OTOF在呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用的制作方法

本发明属于分子诊断领域，涉及otof在呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)属副黏病毒科肺炎属，1956年morris从一只有感冒症状的实验动物黑猩猩的鼻咽分泌物中分离出第一株rsv。1957年chanock先后从baltimore市2例分别患肺炎和有喘息症状患儿的咽拭子中分离到。因其在组织培养中能形成特殊的细胞融合病变而得名。呼吸道合胞病毒是婴幼儿呼吸道感染最常见的病原体，特别是2～6个月小婴儿rsv感染后常发生严重毛细支气管炎和肺炎。通常在冬、春季节流行。在世界不同地区每年因rsv感染而需住院治疗的患儿为1‰～5‰，住院病人病死率为1‰～3‰。

至今已鉴定rsv有2个主要血清型和9个亚型，常常通过托儿机构、家庭和其他公共场所造成传播，亦是引起住院小儿医院内感染的常见原因。研究证明，病毒传播的方式主要是通过飞沫传播，污染的手指直接将病毒接种到鼻黏膜和眼黏膜也是引起感染的重要传播途径。rsv下呼吸道感染的发病机制包括病毒与宿主受累细胞损伤、炎症、体液和局部免疫反应及高反应性之间的相互作用。

感染的主要后果是导致呼吸道上皮细胞受损，免疫反应和营养状况在疾病恢复过程中起着至关重要的作用。体液免疫和呼吸系统的局部免疫反应，包括产生rsv特异性免疫球蛋白，主要系igg、呼吸道局部分泌的iga、ige。针对rsv糖蛋白f和g的全身性中和抗体与防止再感染能力有关。不过，这种保护性仅对大约75％的病人有效。有学者认为，获得性母体抗体igg并无保护作用，婴儿只有通过感染才能获得少量的呼吸道局部siga。在siga尚未出现之前，干扰素能抑制rsv的感染。但由于小婴儿血清中往往存在小量母体抗体，因此会影响到局部干扰素的产生，故rsv感染后形成的免疫机制中，呼吸道局部免疫是占主导地位的。感染在6个月以下婴儿较为严重，是因为免疫方面尚不成熟而造成的，也与呼吸道黏膜siga产生缓慢和不足有关。

确诊可分离病毒及做血清补体结合试验和中和试验、免疫荧光技术检查鼻咽分泌物中病毒抗原，免疫荧光快速诊断技术(if)和碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法均为近年来我国广泛采用的rsv快速检测方法。其中if由于敏感性及特异性较高，已被who推荐为快速诊断rsv的首选方法。采用直接呼吸道分泌物，最好是鼻咽部抽吸物进行if快速诊断rsv抗原的方法比用血清学检查抗体(elisa法)稳定、可靠、阳性率高，适于基层医院推广使用。但是免疫荧光法进行抗原检测时对于低浓度感染样本的检测效果不理想[casiano-colon，a.e.，b.b.hulbert，etal.(2003).lackofsensitivityofrapidantigentestsforthediagnosisofrespiratorysyncytialvirusinfectioninadults.jclinvirol28(2)：169-74；rabagliati，r.，m.serri，etal.(2007).utilityofrealtimepolymerasechainreactioninthediagnosisofrespiratorysyncytialvirusinfectionamongadultpatients.revchilenainfectol24(6)：441-5]，需经病毒培养后再进行检测，且对于操作人员要求较高，存在非特异染色等问题。病毒培养又需要有活病毒存在才能实现，且操作繁琐。因此亟待开发一种检测灵敏度高、操作过程简单、结果精确的方法用于呼吸道合胞病毒感染的诊断。

技术实现要素：

本申请的发明人通过比对正常人和呼吸道合胞病毒感染患者血液中的基因表达谱，发现otof基因在感染呼吸道合胞病毒的人群血液中的表达显著上调，鉴于otof基因的表达差异，本申请获得如下结论：otof基因可用于区分正常人和呼吸道合胞病毒感染患者，即otof基因可以作为诊断呼吸道合胞病毒感染的分子标志物。

本发明的目的之一在于提供otof基因的新用途；

本发明的目的之二在于提供一种用于诊断呼吸道合胞病毒感染产品。

本发明的目的之三在于提供一种诊断呼吸道合胞病毒感染的方法。

具体地，

本发明提供了检测otof基因表达的试剂在制备诊断呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。

进一步，上面所提到的检测otof基因表达的试剂包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测otof基因表达水平以诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂。

进一步，通过rt-pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增otof基因的引物；通过实时定量pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增otof基因的引物；通过免疫检测诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：与otof蛋白特异性结合的抗体；通过原位杂交诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：与otof基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与otof蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与otof基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，通过实时定量pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增otof基因的引物的序列，其序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明还提供了一种诊断呼吸道合胞病毒感染的产品，所述产品包括检测样本中otof基因表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括能够结合otof基因的核酸或者能够结合otof蛋白的物质。所述核酸能够检测otof基因的表达水平；所述物质能够检测otof蛋白的表达水平。

更进一步，所述核酸包括扩增otof基因的引物，引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为qpcr实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

更进一步，所述物质包括针对otof蛋白的抗体。

进一步，所述诊断产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测otof基因转录水平的针对otof基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的otof蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括otof基因在内的多个基因(例如，与呼吸道合胞病毒感染相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括otof蛋白在内的多个蛋白质(例如与呼吸道合胞病毒感染相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与呼吸道合胞病毒感染的标志物同时检测，可大大提高呼吸道合胞病毒感染诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测otof基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括otof蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测otof基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对otof基因的引物和/或探针。根据otof基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测otof基因表达水平的引物和探针。

与otof基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测otof基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测otof基因的转录水平。

进一步，otof蛋白的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。otof蛋白的抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与otof蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对otof基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。

进一步，本发明提到的样本包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，所述样本是血液。

在本发明的上下文中，“otof基因”包括otof基因以及otof基因的任何功能等同物的多核苷酸。otof基因(chromosome2,nc_000002.12(26457203..26558698,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

在本发明的上下文中，otof基因表达产物包括otof蛋白以及otof蛋白的部分肽。所述otof蛋白的部分肽含有与呼吸道合胞病毒感染相关的功能域。

“otof蛋白”包括otof蛋白以及otof蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括otof蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与otof的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是otof蛋白的融合蛋白。对于与otof蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留otof蛋白的生物学活性即可。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒感染的诊断方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取待检测对象含有基因组dna的样本；

(2)检测样本中otof基因表达水平；

(3)将测得的otof基因表达水平与是否感染呼吸道合胞病毒关联起来。

(4)与正常对照相比，如果otof基因表达水平显著升高，则代表该检测对象感染了呼吸道合胞病毒。

在本发明的上下文中，“诊断呼吸道合胞病毒感染”既包括判断待试者是否已经感染了呼吸道合胞病毒、也包括判断待试者是否存在感染呼吸道合胞病毒的风险。

本发明的优势在于：首次发现otof基因与呼吸道合胞病毒感染判断存在相关性，即通过在分子水平上检测otof基因表达就可以判断待检测对象是否感染了呼吸道合胞病毒，分子检测灵敏、快速。另外，本申请采用待检测对象的外周血作为研究对象，因此本申请提供了一种无创诊断方法，极大简化检测步骤的同时最大限度的减轻病人痛苦。

附图说明

图1显示利用qpcr检测otof基因mrna表达水平的柱状图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1呼吸道合胞病毒感染患者与正常人相比差异表达基因筛选

1、研究对象

rsv感染患者4例，来自医院儿科住院部；正常对照人群4例，来自医院体检中心。

2、临床病例筛选标准

2.1rsv感染组纳入标准

(1)年龄：1月-1岁；

(2)既往史：无rsv感染和/或喘息发作；

(3)临床症状：咳嗽和/或喘息和/或呼吸急促；

(4)体格检查：呼吸频率加快/吸气三凹征/肺部听诊哮鸣音或湿啰音；

(5)辅助检查：咽拭子检测rsv抗原阳性；

(6)影像学检查：胸部x片提示支气管炎或支气管肺炎。

2.2对照组纳入标准

(1)年龄：1月-1岁；

(2)既往史：无rsv感染和/或喘息发作；

(3)体格检查：正常；

(4)辅助检查：咽拭子检测rsv阴性。

2.3排除标准

(1)年龄：>1岁；

(2)既往史：rsv感染和/或喘息发作；

(3)辅助检查：其他病毒感染(检测外周血病毒抗体)，如eb病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、衣原体、流感病毒等；

(4)支气管肺发育不良、哮喘、神经系统疾病、遗传性疾病、营养不良等其他可能导致严重并发症的疾病。

2、血液中总rna的提取

(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。

(2)加入trizol(10⁶-10⁷细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。

(3)加入氯仿(氯仿：trizol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。

(4)离心，12,000g15min，4℃。

(5)小心吸取上清液，转移到新ep管中,加入异丙醇(异丙醇：trizol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。

(6)离心，12,000g10min，4℃。

(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：trizol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。

(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即rna略微出现透明时)，加入60μldepc水溶解沉淀。

3、高通量转录组测序

(1)rna-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用tophatv1.3.1将清洁片段与ucsch.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，h.sapiensucschg19版的预先构建的索引从tophat主页下载，并作为参考基因组，利用tophat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。tophat根据外显子区域和gt-ag剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用tophat方法的系统默认参数。

(2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过cufflinksv1.0.3处理，cufflinksv1.0.3将rna-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。fpkm值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算fpkm估计值的置信区间。cufflinks使用的参考的gtf注释文件从ensembl数据库下载(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。

(3)差异表达基因的检测

将下载的ensemblgtf文件和通过tophat匹配的原始文件传输到cuffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

rna-seq结果显示，rsv感染患者和正常人之间存在的差异表达基因共有978个。

实施例2差异表达基因的大样本验证

根据rna-seq结果结合现有技术检索，本申请选择差异表达基因otof进行大样本验证。采用的验证方法为经典的qpcr，本领域技术人员应当知道，本申请采用qpcr只是作为一种验证手段，当然也可采取其他常规实验进行验证，但在申请文件中仅使用一种即可说明问题，因此本申请的检测方式不能仅仅局限于本申请使用的qpcr，同样的，检测otof基因表达的试剂也不能限定到本申请采用的一对特定引物。

1、研究对象：

筛选标准同实施例1，rsv感染组和正常对照组各30例。

2、血液中总rna的提取

步骤同实施例1。

3、逆转录合成cdna

各取总rna2μg，加入5μlt7启动子引物，加无核酸酶水至总的反应体积为11.5μl，65℃水浴10min，冰上放置5min，然后加8.5μlcdnamastermix(含5x第一链缓冲液4μl，0.1mol/ldtt2μl，10mol/ldntp混合物1μl，逆转录酶mmlv1μl，rna酶抑制剂0.5μl)，40℃水浴2h后，65℃15min灭活mmlv，冰上孵育5min。

4、实时定量pcr

4.1引物设计

otof基因：正向引物序列为5’-gtcatcatctggaacaca-3’(seqidno.1)，反向引物序列为5’-gatgtcactggacttctc-3’(seqidno.2)；gapdh基因：正向引物序列为5’-atgttccaatatgattcca-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-gatttccattgatgacaag-3’(seqidno.4)。

4.2反应体系和反应程序

反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm)1μl，反向引物(5μm)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；各项操作均于冰上进行。

扩增程序：95℃5min，(95℃5s，53℃60s)*43个循环。

以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，而后使用δδct法进行相对定量。

5、结果

与正常对照的平均水平相比，30例rsv感染患者中有28例患者血液中的otof基因mrna水平显著升高，2例患者血液中的otof基因mrna水平基本无变化。统计结果如图1所示，与正常对照相比，rsv感染患者血液中otof基因mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>河北医科大学第二医院

<120>otof在呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtcatcatctggaacaca18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gatgtcactggacttctc18

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgttccaatatgattcca19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gatttccattgatgacaag19