环肽emericellamideG及其制备方法和在制备酶抑制剂中的应用与流程

本发明属于海洋生物领域，具体涉及环肽emericellamideg及其制备方法和在制备蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp抑制剂和shp1抑制剂中的应用。

背景技术：

目前，恶性肿瘤的诊疗仍是医学界最大的挑战之一，而传统的恶性肿瘤治疗手段如化疗和放疗等，虽经不断发展，却仍存在一定的局限和弊端，如不良反应大及易诱导耐药等。蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphataese，ptps)在生物体中广泛存在，与蛋白磷酸酶相关的疾病有糖尿病、癌症、肥胖症和老年痴呆症等，近年来引起科学家们的极大关注。一些ptps，比如shp1，shp2，ptp1b，tcptp等已成为抗肿瘤药物等新药开发的新靶标。找到有效且选择性高的ptps抑制剂是未来临床治疗的重要方向。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供对蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp和shp1有抑制作用的新环肽emericellamideg。

本发明的新环肽emericellamideg，其结构式如式(ⅰ)所示，

本发明的第二个目的是提供化合物emericellamideg的制备方法，它是从真菌asprergilluspuniceusscsioz021的发酵液和/或菌丝体中分离得到的。

优选，具体步骤如下：

(a)制备真菌asprergilluspuniceusscsioz021的发酵液和菌丝体；

(b)将步骤(a)得到的发酵液用大孔树脂吸附，接着用水冲洗大孔树脂去掉培养基成分，再用甲醇或乙醇冲洗大孔树脂，冲洗液浓缩后分别得到甲醇或乙醇提取物；或将步骤(a)得到的发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，萃取液浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；菌丝体破碎后用丙酮或甲醇浸泡，浸泡液减压浓缩除去丙酮或甲醇，剩余水相用乙酸乙酯萃取，浓缩得菌体的乙酸乙酯提取物；

(c)将步骤(b)所述甲醇提取物、乙醇提取物、发酵液的乙酸乙酯提取物、菌体的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷:甲醇体积比为100:0,98:2,95:5,92:8,90:10,80:20,70:30的溶剂系统梯度洗脱，收集二氯甲烷:甲醇体积比90:10冲洗下来的样品得到组分fr.6；fr.6再次经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷:丙酮体积比为100:0,95:5,90:10,80:20,70:30,50:50的溶剂系统梯度洗脱，收集二氯甲烷:丙酮体积比50:50冲洗下来的样品，经过重结晶得到化合物emericellamideg。

进一步优选，步骤(a)中所述的发酵液是通过以下方法制备：将真菌asprergilluspuniceusscsioz021在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，将真菌接种到发酵培养基中，于室温静置培养25天，得到发酵液和菌丝体，所述的发酵培养基每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、海盐30g，用水补足至1000ml。

进一步优选，步骤(b)所述的浓缩是采用减压浓缩。

本发明的第三个目的是提供化合物emericellamideg或其药用盐在制备蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp抑制剂和/或shp1抑制剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp抑制剂或shp1抑制剂，所述的tcptp抑制剂和shp1抑制剂含有化合物emericellamideg或其药用盐作为活性成分。

本发明的第五个目的是提供真菌asprergilluspuniceusscsioz021在制备化合物emericellamideg中的应用。

本发明从一株海洋真菌a.puniceusscsioz021的发酵液中分离得到新的具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp和shp1活性的环肽emericellamideg，它可用于tcptp抑制剂和shp1抑制剂先导化合物的研究。

本发明的真菌asprergilluspuniceusscsioz021，于2019年3月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为gdmccno：60611。

附图说明

图1是化合物1(化合物emericellamideg)的关键hmbc,cosy相关。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

(1)发酵培养基每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、海盐30g，用水补足至1000ml，在115℃高压蒸汽灭菌25分钟制得。按照此方式配置发酵培养基65l。将65l发酵培养基装入约200个1000ml的三角烧瓶中，每瓶约300ml。

(2)发酵液和菌丝体的制备：将真菌a.puniceusscsioz021在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，用竹签将孢子从平板上移至盛有无菌水的三角瓶中，得到孢子悬浮液，用移液枪将真菌的孢子悬浮液接种到发酵培养基中(1l三角瓶中盛有300ml发酵培养基)，于室温(26℃)静置培养25天后，收取发酵液和菌丝体。

(3)化合物分离纯化：将经上述发酵培养基培养得到的发酵液和菌丝体用纱布过滤分离，其中65l发酵液用大孔树脂吸附，接着用水冲洗大孔树脂去掉培养基成分，再用乙醇(也可用甲醇)冲洗大孔树脂得到乙醇提取物，(发酵液也可用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取)，减压浓缩得到乙醇粗提物；菌丝体破碎后用丙酮浸泡，重复提取三次，合并提取液，减压浓缩除去丙酮，剩余水相用乙酸乙酯萃取，浓缩得菌体的乙酸乙酯提取物；合并乙醇粗提物和乙酸乙酯提取物，用正相硅胶(100-200目)干法拌样后，装入玻璃层析柱(h细硅胶)，常温加压柱层析，依次用二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:0,98:2,95:5,92:8,90:10,80:20,70:30的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，最后洗脱液通过tlc和hplc检测合并得到9个组分(fr.1～fr.9)，收集二氯甲烷:甲醇体积比90:10冲洗下来的样品得到组分fr.6；fr.6再次经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷:丙酮体积比为100:0,95:5,90:10,80:20,70:30,50:50的溶剂系统梯度洗脱，收集二氯甲烷:丙酮体积比50:50冲洗下来的样品，经过重结晶(二氯甲烷-甲醇的体积比为1:1)得到化合物emericellamideg。

结构推定：

化合物1，无色针状晶体，高分辨质谱(hresims)在m/z660.4310给出[m+na]⁺离子峰，结合nmr数据(表1)推测分子式为c33h59n5o7，不饱和度为7。¹h和¹³cnmr数据具有明显的肽类化合物的特征，¹hnmr谱图中存在五个酰胺nh质子信号(δh8.14,8.03,7.90,7.54,7.36)，六个α-氨基质子(δh4.15,4.11,4.08,4.07,3.95,3.76),以及一个连氧次甲基质子(δh5.06)；在¹³cnmr谱中，观察到六个酰胺羰基或酯羰基信号(δc171.7,171.3,171.2,170.7,169.4,168.9)，一个连氧的sp³杂化的碳(δc74.1)和五个α-氨基碳(δc60.1,51.5,48.3,47.4,42.4)。ir吸收光谱中，在1634和1755cm^-1波长处存在吸收峰也证实结构中存在酰胺和酯两种官能团。六个羰基贡献了6个不饱和度，为满足7个不饱和度，化合物1应该是一个环肽。

解析2dnmr数据(表1)可知结构中存在两个丙氨酸(ala)，一个缬氨酸(val)，一个亮氨酸(leu)和一个包含十三个碳的脂肪酸片段。化合物1的波谱数据与已知化合物emericellamideb十分相似(文献：ohdc,kauffmanca,etal.journalofnaturalproducts,2007,70,515-520.)，它们具有相同的氨基酸片段，主要的区别是化合物1缺少了一个烷基长链上的甲基信号，多了一个亚甲基碳c-21(δc38.0)，¹h-¹hcosy中显示出h-21-h-24之间的连续相关，推测化合物1缺少了c-21上连接的甲基，通过与emericellamideb的脂肪酸片段对比核磁数据，并结合hmbc相关信号，确定结构中存在一个3-羟基-4,6-二甲基十二碳酸(hdmd)的结构片段。

hmbc谱中(图1)，2-nh(δh7.36)分别与两个ala片段中的羰基碳相关，h-2与c-4相关；8-nh/5-nh/h-5与c-7相关，h-14与c-18/c-13相关，14-nh与c-18相关，h-19/19-nh与c-20相关，推测氨基酸的连接次序为ala1-ala2-leu-val-gly-hdmd，c-22上的羟基与ala-1片段的羧基通过脱水形成内酯，确定了化合物1的平面结构。通过marfey反应，确定结构中的氨基酸分别为l-ala、l-leu和l-val。通过x-ray单晶衍射实验确定了所有手性中心的相对构型，由于氨基酸片段的绝对构型已知，从而确定3-羟基-4,6-二甲基十二碳酸片段的c-3/c-4/c-6均为s构型。化合物1的鉴定结果如式i所示，命名为emericellamideg

表1化合物1的¹h和¹³c-nmr数据(500,125mhz,dmso-d6,δppm)

实施例2化合物emericellamideg的蛋白酪氨酸磷酸酶活性测试

将人蛋白酪氨酸磷酸酶ptp1b，shp1，shp2，meg2ortcptp克隆到大肠杆菌(escherichiacoli)并纯化。酶抑制活性的测定是在96孔板中使用对硝基苯磷酸(pnpp)作为底物，每孔板含100μl的反应混合物。将人类重组ptp1b，shp1，shp2，meg2或tcptp(0.05μg)添加到50μl含有50mmhepes，100mmnacl，1mmedta及1mmdithiothreitol(dtt)的反应缓冲液中(ph6.5)，再在每个96孔板中分别添加待测的化合物样品(化合物emericellamideg)。na3vo4作为阳性对照，dmso作为阴性对照，用于评价此高通量筛选系统。在室温下预孵育15分钟后，添加50μl含有50mmpnpp的缓冲液，并继续在37℃下培养60分钟。磷酸酶活性是通过测定所产生的对硝基苯酚在405nm处的吸光度来测定的。ic50值是使用gen5软件计算(synergy2multi-modemicroplatereader,biotekinstruments,inc.,headquarteredinwinooski,vt,usa)。每个实验重复3次。

测试结果显示：化合物emericellamideg选择性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶tcptp和shp1，ic50值分别为1.40和6.57μg/ml，但对shp2、meg2和ptp1b没活性。阳性对照na3vo4抑制tcptp、shp1、shp2、meg2和ptp1b的ic50值分别为2.4,4.4，6.2，3.2，1.6μm；阴性对照dmso没活性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。