基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶、其制法及应用的制作方法

本发明属于组织工程材料制备技术领域，具体涉及一种三维培养干细胞用的基于降冰片烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

组织工程是治疗器官衰竭或损伤的有效途径。组织工程是一个新兴的多学科研究领域，它是应用工程学和生命科学的方法来制备人工组织或器官，旨在修复身体受损或磨损的组织和器官，恢复其功能。组织工程的三要素是：支持细胞生长的生物支架、细胞、诱导性调节细胞活动的生长因子。其中，生物支架是组织工程研究中的热点和难点。

生物支架要应用于组织工程必须满足以下要求：具有良好的生物相容性，能够替代受损组织并且能够替代原始组织起到相应的作用或能够刺激原始组织的再生等。水凝胶具有一定条件下能保持流动状态而在外部的物理或化学刺激下可形成一定形状和强度的体型材料的特性，通过注射方法将其植入体内，流动性生物材料很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，手术创伤性小且易操作，因此，水凝胶成为组织工程中的首选支架。

制备水凝胶的材料有天然的高分子材料和合成的高分子材料。天然的高分子材料有壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐、胶原等，合成的高分子材料有聚乙酸、聚己内酯等。但多数人工合成高分子材料生物相容性低，降解不彻底等，因此，可考虑采用生物相容性好的天然的高分子材料，但是天然的高分子材料难以进行化学修饰，这限制了它们的应用。因此，寻找合适的修饰天然高分子材料的方法，并利用它们制备水凝胶尤为重要。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶的制备及应用，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于胶原和透明质酸的聚合物，所述聚合物为式(4)所示结构的聚合物；

其中，n为大于或等于2的自然数，col为胶原。

优选的技术方案中，其中n的取值为115～370。

本发明的另一目的在于提供一种水凝胶组合物，包括聚合物基质和水，其特征在于，所述聚合物基质为前述的基于胶原和透明质酸的聚合物。

优选的技术方案中，所述水凝胶组合物具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为200～400μm。。

优选的技术方案中，所述水凝胶组合物的机械强度为1200pa～1500pa。

本发明的又一目的在于提供一种可快速固化水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)使3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪与透明质酸发生反应，获得式(1)所示的四嗪修饰的透明质酸，

其中，n为大于或等于2的自然数；

2)使胶原与丁二酸酐发生酰胺化反应，获得式(2)所示的丁二酸酐修饰的胶原，

其中，col为胶原；

3)使5-降冰片烯-2-甲胺与丁二酸酐修饰的胶原反应，获得式(3)所示的降冰片烯修饰的胶原；

其中，col为胶原；

4)将四嗪修饰的透明质酸与步骤3)中降冰片烯修饰的胶原均匀混合，发生生物正交反应，获得可快速固化水凝胶。

优选的技术方案中，步骤1)具体包括将包含透明质酸、3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪、缩合剂和第一溶剂混合形成第一混合体系发生酰胺化反应获得式(1)所示四嗪修饰的透明质酸的步骤；其中，反应温度控制在15～30℃，反应时间控制在10～20h。

优选的，所述缩合剂包括苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和n,n-二异丙基乙胺。

优选的，所述透明质酸与3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪的摩尔比为6～10:1。

优选的，所述缩合剂与透明质酸的摩尔比为0.1～0.5:1。

优选的，所述第一溶剂包括二甲亚砜。

优选的技术方案中，步骤1)中还包括在酰胺化反应后对反应产物进行后处理的步骤，所述后处理中透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。

优选的，所述后处理步骤包括：在所述酰胺化反应结束后，将所获反应混合物透析1～3天，再通过葡聚糖凝胶柱提纯，之后冷冻干燥，获得四嗪修饰的透明质酸。

优选的技术方案中，步骤2)中所述胶原与丁二酸酐的质量比为1:10～20。

优选的，所述方法步骤1)中还以碱性物质调节所述反应体系的ph值至8～10的步骤。

优选的，所述碱性物质包括氢氧化钠。

优选的，所述反应体系中丁二酸酐以丁二酸酐的丙酮溶液的形式导入，所述丙酮与酰胺化反应体系的体积比为2:3。

优选的，所述反应体系中胶原以胶原溶于醋酸溶液导入，醋酸溶液的浓度为1～2w/v％；步骤1)中酰胺化反应的反应温度控制在0～8℃，反应时间控制在10～20h。

优选的技术方案中，步骤2)中还包括在酰胺化反应后对反应产物进行透析、冷冻干燥的步骤，所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。

优选的，所述透析步骤包括：将步骤2)酰胺化后的反应产物在去离子水中透析1～3天。

优选的技术方案中，步骤3)具体包括将丁二酸酐修饰的胶原和缩合剂混合形成第三混合体系发生反应，然后加入5-降冰片烯-2-甲胺混合均匀形成第四混合体系发生酰胺化反应获得式(3)降冰片烯修饰的胶原；其中第三混合体系反应的反应温度控制在0～8℃，反应时间控制在10～30min；第四混合体系的酰胺化反应的反应温度控制在15～30℃，反应时间控制在10～20h。

优选的，所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。

优选的，所述缩合剂与丁二酸酐修饰的胶原上的羧基的摩尔比为2～4:1。

优选的，所述丁二酸酐修饰的胶原上的羧基与降冰片烯的摩尔比为1:1～3。

优选的技术方案中，所述方法步骤3)还包括在第四混合体系发生酰胺化反应后对产物进行透析的步骤，所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。

优选的技术方案中，步骤4)中反应的介质为磷酸盐缓冲溶液。

本发明的又一目的在于提供一种前述的水凝胶组合物于组织工程领域中的用途。

优选的技术方案中，所述的用途包括以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行细胞培养的步骤。

优选的技术方案中，所述的用途包括以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖。

优选的技术方案中，以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养时，干细胞于所述水凝胶组合物上的接种量为100～1000万个/ml。

本发明聚合物的制备方法采用光固化的方式进行，水凝胶组合物也可以采用类似如图1的工艺路线获得：

如图1，水凝胶的制备方法中先将3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪与透明质酸混合，获得四嗪修饰的透明质酸；与之并列的，可以将丁二酸酐修饰到胶原上，再将5-降冰片烯-2-甲胺与丁二酸酐修饰的胶原反应，获得降冰片烯修饰的胶原；最后将所述四嗪修饰的透明质酸与降冰片烯修饰的胶原于磷酸盐缓冲溶液中混合反应，获得基于胶原和透明质酸的可快速固化的水凝胶。

这样获得的可快速固化的水凝胶，包括聚合物基质和水，所述聚合物基质由结构如式(4)所示的聚合物形成：

其中，n的取值为115～370，col为胶原。

该水凝胶可以应用于组织工程领域中的细胞培养领域。应用时，以所述水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。具体的，可以以所述水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：

1)胶原具有低免疫原性，细胞相容性和可生物降解性，结构中的rgd序列有助于细胞的粘附和增殖等。基于上述特点，它被广泛应用于组织工程，经常作为合成组织工程支架材料的前体生物材料之一。但胶原的水溶性较差，只溶解于酸性溶液；并且它结构中既有氨基又有羧基，难以进行化学修饰，因而限制了其生物应用。本发明通过将降冰片烯修饰到胶原上，既改善了胶原的水溶性，又可利用其与四嗪之间的生物正交反应构建水凝胶。

2)降冰片烯与四嗪间的反应速率极快，但是3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪不溶于水，从而限制了其在生物医学中的应用，本发明提供的基于降冰片烯与四嗪间逆diels-alder反应成型的可快速固化水凝胶的制备方法，通过将3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪修饰到透明质酸后，制备可水溶的且修饰有四嗪的透明质酸，从而实现了快速固化水凝胶的形成；

3)本发明提供了一种基于四嗪与降冰片烯之间的生物正交反应制备水凝胶三维支架的方法，并实现与细胞共混凝胶化，此反应具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的增殖与分化；同时制备方法简单，可大量制备；

4)本发明所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并将其应用于干细胞的增殖研究。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本发明一典型实施例中所获基于胶原和透明质酸可快速固化水凝胶的制备机理示意图；

图2是本发明一典型实施例中所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶的微观结构图；

图3是本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶水凝胶流变图；

图4是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶中生长共聚焦图；

图5是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶中的增殖图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了一种可快速固化的固化水凝胶，包括聚合物基质和水，所述聚合物基质由结构如式(4)所示的聚合物形成：

其中，n的取值为115～370，col为胶原。

在一些实施例中，所述制备方法包括：将透明质酸、3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪、缩合剂和第一溶剂混合形成第一混合体系发生酰胺化反应获得四嗪修饰的透明质酸的步骤；其中，反应温度控制在15～30℃，反应时间控制在10～20h。

优选的，所述缩合剂包括苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和n,n-二异丙基乙胺；优选的，所述透明质酸与3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪的摩尔比为6～10:1；优选的，所述缩合剂与透明质酸的摩尔比为0.1～0.5:1；优选的，所述第一溶剂包括二甲亚砜。

进一步地，所述制备方法还包括：在酰胺化反应后对反应产物进行后处理的步骤，所述后处理中透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。

优选的，所述后处理步骤包括：在所述酰胺化反应结束后，将所获反应混合物透析1～3天，再通过葡聚糖凝胶柱提纯，之后冷冻干燥，获得四嗪修饰的透明质酸。

在一些实施例中，所述制备方法包括：将胶原溶于浓度为1～2w/v％的醋酸溶液，之后加入第二溶剂溶解的丁二酸酐，并混合均匀，获得第二混合体系，之后使所述第二混合体系于0～8℃反应10～20h，获得双键修饰的胶原；优选的，所述胶原与丁二酸酐的质量比为1:10～20。

进一步地，所述第二溶剂包括丙酮。

进一步地，所述第二溶剂与第二混合体系的体积比为2:3。

进一步地，所述制备方法还包括：以碱性物质调节所述第一混合体系的ph值至8～10。

进一步地，所述碱性物质包括氢氧化钠。

进一步地，所述制备方法还包括：在酰胺化反应后对反应产物进行透析、冷冻干燥的步骤，所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。优选的，所述透析步骤包括：将酰胺化后的反应产物在去离子水中透析1～3天。

在一些实施例中，所述制备方法包括：将丁二酸酐修饰的胶原和缩合剂混合形成第三混合体系在0～8℃下反应10～30min；然后加入5-降冰片烯-2-甲胺混合均匀形成第四混合体系在15～30℃下反应10～20h，获得降冰片烯修饰的胶原。

进一步地，所述缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和n,n-二羟基琥珀酰亚胺。

进一步地，所述缩合剂与丁二酸酐修饰的胶原上的羧基的摩尔比为2～4:1。

进一步地，所述丁二酸酐修饰的胶原上的羧基与降冰片烯的摩尔比为1:1～3。

进一步地，所述制备方法还包括：在第四混合体系发生酰胺化反应后对产物进行透析的步骤，所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500～14000da。

作为优选方案之一，所述可快速固化的水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为200～400μm。

进一步地，所述水凝胶组合物的机械强度为1200pa～1500pa。

藉由上述技术方案，本发明的基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶将生物来源的透明质酸和胶原分别进行四嗪与降冰片烯化修饰，之后复合并与细胞共混，将胶原和透明质酸相结合，提高细胞的粘附作用、细胞的存活率，促进细胞的增殖，所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖。

实施例1

步骤一：将透明质酸钠(mw＝36kda)水溶液用强酸性离子交换树脂dowex50w×8-100酸化。随后，通过四丁基氢氧化铵(tba-oh)调节滤液ph至中性，然后冷冻干燥，得到的产物为ha-tba。将ha-tba和1,2,4,5-四嗪胺溶于无水二甲基亚砜中，随后加入pybop和diea，并反应过夜。

其中，ha-tba上的羧基，1,2,4,5-四嗪，pybop以及diea的反应摩尔比为8:1:1:1。

步骤一的反应结束后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析1天，接着通过g-15葡聚糖凝胶色谱柱纯化。最后冻干，得到四嗪修饰的透明质酸(ha-tz)。四嗪修饰的透明质酸结构式如式(1)所示：

其中，n的值为115。

步骤二：将col溶解在1％的醋酸溶液中，搅拌过夜使其溶解，随后，在冰浴条件下，通过4mnaoh调节溶液的ph为10，然后将已经用丙酮溶解的丁二酸酐(sah)缓慢滴加到反应液中，整个过程需维持ph在9，冰浴反应24h。

其中，col与酸酐反应的质量比为1:15。

步骤二反应结束后，将反应液置于截留分子量为14000da的透析袋中，在4℃去离子水中透析，最后冻干，可得到丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)，丁二酸酐修饰的胶原的结构式如(2)所示：

步骤三：将丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)溶解在水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰浴活化15min，随后加入5-降冰片烯-2-甲胺(nb-nh2)，并将反应液的ph调为8，过夜反应。

其中，col-sah上的羧基，nb-nh2，edc，nhs的反应摩尔比为1:1.5:4:4。

步骤三反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干，可得到降冰片烯修饰的胶原(col-nb)，降冰片烯修饰的胶原的结构式如式(3)所示。

步骤四：将上述四嗪修饰的透明质酸配成质量体积比为8wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的胶原配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的透明质酸与降冰片烯修饰的胶原的体积比为1:1。

步骤四反应结束后，获得所述水凝胶如式(4)所示：

其中，col为胶原。

对本实施例所获基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶进行表征，其中，四嗪修饰的透明质酸的表征数据为：δ：8.5,7.5(单峰,四嗪苯环上的氢),4.5,(单峰,ch2o),4.0-3.0(多重峰,透明质酸糖环上的质子),2(单峰,ch3)。降冰片烯修饰的胶原的表征数据为：δ：6.0-6.33(多重峰，降冰片烯上乙烯基质子的峰)。

实施例2

步骤一：将透明质酸钠(mw＝36kda)水溶液用强酸性离子交换树脂dowex50w×8-100酸化。随后，通过四丁基氢氧化铵(tba-oh)调节滤液ph至中性，然后冷冻干燥，得到的产物为ha-tba。将ha-tba和1，2，4，5-四嗪胺溶于无水二甲基亚砜中，随后加入pybop和diea，并反应过夜。

其中，ha-tba上的羧基，1,2,4,5-四嗪，pybop以及diea的反应摩尔比为6:1:1:1。

步骤一的反应结束后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析2天，接着通过g-15葡聚糖凝胶色谱柱纯化。最后冻干，得到四嗪修饰的透明质酸(ha-tz)。四嗪修饰的透明质酸结构式如式(1)所示：

其中，n的值为115。

步骤二：将col溶解在1％的醋酸溶液中，搅拌过夜使其溶解，随后，在4℃条件下，通过4mnaoh调节溶液的ph为10，然后将已经用丙酮溶解的丁二酸酐(sah)缓慢滴加到反应液中，整个过程需维持ph在9，4℃反应24h。

其中，col与酸酐反应的质量比为1:10。

步骤二反应结束后，将反应液置于截留分子量为14000da的透析袋中，在4℃去离子水中透析，最后冻干，可得到丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)，丁二酸酐修饰的胶原的结构式如(2)所示：

步骤三：将丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)溶解在水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰浴活化15min，随后加入5-降冰片烯-2-甲胺(nb-nh2)，并将反应液的ph调为8，过夜反应。

其中，col-sah上的羧基，nb-nh2，edc，nhs的反应摩尔比为1:1.5:2:2。

步骤三反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干，可得到降冰片烯修饰的胶原(col-nb)，降冰片烯修饰的胶原的结构式如式(3)所示。

步骤四：将上述四嗪修饰的透明质酸配成质量体积比为8wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的胶原配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的透明质酸与降冰片烯修饰的胶原的体积比为1:1。

步骤四反应结束后，获得所述水凝胶如式(4)所示：

其中，col为胶原。

实施例3

步骤一：将透明质酸钠(mw＝36kda)水溶液用强酸性离子交换树脂dowex50w×8-100酸化。随后，通过四丁基氢氧化铵(tba-oh)调节滤液ph至中性，然后冷冻干燥，得到的产物为ha-tba。将ha-tba和1，2，4，5-四嗪胺溶于无水二甲基亚砜中，随后加入pybop和diea，并反应过夜。

其中，ha-tba上的羧基，1,2,4,5-四嗪，pybop以及diea的反应摩尔比为8:1:1:1。

步骤一的反应结束后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，接着通过g-15葡聚糖凝胶色谱柱纯化。最后冻干，得到四嗪修饰的透明质酸(ha-tz)。四嗪修饰的透明质酸结构式如式(1)所示：

其中，n的值为115。

步骤二：将col溶解在1％的醋酸溶液中，搅拌过夜使其溶解，随后，在8℃条件下，通过4mnaoh调节溶液的ph为10，然后将已经用丙酮溶解的丁二酸酐(sah)缓慢滴加到反应液中，整个过程需维持ph在9，8℃反应24h。

其中，col与酸酐反应的质量比为1:20。

步骤二反应结束后，将反应液置于截留分子量为14000da的透析袋中，在4℃去离子水中透析，最后冻干，可得到丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)，丁二酸酐修饰的胶原的结构式如(2)所示：

步骤三：将丁二酸酐修饰的胶原(col-sah)溶解在水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰浴活化15min，随后加入5-降冰片烯-2-甲胺(nb-nh2)，并将反应液的ph调为8，过夜反应。

其中，col-sah上的羧基，nb-nh2，edc，nhs的反应摩尔比为1:1.5:3:3。

步骤三反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干，可得到降冰片烯修饰的胶原(col-nb)，降冰片烯修饰的胶原的结构式如式(3)所示。

步骤四：将上述四嗪修饰的透明质酸配成质量体积比为8wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的胶原配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的透明质酸与降冰片烯修饰的胶原的体积比为1:1。

步骤四反应结束后，获得所述水凝胶如式(4)所示：

其中，col为胶原。

本实施例所获水凝胶可作为三维培养细胞载体在组织工程中应用。下面通过测试例中项目性能测试展示本实施例所获水凝胶作为细胞三维培养载体的应用优势。

性能测试一

在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：

将上述实施例1所获水凝胶液氮冷冻后，固定到导电胶上，20ma喷金3min，通过扫描电镜观察水凝胶的孔径结构(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该col-ha水凝胶微观结构多孔，孔径约200～400μm。

性能测试二

将四嗪修饰的透明质酸配成质量体积比为8wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的胶原配成8wt％的pbs溶液，将二者按体积比为1:1混合30s便可成胶，将该水凝胶在流变仪测试仪上测试本实施例所获水凝胶的机械性能，通过流变结果图3可以看出，g’>g”且呈线性，说明已成凝胶状态。

性能测试三

实施例一所获水凝胶对干细胞增殖检测

用钙黄绿素染色法染色法和四唑盐比色法(wst法)来测定本实施例水凝胶中的人脐带间充质干细胞(ucmscs)的存活和增殖，其操作方法包括：

将10代ucmscs通过胰酶消化、计数，1000rpm离心3min，待用。将四嗪修饰的四臂聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸通过钴60射线灭菌后，分别用dmem/f12完全培养基溶解，然后将ucmscs与降冰片烯修饰的胶原溶液共混后，再与ha-tz溶液混合成胶。将水凝胶转移到24孔板中，并向每孔加入适量培养基，然后将孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养，每2-3天换一次液。

之后分别在培养的1d，5d和7d通过加入wst-1试剂孵育4小时，以检测该水凝胶中的ucmscs的增殖情况；培养1天和7天后将培养基取出，pbs清洗3次，利用live/dead试剂盒测定，在激光共聚焦488/561激发下观察细胞活性；活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光，死细胞被染色发出红色荧光。

如图4所示ucmscs在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖，表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。

培养1d,5d和7d后将培养基取出，每孔加入450μl新鲜培养基，加50μlwst-1充分混匀，放入5％co2、37℃培养箱中孵育4h，取100μl于96孔板中酶标仪450nm处测试od值。

如图5所示ucmsc与实施例一所获水凝胶共混后，培养1d细胞存活较好，培养第5d细胞呈现明显增殖，表明实施例一所获水凝胶毒性低、生物相容性好。

同样，本案发明人对实施例2和3所获基于降冰片烯与四嗪间逆diels-alder反应形成的水凝胶也同样进行了性能测试一至三，并且得到了与实施例1相近的测试结果。

对照例1

一般情况下，常规方法制备水凝胶的固化时间为数分钟，难以实现快速成型，无法实验细胞在其内的精确定位，限制了其在生物医学中的应用。

与对照例1相比，本发明实施例1所获水凝胶基于胶原和透明质酸间的生物正交反应成型，该反应速率极快，水凝胶可在30s内成型，较上述常规成型的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与细胞共混凝胶化，细胞在其内可精确定位。

对照例2

一般情况下，基于胶原制备水凝胶的条件(如：催化剂、引发剂等)对细胞具有一定的毒性，不利于细胞的生长与增殖。

与对照例2相比，本发明实施例1所获降冰片烯修饰的胶原，不仅提高了胶原的水溶性，也利用了生物正交反应构建水凝胶，生物正交反应是一类在活体细胞或组织中不干扰生物体自身性质下可以进行的化学反应，具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的生长，增殖与分化。

综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖。

此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的基于胶原和透明质酸的可快速固化水凝胶。

综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化；同时制备方法简单，可大量制备。

此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的光固化水凝胶。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。