

目前采用的水解酪蛋白的方法主要是通过胰蛋白酶水解法，碱性蛋白酶水解法或酸性蛋白酶水解法，得到牛乳酪蛋白水解产物，通常这些作为蛋白质/氨基酸补充剂进行营养产品开发。但是由于水解方法过于单一，得到的牛乳水解产物成份太复杂，因此造成产物调节b淋巴细胞免疫活性功能价值不高，有的甚至有副作用。羊乳作为一种成份明显不同于牛乳的酪蛋白，尚无对羊乳酪蛋白水解产品开发的应用，也无相应的功能产品可供选择，因此通过选择高质量的羊乳酪蛋白，优化酶水解方法，得到纯化的高效调节b淋巴细胞活性的小分子肽具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有羊乳水解酪蛋白水解物调节b淋巴细胞免疫功能产品的空白，研究羊乳酪蛋白的水解方法和水解条件，提供了一种具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽及其制备方法。本发明还应用这一具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽于营养品中，增强营养补充品的功能，增强服用者的机体免疫能力。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽，其特征在于，所述羊乳酪蛋白水解肽的序列如seqidno.1所示：谷氨酰胺-苏氨酸-脯氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(即，qtpvvvpp)。

上述具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽的制备方法包括如下步骤：

(1)羊乳酪蛋白的选取：将选取的羊乳酪蛋白溶解于去离子水中，得到羊乳酪蛋白浓度为8—12g/l，优选为9—10g/l，更优选为10g/l的羊乳酪蛋白溶液；所述羊乳酪蛋白中α1酪蛋白的质量百分比含量≤15，α2酪蛋白的质量百分比含量为15—20％，β酪蛋白的质量百分比含量为43—51％，k酪蛋白的质量百分比含量为17—23％；

(2)二阶段酶水解羊乳酪蛋白：用氯化氢浓度为0.3—0.5m，优选为0.4m的氯化氢溶液调节步骤(1)所得羊乳酪蛋白溶液的ph值为3.8—4.3；然后向羊乳酪蛋白溶液中加入a蛋白酶混合物后于37℃恒温箱中反应2—4h，优选为2.5h，反应结束后使用氢氧化钠浓度为0.15—0.25m，优选为0.2m的氢氧化钠溶液调节羊乳酪蛋白溶液的ph值为8.0—8.5；再向羊乳酪蛋白溶液中加入b蛋白酶混合物后于37℃恒温箱中反应2—4h，优选为2.5h，得到羊乳酪蛋白水解肽混合物；其中，所述a蛋白酶混合物中胃蛋白酶的浓度为0.05—0.1g/l，三肽水解酶tpp的浓度为0.01—0.05g/l，所述b蛋白酶混合物中胰蛋白酶的浓度为0.1g/l，双肽水解酶dpp的浓度为0.01—0.05g/l，胞质氨基肽水解酶lap3的浓度为0.01—0.05g/l，钙蛋白酶capn3的浓度为0.01—0.05g/l；

(3)分离纯化：分离纯化步骤(2)所得的羊乳酪蛋白水解肽混合物，得到具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽。

优选地，步骤(3)所述分离纯化步骤(2)所得的羊乳酪蛋白水解肽的具体步骤包括：a)超滤：使用截留分子量为2kda的超滤离心管对步骤(2)所得到的羊乳酪蛋白水解肽混合物进行分离，得到分子量小于1000da的多肽混合物；b)凝胶色谱法分离：采用分子排阻层析sec肽分离柱进行分离，分子排阻层析(size—exclusionchromatography)sec肽分离柱中的洗脱相a为ph值7.0—8.5的浓度为20mm的tris-盐酸，流速为1.0—1.5ml/min，洗脱梯度为30—60min内从0％到100％；洗脱峰收集时间为15—25min，优选为17—23min，更优选为6—10min。

优选地，所述方法在步骤(3)之后还包括针对具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽的纯度分析步骤。更优选地，所述对具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽的纯度分析步骤为：使用反相c18高效液相色谱柱进行羊乳酪蛋白水解肽纯度分析，所述反相c18高效液相色谱柱中的流动相a为浓度0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相b为浓度0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液，检测波长为214nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；柱温：30℃，洗脱梯度为：

优选地，所述方法在纯度分析步骤之后还包括对具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽氨基酸序列测定的步骤。更优选地，所述具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽氨基酸序列测定的步骤为：将具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽上样到超高分辨率的质谱进行分析，测定其氨基酸序列。

下面对本发明作进一步说明：

b淋巴细胞属于免疫细胞，能够分泌免疫球蛋白，执行机体的体液免疫功能，清楚体内的病原物质，对机体免疫系统功能的发挥有重要作用。本发明选取高质量、高稳定性的羊乳酪蛋白，通过不同的生物酶混合物，在两阶段不同的酶反应条件下对羊乳酪蛋白进行水解反应，分离纯化得到高纯度的具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽，与现有的羊乳酪蛋白产品相比，不仅更加容易消化，而且具有明显的增强免疫功能，能够显著的增强b淋巴细胞活性(增强免疫球蛋白表达)，在保健食品和功能性营养品中具有良好的应用前景。

附图说明(图中所述的肽段a即为本发明所述具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽)

图1是采用本发明方法经过二阶段酶水解羊乳酪蛋白后，超滤前、超滤后和sec肽分离后的蛋白质电泳结果图；

图2是本实施例产物经过sec肽分离柱后hplc液相色谱图；

图3是羊乳酪蛋白肽对rpmi1788淋巴细胞活性的促进作用检测结果图。

具体实施方式

实施例1

所述具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽的制备方法包括如下步骤：

(1)羊乳酪蛋白的选取：将采得的羊奶在4℃下4000g条件下离心30min，去除乳脂层，得蛋白溶液；5mol/l氯化氢调节蛋白溶液ph值到4.6，在4℃下冷冻离心，保留沉淀；用去离子水洗涤沉淀2次，将沉淀溶解于去离子水中，所述沉淀即是选取的羊乳酪蛋白，得到羊乳酪蛋白浓度为8—12g/l，优选为9—10g/l，更优选为10g/l的羊乳酪蛋白溶液；所述羊乳酪蛋白中α1酪蛋白的质量百分比含量≤15，α2酪蛋白的质量百分比含量为15—20％，β酪蛋白的质量百分比含量为43—51％，k酪蛋白的质量百分比含量为17—23％；

(2)二阶段酶水解羊乳酪蛋白：用氯化氢浓度为0.4m的氯化氢溶液调节步骤(1)所得羊乳酪蛋白溶液的ph值为3.9；然后向羊乳酪蛋白溶液中加入a蛋白酶混合物后于37℃恒温箱中反应2.5h，反应结束后使用氢氧化钠浓度为0.2m的氢氧化钠溶液调节羊乳酪蛋白溶液的ph值为8.2；再向羊乳酪蛋白溶液中加入b蛋白酶混合物后于37℃恒温箱中反应2.5h，酶水解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，得到羊乳酪蛋白水解肽混合物；其中，所述a蛋白酶混合物中胃蛋白酶的浓度为0.05—0.1g/l，三肽水解酶tpp的浓度为0.01—0.05g/l，所述b蛋白酶混合物中胰蛋白酶的浓度为0.1g/l，双肽水解酶dpp的浓度为0.01—0.05g/l，胞质氨基肽水解酶lap3的浓度为0.01—0.05g/l，钙蛋白酶capn3的浓度为0.01—0.05g/l；

(3)分离纯化：分离纯化步骤(2)所得的羊乳酪蛋白水解肽混合物，得到具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽。

其中，步骤(3)所述分离纯化步骤(2)所得的羊乳酪蛋白水解肽的具体步骤包括：a)超滤：使用截留分子量为2kda的超滤离心管(赛多利斯系列)对步骤(2)所得到的羊乳酪蛋白水解肽混合物进行分离(4℃，12000rpm条件下超滤离心15min)，得到分子量小于1000da的多肽混合物；b)凝胶色谱法分离：采用分子排阻层析sec肽分离柱进行分离，分子排阻层析(size—exclusionchromatography)sec肽分离柱中的洗脱相a为ph值8.0的浓度为20mm的tris-盐酸，流速为1.0ml/min，洗脱梯度为50min内从0％到100％；洗脱峰收集时间为6—10min。

所述方法在步骤(3)之后还包括针对具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽的纯度分析步骤。具体步骤为：使用反相c18高效液相色谱柱进行羊乳酪蛋白水解肽纯度分析，所述反相c18高效液相色谱柱中的流动相a为浓度0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相b为浓度0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液，检测波长为214nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；柱温：30℃，洗脱梯度为：

所述方法在纯度分析步骤之后还包括对具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽氨基酸序列测定的步骤。具体步骤为：将具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽上样到超高分辨率的质谱进行分析，测定其氨基酸序列，序列结果为：谷氨酰胺-苏氨酸-脯氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(即，qtpvvvpp)。

实施例2

关于实施例1制备的具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽(以下简称“羊乳酪蛋白水解肽”)性能的分析结果：

由图1可知，经过浓度为18％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，超滤前的羊乳酪蛋白水解肽混合物分子量主要分布在1.7—4.6kd之间，而使用2000da分子截留量的超滤管处理后，所得到的羊乳酪蛋白水解肽混合物分子量大小小于1.7kda。经过进一步使用sec肽分离柱对超滤对羊乳酪蛋白水解肽混合物进行分离得到纯化小分子肽，预估分子量小于1000da。

由图2可知，sec肽柱分离后的进行高效液相色谱分析，所得到的羊乳酪蛋白水解肽在洗脱18min时出现主峰，清晰，且其它杂峰少，说明经过超滤和sec分离后得到的羊乳酪蛋白水解肽纯度很高，经过计算羊乳酪蛋白水解肽纯度达95％以上。

对羊乳酪蛋白水解肽对b淋巴细胞rpmi1788免疫功能的作用进行了分析，如图3所示，在rpmi1788细胞培养基中分别添加5μg/ml羊乳酪蛋白水解肽后，rpmi1788细胞在不同时间点的免疫球蛋白iga，igm，igg和免疫因子tnf—α表达量显著增加。证明经过本发明的二阶段复合酶水解法得到的羊乳酪蛋白水解肽具有显著的增强b淋巴细胞免疫功能。

实施例3

关于实施例1制备的具有调节b淋巴细胞活性的羊乳酪蛋白水解肽(以下简称“羊乳酪蛋白水解肽”)的应用：

羊乳酪蛋白水解肽配方高蛋白饮品：

(1)原料准备：羊乳酪蛋白，羊乳酪蛋白水解肽，羊乳清蛋白浓缩物，低聚果糖，橙子粉，柠檬粉，天然香料，海盐，蜂蜜，维生素c，每100ml其组分按重量计为：羊乳酪蛋白1.4g，羊乳酪蛋白水解肽0.2g，羊乳清蛋白浓缩物0.9g，低聚果糖0.8g，橙子粉0.6g，柠檬粉0.2g，天然香料0.05g，海盐0.1g，蜂蜜0.5g，维生素c0.1g；

(2)混料：将步骤(1)准备的低聚果糖，橙子粉，柠檬粉，天然香料，海盐，维生素c进行混料，；

(3)向步骤(2)的预混料中加入羊乳酪蛋白，羊乳酪蛋白水解肽，羊乳清蛋白浓缩物，得到混料；

(4)纯净水加热至30—50℃，将步骤(3)的混料和蜂蜜加入进去，搅拌使得其充分溶解，在高压均质机内进行均质，均质压力为12—18mpa；

(5)过滤：将步骤四的溶液进行除菌过滤，即得羊乳酪蛋白水解肽配方高蛋白饮品。

序列表

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