电缆细菌CandidatusElectronema的检测引物、试剂盒及定量方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种电缆细菌candidatuselectronema的检测引物、试剂盒及定量方法。

背景技术：

电缆细菌(cablebacteria)，是一种来源于desulfobulbaceae家族的多细胞长线状细菌，通过厘米尺度的长距离电子传递(longdistanceelectrontransfer，ldet)产生电流来耦合沉积物空间隔离的深层无氧区域的硫化物氧化反应和表层有氧区域的氧气还原反应，这挑战了人们长期认同由分子扩散来控制的氧化还原分带的观点。此外，电缆细菌在全球分布非常广泛，包括海洋、红树林、盐沼地、淡水等多种多样沉积物环境，电缆细菌对全球生物地球化学元素循环起着显著推动作用。当ldet活跃的时候，电缆细菌可以促进硫铁复合物的溶解，引起沉积物中溶解态的硫、铁和钙的移动和重新分配，耦合沉积物及其底层水的铁-磷和铁-锰等元素的动态循环，在沉积物表面形成致密的羟基氧化铁或者氧化铁阻止沉积物中有毒硫化氢向水中扩散，从而保护水体生命。电缆细菌的发现是目前电微生物学非常令人兴奋的现象，引起了越来越多的国内外研究学者的研究和关注。

然而，电缆细菌到目前为止仍没有获得纯培养，传统的荧光原位杂交技术(fish)最低检测极限为每立方厘米1.5*10⁶的电缆细菌细胞，灵敏度和重复性都很低。荧光定量pcr方法以其特异性强、灵敏度高、定量准确、重复性好、速度快等优点成为了环境中定量检测低丰度物种的首选分子生物学方法。

因此，建立荧光定量pcr方法定量检测环境中电缆细菌丰度成为了当前研究的技术难点之一。

技术实现要素：

又鉴于此，本发明的目的在于针对现有对环境中电缆细菌直接定量的技术灵敏度和准确度的不足，提供了一种电缆细菌candidatuselectronema的检测引物、试剂盒及定量方法，快速定量检测环境中电缆细菌，提高检测结果的灵敏度。

本发明的第一个目的是提供一种电缆细菌candidatuselectronema的检测引物，所述的检测引物如下所示：

上游引物f：5’-catcgagtacatccgcgaac-3’(如seqidno.1所示)；

下游引物r：5’-aaatcagcaatcagcgcgtc-3’(如seqidno.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种电缆细菌candidatuselectronema的检测试剂盒，包括tbgreenpremixextaqii、阳性标准品和检测引物，所述的阳性标准品为含有如seqidno.3所示序列的重组质粒dna序列，所述的检测引物为权利要求1所述的检测引物。

本发明的第三个目的是提供一种电缆细菌candidatuselectronema的检测方法，包括以下步骤：提取待测沉积物样品的基因组dna作为模板，加入所述的检测引物，与tbgreenpremixextaqii混合形成扩增反应体系，进行荧光定量pcr反应，反应结束后，根据扩增曲线判断待测沉积物样品中是否含有电缆细菌candidatuselectronema。

所述的根据扩增曲线判断待测沉积物样品中是否含有电缆细菌candidatuselectronema的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且ct值小于35，则说明待测沉积物样品中含有电缆细菌candidatuselectronema，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明待测沉积物样品中不含有电缆细菌candidatuselectronema。

所述的扩增反应体系优选为：每25μl包括以下组分：10μmol/l的所述的上游引物f和下游引物r各1μl、tbgreenpremixextaqii12.5μl、模板dna1μl和超纯水9.5μl；所述的荧光定量pcr反应，其反应条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，收集荧光信号强度，重复40个循环。

本发明的第四个目的是提供一种电缆细菌candidatuselectronema丰度的定量方法，包括以下步骤：

(1)将如seqidno.3所示的序列连接到质粒上，构建得到重组阳性质粒，将阳性质粒进行梯度稀释以用作不同起始质粒浓度的模板，分别加入所述的检测引物，与tbgreenpremixextaqii混合形成扩增反应体系，进行荧光定量pcr反应；

(2)反应结束后得到各起始质粒浓度模板对应的扩增循环数ct值，该ct值与起始质粒浓度的常用对数呈线性关系，据此得到电缆细菌candidatuselectronema的qpcr标准曲线；

(3)提取待测沉积物样品的基因组dna作为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述检测引物，与tbgreenpremixextaqii混合形成扩增反应体系，进行荧光定量pcr反应，反应结束后得到ct值，将其代入电缆细菌candidatuselectronema的qpcr标准曲线，计算得到待测沉积物样品中电缆细菌的丰度。

步骤(1)和(3)所述的扩增反应体系优选为：每25μl包括以下组分：10μmol/l的权利要求1所述的上游引物f和下游引物r各1μl、tbgreenpremixextaqii12.5μl、模板dna1μl和超纯水9.5μl；步骤(1)和(3)所述的荧光定量pcr反应，其反应条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，收集荧光信号强度，重复40个循环。

本发明的实验结果表明：利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够定量检测环境样本中电缆细菌candidatuselectronema丰度，最低检测限为10拷贝/μl，要比目前的fish定量的检测限和灵敏度提高10000倍以上。本发明的检测引物、检测试剂盒和方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、特异性强的特点，定量检测线性范围可达10¹-10⁸拷贝/μl。

附图说明：

图1为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测普通pcr引物特异性结果，条带大小为132bp，m为dl2000marker；

图2为荧光定量pcr溶解曲线分析图；

图3为荧光pcr扩增动力学曲线；其中，1为10⁸拷贝/μl，2为10⁷拷贝/μl，3为10⁶拷贝/μl，4为10⁵拷贝/μl，5为10⁴拷贝/μl，6为10³拷贝/μl，7为10²拷贝/μl，8为10¹拷贝/μl；

图4为荧光pcr标准曲线图；其中，1为10¹拷贝/μl，2为10²拷贝/μl，3为10³拷贝/μl，4为10⁴拷贝/μl，5为10⁵拷贝/μl，6为10⁶拷贝/μl，7为10⁷拷贝/μl，8为10⁸拷贝/μl，e＝95.0％为引物对扩增效率，r²值＝0.998为线性相关系数；

图5为荧光pcr样本检测结果；其中1和2为电缆细菌富集物阳性样品，3为desulfobulbaceae家族脱硫杆菌阴性对照，4为大肠杆菌阴性对照，5为空白水对照；

图6为电缆细菌富集物的电子扫描显微镜图片(sem)；

图7为16srrna基因序列分析环境样本中电缆细菌的丰度；

图8为荧光定量pcr检测环境样本中电缆细菌的丰度。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1、本发明的试剂盒和方法灵敏度高、准确性强、重复性好，可定量检测线性范围可达10¹-10⁸拷贝/μl。

2、特异性：采用ncbi基因数据库中电缆细菌candidatuselectronema的亚硫酸盐还原酶β亚基(dsrb)设计特异性引物，并经过系统验证，本试剂盒能够定量检测电缆细菌candidatuselectronema的丰度，对desulfobulbaceae家族其他菌株结果为阴性。

实施例1：

1)荧光定量pcr引物的设计

电缆细菌(cablebacteria)，是一种来源于desulfobulbaceae家族的多细胞长线状细菌，下载genbank数据库desulfobulbaceae家族所有亚硫酸盐还原酶β亚基的基因(dsrb)序列，以及本课题组所获得的一条电缆细菌candidatuselectronema的dsrb基因的序列，使用软件primer-blast设计电缆细菌candidatuselectronema的dsrb基因序列的特异性引物，预计所扩增的长度为132bp，设计得到的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物f：5’-catcgagtacatccgcgaac-3’(如seqidno.1所示)；

下游引物r：5’-aaatcagcaatcagcgcgtc-3’(如seqidno.2所示)。

2)pcr扩增方法的建立和pcr产物验证

采用常规的dna提取方法提取含有电缆细菌的环境样本沉积物的dna，以获得的dna为模板进行pcr反应，每25μl反应体系为：10μmol/l的上游引物f1μl，10μmol/l的下游引物r1μl，tbgreenpremixextaqii12.5μl，环境样本沉积物dna提取液(模板dna)1μl，超纯水9.5μl；pcr反应条件包括：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，重复35个循环；最后72℃延伸15s。反应结束后，将pcr扩增产物经过1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳时间30min。当琼脂糖凝胶电泳的条带单一，且条带大小符合预期时，将扩增产物送往生工测序公司测序，测序结果表明为电缆细菌candidatuselectronema的亚硫酸盐还原酶β亚基(dsrb)基因的部分序列，说明本发明的这一对引物对电缆细菌candidatuselectronema的dsrb基因特异性强，琼脂糖凝胶电泳结果见图1和pcr扩增产物序列如seqidno.3所示。

3)阳性质粒标准品制备

将上述pcr扩增产物使用北京全式金公司产品peasy-t1simplecloningkit进行连接，经过trans1-t1phageresistant化学感受态细胞转化，菌落pcr初步筛选正确的白色阳性克隆扩大培养，然后使用质粒小提试剂盒提取阳性质粒，命名为peasy-t1-dsrb，将获得的阳性质粒peasy-t1-dsrb再次送往生工测序公司测序确认，将确认含有阳性插入片段(其核苷酸序列如seqidno.3所示)的阳性质粒peasy-t1-dsrb经过稀释，使其质粒浓度为10¹⁰拷贝/μl。

实施例2：

荧光定量pcr反应标准曲线的建立

将实施例1制备的阳性质粒peasy-t1-dsrb稀释为10¹-10⁸拷贝/μl的八个梯度浓度，作为模板进行荧光定量pcr反应，其中1为10⁸拷贝/μl，2为10⁷拷贝/μl，3为10⁶拷贝/μl，4为10⁵拷贝/μl，5为10⁴拷贝/μl，6为10³拷贝/μl，7为10²拷贝/μl，8为10¹拷贝/μl，并制作溶解曲线和动力学曲线，溶解曲线结果见图2，动力学曲线见图3。将实施例1制备的阳性质粒peasy-t1-dsrb稀释为10¹-10⁸拷贝/μl的八个梯度浓度，作为模板进行荧光定量pcr反应，其中，1为10¹拷贝/μl，2为10²拷贝/μl，3为10³拷贝/μl，4为10⁴拷贝/μl，5为10⁵拷贝/μl，6为10⁶拷贝/μl，7为10⁷拷贝/μl，8为10⁸拷贝/μl，反应结束后得到各起始质粒浓度模板对应的扩增循环数ct值，并制作电缆细菌candidatuselectronema的qpcr标准曲线，结果见图4。

荧光定量pcr反应体系为：每25μl组分包括10μmol/l的上游引物f1μl，10μmol/l的下游引物r1μl，tbgreenpremixextaqii12.5μl，阳性质粒1μl，超纯水9.5μl。

荧光定量pcr反应条件包括：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，收集荧光信号强度，重复40个循环；最后72℃延伸15s。

qpcr标准曲线方程：

y＝-3.447x+39.101，e＝95.0％，r²＝0.998；x为起始质粒浓度的常用对数，y为ct值。

由标准曲线方程可知，不同质粒浓度梯度的常用对数与ct值呈线性相关，且r²为0.998，相关性良好，且引物的扩增效率高达95.0％。

由图2可知，各个质粒浓度梯度的溶解曲线呈现同一峰值，表示引物特异性强；由图4可知，指数增长期曲线平行，表示pcr的扩增效率相近，且不同稀释度之间的ct值相差均匀，ct值与质粒浓度的常用对数呈现良好的线性关系。

根据结果可得，本发明的试剂盒和方法灵敏度高、准确性强、重复性好，可定量检测线性范围可达10¹-10⁸拷贝/μl。

实施例3：

荧光定量pcr的特异性试验

荧光定量pcr方法检测电缆细菌富集物(已知含有电缆细菌candidatuselectronema)，desulfobulbaceae家族脱硫杆菌和大肠杆菌，其中，1和2为电缆细菌富集物阳性样品，3为desulfobulbaceae家族脱硫杆菌阴性对照，4为大肠杆菌阴性对照，5为空白水对照。结果如图5所示。测试样本电缆细菌富集物dna提取使用普通土壤dna试剂盒，脱硫杆菌和大肠杆菌的基因组提取采用常规基因组dna提取方法。图6为电缆细菌富集物的电子扫描显微镜图。

荧光定量pcr反应体系和反应条件参照实施例2。

根据图5可以得出，电缆细菌富集物有荧光信号，发生了扩增反应，而desulfobulbaceae家族脱硫杆菌和大肠杆菌未发生扩增，表明本申请的方法具有很好的特异性。

实施例4：

荧光定量pcr检测环境样本中电缆细菌的生长发育过程

电缆细菌介导的长距离电子传递(longdistanceelectrontransfer，ldet)产生电流来耦合沉积物空间隔离的深层无氧区域的硫化物氧化反应和表层有氧区域的氧气还原反应。在氧气存在的情况下，丝状电缆细菌会从沉积物表面开始垂直向下生长达到2-3厘米。

以珠江流域佛山市顺德区容桂工业区河流沉积物为研究对象，将沉积物过筛去除大型污染物之后混合均匀，分装到100ml的烧杯中，每个烧杯中装80ml左右的沉积物，将烧杯连同沉积物一起放入水缸中，水缸中加自来水漫过烧杯10厘米左右，利用沉水泵曝气使得水缸的水处于饱和氧状态，分别收集孵育时间为0天、1天、3天、6天和9天，这5个时间点烧杯中表层两厘米的沉积物，每个时间点采集三个平行共计15个样本，使用普通的土壤dna试剂盒提取样本的总dna。

1)16srrna基因序列分析

基于上述所得的15个环境样本dna，采用illuminahisep高通量测序技术，对这15个样本的dna进行16srrna基因序列v3和v4区测序。基于16srrna基因序列分析显示(图7)：电缆细菌candidatuselectronema的百分比相对丰度在从最初的0天为0％，到第1天和第3天整体变化不大，第6天candidatuselectronema的相对丰度达到0.1％，第9天的到达了0.35％。candidatuselectronema的生长发育从第6天开始呈现指数增长。

2)荧光定量pcr检测环境样本中电缆细菌的丰度

基于上述所得的15个环境样本dna，根据实施例2中记载的荧光pcr反应体系和反应条件进行荧光pcr反应和标准曲线的建立，基于标准曲线和样本dna的浓度，计算出1ngdna中含有电缆细菌candidatuselectronema的亚硫酸盐还原酶β亚基(dsrb)基因的拷贝数，从而算出1ngdnacandidatuselectronema的拷贝数，结果见图8。电缆细菌candidatuselectronema的拷贝数在从最初的0天为30拷贝/ngdna，到第1天和第3天整体变化不大，第6天candidatuselectronema的拷贝数达到130拷贝/ngdna，第9天的到达了660拷贝/ngdna。candidatuselectronema的生长发育从第6天开始呈现指数增长。

根据图7和图8的结果显示：16srrna基因序列分析和荧光定量pcr，这两种方法对研究电缆细菌candidatuselectronema在沉积物中的丰度变化和生长发育过程一致，但是荧光定量pcr的灵敏度要更高，检测极限更低。

由以上实施例可以得出，采用本方法提供的定量检测试剂盒和方法灵敏度高、准确性强、重复性好，特异性强，可定量检测线性范围可达10¹-10⁸拷贝/μl。

应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120>电缆细菌candidatuselectronema的检测引物、试剂盒及定量方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catcgagtacatccgcgaac20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaatcagcaatcagcgcgtc20

<210>3

<211>132

<212>dna

<213>电缆细菌(candidatuselectronema)

<400>3

aaatcagcaatcagcgcgtcgcatgactctttgcagtcagtcatgaactccacgttgttg60

cgagtggtgaagcgcagatagcccttgcagtatttgtcagcgatgtcgcaaagttcgcgg120

atgtactcgatg132