本发明属于医药
技术领域：
：，具体涉及丹参中一种小分子活性成分mirna，命名为sal-mir-58，在制备用于抑制血管炎性反应和动脉瘤形成的药物中的用途。
背景技术：
：：腹主动脉瘤(aaa)是一种致命性的血管疾病。随着我国人口老龄化进程的加速，腹主动脉瘤的发病率不断上升。既往研究结果表明，吸烟、高血压、动脉粥样硬化等多种因素是导致aaa形成的重要因素。aaa发病机制虽然复杂，但内外环境因素引发的血管炎症反应和氧化应激是aaa形成的核心因素。目前，腹主动脉瘤(aaa)主要靠手术治疗，包括血管腔内修补术和开放式手术治疗。血管腔内修补术存在内漏等相关并发症，长期疗效尚待观察，由于受解剖条件限制不能应用于所有病人；开放式手术治疗的手术创伤大，术后恢复过程较漫长，并发症多。同时，开放手术不适于合并心、肺、肾等严重合并症的高危患者。然而，目前尚无有效的药物治疗手段可以避免手术创伤而适用于广泛的病人，这已成为国内外医学界广泛的重视和急需解决的问题。因此，临床迫切需要获得一种新型、高效、低毒、安全、价廉的用于治疗aaa的药物。技术实现要素：为克服现有技术之缺陷，本发明提供能够有效抑制血管炎性反应和抑制动脉瘤形成的药物。丹参是唇形科植物丹参的干燥根部和根茎，具有清心除燥、通经止痛、活血化瘀、凉血消痛的功效，在亚洲国家被广泛用于治疗冠心病、心肌梗死、心绞痛和动脉粥样硬化(as)，是重要的心脑血管保护药物。丹参具有降低血液粘稠度、抑制动脉粥样硬化斑块形成、抑炎、抗氧化、促进血管新生、改善内皮细胞功能等作用。其中，抑炎是丹参发挥心血管保护作用的重要机制之一。近年研究表明，丹参酮i、丹参酮iia、丹参酮iib、二氢丹参酮、隐丹参酮等亲油性成分以及丹参素、丹参酚酸a、b、原儿茶醛等亲水成分均可中介炎症因子而发挥抗炎作用，但其是如何作用于炎症因子，作用于哪些炎症因子的研究并不详尽。2012年南京大学张辰宇教授关于植物mirna168a可以在肝脏中跨物种调节小鼠ldlrap1蛋白表达的发现，揭开了mirna在生物界跨物种调节的研究热点。越来越多的证据提示，植物源性的mirna可以跨物种调控基因表达。本发明经对丹参提取成分进行二代高通量测序，筛选并鉴定了特异性存在于丹参中的一种mirna，命名为sal-mir-58。将丹参的有效成分单一化并合成、体外实验抗炎机制的研究、动物模型的建立等，发现丹参来源的sal-mir-58在抑制动脉瘤形成中发挥抑制血管炎性反应的作用。因此，本发明解决现有技术问题的技术方案如下所述。本发明提供一种mirna，命名为sal-mir-58，具有如下序列，aaggggauguagcucauc。本发明提供上述mirna在制备用于治疗动脉瘤血管炎性药物中的用途。所述动脉瘤为腹主动脉瘤。本发明还提供所述mirna的制备方法，含有如下步骤：1、植物总rna的提取1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨，保证无块状组织，取100mg粉末置于2ml无菌离心管中，添加500μlbufferrcl/β-巯基乙醇，(样品解冻之前加入β-巯基乙醇)，快速混匀。2)55℃水浴1-3min，室温，14,000g离心5min。3)吸取上清液(大概可获得450μl)，加入至含有2ml收集管的gdnafiltercolum中，室温14,000g离心2min。4)加入等倍体积的bufferrcb于收集管中，并上下颠倒混匀5-10次。5)将从(4)中得到的全部混合液包括沉淀置于hibindrnaminicolum，加入一个新的2ml收集管，室温10,000离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中。6)加入400μlrwcwashbuffer置于柱子中，室温10,000g离心1min除去流动相，柱子放回收集管中。此时，可选择用dnaaseⅰ处理。7)把柱子放在一个新的2ml收集管中，加入500μlrnawashbufferⅱ，室温10,000g离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中。8)重复(7)，把柱子放回收集管中，10,000g离心2min，离心干燥。9)将离心柱置于新的1.5ml离心管中，在离心柱中加入30-50μldepc水，室温静置2min后，全速(≥13,000g)离心1min，将流出液收集，-80℃保存。2、丹参rna建库测序流程从rna样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，对样品检测、建库、测序每一个步骤都严格把控，确保高质量数据的产出。流程图如附图1。2.1totalrna样品检测对rna样品的检测主要包括4种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染；(2)nanodrop检测rna的纯度(od260/280比值)；(3)qubit对rna浓度进行精确定量；(4)agilent2100精确检测rna的完整性。2.2文库构建样品检测合格后，使用smallrnasampleprekit构建文库，利用smallrna的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团，3’端有羟基)，以totalrna为起始样品，直接将smallrna两端加上接头，然后反转录合成cdna。随后经过pcr扩增，page胶电泳分离目标dna片段，切胶回收得到的即为cdna文库。构建原理图如图2。2.3库检文库构建完成后，先使用qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nm)，以保证文库质量。2.4上机测序库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行hiseq/miseq测序获取丹参中存在的植物源性的mirna。3、植物mirna的提取1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨，保证无块状组织，取50-100mg粉末置于2ml无菌离心管中，添加700μllysismixture，最高速度涡旋30s，充分混匀样品。2)55℃水浴3min，室温，12,000g离心5min。3)吸取上清液，加入至含有2ml收集管的gdnaremovelcolum中，室温12,000g离心2min。4)将收集管液体转移至新的2ml离心管中，加入1.1倍体积的无水乙醇涡旋20s，充分混匀。12,000g离心1min，弃掉流动相。5)将从(4)中得到的700μl混合液置于microeluternaminicolum，加入一个新的2ml收集管，室温12,000离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中。6)重复(5)直至所有液体均被转移。7)加入500μl无水乙醇至microeluternaminicolum，室温12,000g离心1min，除去流动相。8)加入500μlxdbindingbuffer到microeluternaminicolum，室温12,000g离心1min，除去流动相。9)加入750μlrnawashbufferⅱ，室温10,000g离心1min，除去流动相，并把柱子放回收集管中。重复一次。10)最大转速离心(≥12,000g)2min，离心干燥11)将离心柱置于新的1.5ml离心管中，在离心柱中加入30-50μldepc水，室温静置5min后，全速(≥12,000g)离心1min，将流出液收集，-80℃保存。4、高碘酸钠消化处理rna(1)将提取的rna取5μl加入95μl10mmnaio3在0℃避光孵育40min；(2)加入1ml无水乙醇及1μl糖原在冰上静置20min；(3)12,000g，15min，4℃离心后弃上清；(4)加入1ml无水乙醇12,000g，15min，4℃离心弃上清；(5)加入1ml75％乙醇12,000g，15min，4℃离心弃上清；(6)室温静置5min，用ddh2o溶解后进行定量。5、mirna的逆转录5.1连接反应体系：将上述反应体系在pcr仪中按照如下条件进行反转录反应：5.2反转录反应体系：4μl连接产物加入反转录体系中(加入前在室温平衡2min)6、mirna的半定量检测pcr反应体系：20μl的cdna加入200μlrnase-freeh2osal-mir-58primer:cgaaggggatgtagctcatc，7、mirna的测序将扩增的pcr产物进行测序确定为sal-mir-58的序列一致。sal-mir-58序列信息：aaggggauguagcucauc。本发明还提供含有上述mirna的组合物，所述组合物含有上述mirna和药学上可接受的辅料。上述组合物选自片剂、胶囊剂或注射剂。本发明结合对腹主动脉瘤历经十几年的实验研究，经对丹参进行二代高通量测序、将丹参的有效成分单一化并合成、体外实验抗炎机制的研究、动物模型的建立等，发现丹参来源的sal-mir-58在抑制动脉瘤形成中发挥抑制血管炎性反应的作用。这种发现突破了现有技术的教导与启示，是本领域技术人员不经过创造性劳动就得不出来的，具有突出的实质性特点和显著的进步。为了进一步研究丹参来源的sal-mir-58在抑制动脉瘤形成中发挥抑制血管炎性反应的作用机制。本发明采用了分子生物学、组织病理学、组织生物化学、组织电镜学的方法，研制出具有抗炎作用的sal-mir-58，为临床治疗aaa提供一种高效、低毒的新型药物奠定基础，为研发中药治疗aaa提供体内药效学及作用机制及理论实验依据，为科技成果转化创造条件。本发明提供的具有抗炎作用的sal-mir-58，为临床治疗aaa提供一种高效、低毒的新型药物奠定基础，为研发中药治疗aaa提供体内药效学及作用机制及理论实验依据，为科技成果转化创造条件。附图说明图1丹参rna建库测序流程图图2文库构建原理图图3sal-mir-58抑制aaa的形成图4sal-mir-58减轻aaa组织炎性反应图5sal-mir-58抑制angⅱ诱导的炎性因子表达具体实施方式为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，下面结合实施例，对本发明的技术方案进一步阐述。需要说明的是，以下描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本领域普通技术人员基于本发明实施例，在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1体内实验：(一)实验分组：挑选10-12周龄的雄性apoe-/-小鼠进行称重，选取体重在25.0g左右的小鼠40只入组，适应性喂养一周后，随机分为4组，即：①pbs空白对照组(apoe-/-组)、②腹主动脉瘤组(apoe-/-+angⅱ组)、③空白对照药物组(apoe-/-+sal-mir-58)、④腹主动脉瘤模型药物组(apoe-/-+angⅱ+sal-mir-58)每组10只。(二)造模方法：(参考《mitchellps,parkinrk,krohem,etal.circulatingmicrornasasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[j].proc.natl.acad.sci.u.s.a,2008,105(30):10513-10518.》)①和③组小鼠不需造模。②和④组aaa小鼠的造模方法如下：1、计算用药量挑选10-12周龄的雄性apoe-/-小鼠进行称重，选取体重在25.0g左右的小鼠入组，按照说明书上面1,000ng/kg/min的释放量计算angⅱ的浓度，按照200μl/泵(2004型)计算angⅱ溶液的用量，配制好angⅱ溶液缓释泵用。用1ml无菌空针在超净工作台内将高压灭菌的pbs或者配置好的angⅱ溶液注射至渗透压缓释泵(alzet公司micro-osmoticpump,model2004)中。将安装好的渗透压胶囊缓释泵置入装有生理盐水的15ml离心管中，使得生理盐水没过渗透压泵。2、手术植入渗透压胶囊缓释泵(1)提前准备好青霉素干粉一瓶、消毒棉签一包，手术器械并进行高温高压灭菌消毒；(2)选取10-12周龄的入组雄性apoe-/-小鼠，用3％的异氟烷进行吸入性诱导麻醉，1.5％的异氟烷进行持续麻醉；(3)待其完全麻醉后，将小鼠固定于无菌玻璃板上，腹部向下，四肢伸直，用脱毛膏涂抹背部去毛，使用碘伏进行局部消毒，并放置于手术显微镜下；(4)用高压灭菌的剪刀沿肩胛骨后缘斜行切开皮肤及皮下组织，切口6-8mm，用钝性分离钳游离出皮下腔隙，大小约为5mm×1cm，用镊子夹持渗透压胶囊缓释泵塞入空腔中，为了避免渗透压胶囊缓释泵脱出，尽量塞入较深部位，胶囊渗透压泵置入周期为28天。兙俥(5)用5号线缝合内膜，撒上青霉素粉末，再缝合皮肤外膜。(6)术后将小鼠置于无菌热垫上苏醒后置入无菌动物房，小鼠进行高脂饲料喂养，观察4周；(7)因为建模是腹主动脉瘤模型，在此过程中小鼠可能会由于动脉瘤发生破裂而导致死亡，因此每天进入动物方定期观察小鼠的生活状态。(三)给药：药物治疗组④用sal-mir-58采用腹腔注射的方式。在aaa动物模型②基础上，apoe-/-+angⅱ+sal-mir-58组④，使用sal-mir-58agomir(50mg/kg)注射3次/周，持续4周。用生理盐水配制合适浓度的药物，给药剂量控制在500μl。①apoe-/-组以及②apoe-/-+angⅱ组小鼠腹腔注射500μl生理盐水作为对照。注射3次/周，持续4周。腹主动脉瘤模型药物组在手术前5天开始于每天固定时间给药，1次/天；pbs空白对照组和空白对照药物组在手术前5天开始于每天固定时间给pbs，1次/天。28天后，麻醉处死各组小鼠，进行取材，快速留取小鼠主动脉用以后续实验。(四)取材及形态学检测小鼠主动脉超声检测动脉内径兙俥(1)取出建模28天的小鼠，用脱毛膏去除小鼠胸腹部皮毛，用棉签蘸生理盐水进一步擦拭干净；(2)用3％的异氟烷进行吸入性诱导麻醉，1.5％的异氟烷进行持续麻醉；(3)用b超专用耦合剂涂抹小鼠胸部和腹部，用探头在距肾动脉分叉上0.5cm位置观察腹主动脉，检测并对小鼠腹主动脉内径进行测量，进行详细的数据记录。兙俥俥(五)小鼠血清的留取兙(1)取出建模28天的小鼠，用左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定小鼠的尾巴；兙(2)用右手轻压需要摘取的眼部皮肤，使小鼠眼球充血突出；(3)使用无菌手术剪剪去小鼠的胡须，防止血从胡须处留下引起溶血；(4)用镊子夹取眼球并快速摘取，并使血液从眼眶内流入无菌ep管中；当血液滴入速度变慢时可轻按小鼠心脏部位，加快心脏泵血速度以获取更多的血液，获取完全后迅速置于冰上，4℃，3,000rpm，离心15min；(5)离心后取上清，放入-80℃冰箱冷冻，备用。兙俥(六)血管组织取材(1)术后28天，取完眼球血的小鼠，剪开左心耳，动脉血管系统立即用预冷的pbs(ph7.4)通过左心心尖充分灌注血管，灌注冲洗约3-5min，尽量将血管内血液冲洗干净；(2)将小鼠放置在显微镜下，用无菌组织剪剪开小鼠的胸骨，然后剪去小鼠胸腺，不要剪破保持主动脉三分叉和主动脉弓的完整，小心分离主动脉弓、主动脉三分叉、胸主动脉，沿脊柱向下将主动脉解剖干净，一直分离到双侧髂总动脉分叉处；(3)取下的标本于光下拍照。(七)实验结果：1、sal-mir-58agomir对aaa小鼠组织病理学、分子生物学及治疗效果。图3a是我们对给予sal-mir-58治疗的小鼠进行了主动脉超声检测腹主动脉的内径的b超图片，检测结果提示与apoe-/-对照组相比，apoe-/-+angⅱ模型组中肾动脉上方腹主动脉内径显著扩张,而sal-mir-58治疗组中小鼠腹主动脉内径扩张明显低于apoe-/-+angⅱ模型组组。图3b是对四组小鼠腹主动脉内径进行测量统计的结果图，结果显示apoe-/-+angⅱ模型组中肾动脉上方腹主动脉内径显著扩张(2.383±4.721mmvs.1.042±3.103mm，p<0.001),而sal-mir-58治疗组中小鼠腹主动脉内径扩张明显低于apoe-/-+angⅱ模型组组(1.832±5.176mmvs.2.383±4.721mm，p<0.001)。图3c是对小鼠进行解剖后，光学显微镜下观察小鼠腹主动脉形态学上的变化图片，结果显示对小鼠进行解剖后，与apoe-/-对照组相比，apoe-/-+angⅱ模型组中肾动脉上方腹主动脉可见显著膨出形成的动脉瘤,而sal-mir-58治疗组中小鼠腹主动脉膨出形成的动脉瘤明显小于apoe-/-+angⅱ模型组组。图3d是对腹主动脉瘤膨出率的统计结果，结果显示在apoe-/-+angⅱ模型组中小鼠肾上腹主动脉局部膨胀率显著高于apoe-/-对照组(69.924±2.143％vs.12.480±1.423％，p<0.001)，而sal-mir-58治疗组小鼠肾上腹主动脉仅有轻微的扩张，膨胀率显著低于apoe-/-+angⅱ模型组(25.620±1.789％vs.69.924±2.143％，p<0.001)。sal-mir-58治疗aaa组织炎性指标的效果，结果见图4。图4a是我们使用免疫印迹方法检测了腹主动脉瘤组织中炎性因子的表达结果，结果显示，apoe-/-+angⅱ模型组小鼠的腹主动脉瘤组织中炎性因子nf-κbp65、nf-κbp50、tnf-α、il-1β、il-6的表达水平显著高于apoe-/-对照组；给予sal-mir-58治疗后，小鼠腹主动脉瘤组织中nf-κbp65、nf-κbp50、tnf-α、il-1β、il-6的表达水平显著低于apoe-/-+angⅱ模型组。图4b是我们进一步收集了aaa模型小鼠血清用elisa方法检测了各组小鼠血清组织中炎性因子il-1β的含量，elisa实验结果显示apoe-/-+angⅱ模型组小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子il-1β的含量显著高于正常对照组；给予sal-mir-58治疗后小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子il-1β的含量显著低于apoe-/-+angⅱ模型组。图4c是我们进一步收集了aaa模型小鼠血清用elisa方法检测了各组小鼠血清组织中炎性因子il-6的含量，elisa实验结果显示apoe-/-+angⅱ模型组小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子il-6的含量显著高于正常对照组；给予sal-mir-58治疗后小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子il-6的含量显著低于apoe-/-+angⅱ模型组。图4d是我们进一步收集了aaa模型小鼠血清用elisa方法检测了各组小鼠血清组织中炎性因子tnf-α的含量，elisa实验结果显示apoe-/-+angⅱ模型组小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子tnf-α的含量显著高于正常对照组；给予sal-mir-58治疗后小鼠的腹主动脉瘤血清中炎性因子tnf-α的含量显著低于apoe-/-+angⅱ模型组。由图3-4数据可知，sal-mir-58能进入小鼠体内并抑制angⅱ诱导的aaa的形成，并且sal-mir-58可以减轻aaa血管炎性反应。此结果确实超出预期。实施例2、体外实验：在体外培养小鼠vsmcs，用sal-mir-58转染vsmcs，qrt-pcr和westernblotting，免疫荧光检测炎性因子il-6、tnf-α和il-1β的mrna和蛋白明表达水平的变化情况，明确sal-mir-58可以抑制腹主动脉瘤炎性反应的分子机制。sal-mir-58对小鼠血管平滑肌细胞分子生物学及干预效果见图5。图5a是我们采用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术检测在血管平滑肌细胞转染sal-mir-58后对angⅱ诱导的炎性因子的表达情况结果。结果显示，用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子il-6、tnf-α和il-1β的mrna较对照组显著增加，用sal-mir-58转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子的表达。图5b是我们采用免疫印迹技术检测在血管平滑肌细胞转染sal-mir-58后对angⅱ诱导的炎性因子的表达情况结果。结果显示，用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子nf-κbp65、nf-κbp50、tnf-α、il-1β、il-6的蛋白水平较对照组显著增加，用sal-mir-58转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子的表达。图5c是我们采用免疫荧光技术检测在血管平滑肌细胞转染sal-mir-58后对angⅱ诱导的炎性因子il-1β的表达情况结果，结果显示用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子il-1β荧光强度较对照组显著增加，用sal-mir-58mimic转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子il-1β的荧光强度。图5d是我们采用免疫荧光技术检测在血管平滑肌细胞转染sal-mir-58后对angⅱ诱导的炎性因子il-6的表达情况结果，结果显示用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子il-6荧光强度较对照组显著增加，用sal-mir-58转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子il-6的荧光强度。图5e是我们采用免疫荧光技术检测在血管平滑肌细胞转染sal-mir-58后对angⅱ诱导的炎性因子tnf-α的表达情况结果，结果显示用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子tnf-α荧光强度较对照组显著增加，用sal-mir-58转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子tnf-α的荧光强度。由图3数据可知，用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子il-6、tnf-α和il-1β的mrna和蛋白表达较对照组显著增加，用sal-mir-58mimic转染vsmcs显著抑制angⅱ诱导的炎性因子的表达。同时免疫荧光染色也显示，用angⅱ(10-7m)处理vsmcs24h后，炎性因子il-1β、il-6和tnf-α的荧光强度明显增强，而sal-mir-58mimic转染组il-1β、il-6和tnf-α的荧光强度减弱，低于angⅱ处理组。随后，我们用elisa方法检测了sal-mir-58mimic转染后vsmcs培养基中il-1β、il-6和tnf-α的浓度。结果显示，angⅱ处理的vsmcs比对照组vsmcs的培养基中il-1β、il-6和tnf-α明显升高至少2.5倍，而转染sal-mir-58mimic转染后vsmcs培养基中il-1β、il-6和tnf-α的浓度较angⅱ处理的vsmcs显著降低，说明sal-mir-58抑制angⅱ诱导的炎性因子表达。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>河北医科大学<120>sal-mir-58及其在抑制血管炎性反应和动脉瘤形成中的用途<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna/rna<213>丹参(salviamiltiorrhizabge)<400>1aaggggauguagcucauc18当前第1页12当前第1页12