生物催化制备(S)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的方法与流程

本发明涉及一种医药中间体制备方法，尤其涉及一种生物酶催化制备(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的方法。

背景技术：

larotrectinib是由loxooncology公司和拜耳公司研发的一款广谱肿瘤药，用于所有表达有原肌球蛋白受体激酶(tropomyosinreceptorkinase，trk)的肿瘤患者，该药是一款针对特定基因突变，而不针对特定癌症种类的抗癌新药。其所能治疗的ntrk基因融合实体瘤包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌等癌症类型。因此，larotrectinib(loxo-101)在美国获批被认为是癌症疗法从“基于癌症在体内的起源”转向“基于肿瘤的遗传特征”这一演变过程中的重要里程碑。

larotrectinib通用名为拉罗替尼，商品名为vitrakvi，结构式如式i。该药物在2016年7月13日被fda授予突破性药物资格，用于trk融合基因突变阳性的成人及儿童的不可手术切除或转移性实体瘤，2018年11月26日，被fda批准在美国上市。根据国家药监局药品审评中心(cde)网站公开信息可知，该药品以“硫酸larotrectinib胶囊”为名称的ind申请由拜耳公司申报，且已经于2019年1月14日获受理，该药在中国申报临床并获得受理，是该药在全球进行注册的又一大进展。

随着对拉罗替尼药理学研究的进一步推进，拉罗替尼的光学异构体也具备一定的市场需求。在工业化生产过程中，拉罗替尼光学异构体作为标准对照品将具备广泛的应用市场。目前拉罗替尼光学异构体并无专门的生产路线，而是作为拉罗替尼的拆分纯化副产品制备。但随着手性合成技术研究的不断伸入，作为副产物的拉罗替尼光学异构体产出逐步降低，难以满足市场需求。根据中国专利cn107987082(a)公开的一种合成拉罗替尼的工艺路线scheme1分析可知，(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷将成为制备拉罗替尼光学异构体的关键中间体。

同时，(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷也可以应用于其他化合物的合成过程中。

整合应激反应指细胞在氧化应激、氨基酸剥夺和内质网应激等情况下,通过真核细胞起始因子2(eif2α)/活化转录因子4(atf4)所介导的细胞适应反应。主要由内质网应激反应的perk途径介导,并通过整合调控蛋白质合成、折叠、细胞自噬与凋亡。可能会引起脑白质营养不良，癌症，炎性疾病，肌肉骨骼疾病，代谢疾病，或与eif2b功能受损或isr途径中的组分相关的疾病或病症。

专利wo2019090088(a1)报道一种化合物通式能够用在治疗此类疾病中，其中包含了结构式ii的化合物，含有片段(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。此化合物目前仍然处于临床实验过程中。

综上所述，(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷不仅应用于拉罗替尼药物研究及生产领域，也会被用于一些新药研究中，因此未来将具有广泛的市场需求。

目前，仅专利cn108101820(a)报道一种制备(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的化学合成法，路线如scheme2所示。

此路线以2,5-二氟溴苯和n-甲氧基-n-甲基-4-氯丁酰胺为原料，经四步反应得到(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，需要用到格氏试剂参与反应，且需要柱层析纯化，收率较低，不适合工业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，运用亚胺还原酶催化5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯为(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，提高收率。

本发明采用的技术方案如scheme3所示：

进一步，生物催化制备(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的方法，其特征在于：将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯、亚胺还原酶酶粉或含有亚胺还原酶的细胞、辅酶、缓冲溶液配制成混合溶液，反应得到产物。

进一步，所述的亚胺还原酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步，所述的亚胺还原酶的基因核苷酸序列如seqidno.2所示。

进一步，所述反应的反应时间为12～36h，优选为24h。

进一步，所述5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯浓度为1～400g/l；亚胺还原酶酶粉浓度为1～10g/l，或含有亚胺还原酶的细胞的浓度为10～100g/l。

进一步，反应体系中可以加入辅酶促进反应，当采用含亚胺还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的亚胺还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅酶促进反应时，所述辅酶选自nad⁺、nadh、nadp⁺、nadph或它们的组合物，优选nadp⁺。

更进一步，添加辅酶的浓度为0.02～0.4g/l，优选为0.05～0.10g/l。

更进一步，本技术方案中所采用的辅酶，均选自尚科生物医药(上海)有限公司对外销售的辅酶产品。

进一步，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。

进一步，本技术方案中，所述亚胺还原酶为来源于streptomycessp.gf3587的野生型亚胺还原酶。

进一步，所述含有亚胺还原酶的细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌为基因工程改造的大肠杆菌或酵母菌。

附图说明

图1为底物标品的常规hplc分析谱图

图2为产物标品的常规hplc分析谱图

图3为实施例3的反应液常规hplc分析谱图

图4为消旋产物标品的手性hplc分析谱图

图5为r型产物标品的手性hplc分析谱图

图6为实施例3的反应液手性hplc分析谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1亚胺还原酶的筛选

使用本公司的亚胺还原酶(ired)酶库对底物进行反应筛选，反应体系组分如下：0.1mph7.0磷酸钾缓冲液，底物1g/l，dmso10％，nadp0.2g/l，葡萄糖10g/l，gdh(葡萄糖脱氢酶)5g/l，ired酶粉10g/l。于30℃反应24h，进行hplc检测。结果显示，筛到的效果最好的酶为来自于streptomycessp.gf3587的亚胺还原酶，转化率为98.2％，手性hplc检测显示产物手性纯度为96.6％，s构型为优势构型。

实施例2亚胺还原酶细胞的制备

将含有亚胺还原酶的编码基因(seqidno.2)的基因工程菌(载体pet24a，宿主细胞e.colibl21(de3))接种至5ml含卡那霉素的lb试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至380ml含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养od至0.6-0.8，加入iptg(终浓度0.1mm)于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到亚胺还原酶细胞。

实施例3使用亚胺还原酶酶粉制备(2s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷

向100ml反应体系中加入0.1mph7.0磷酸钾缓冲液，底物10g/l，dmso10％，nadp0.2g/l，葡萄糖10g/l，gdh5g/l，亚胺还原酶细胞50g/l。于30℃反应24h，进行hplc检测。底物标品的常规hplc图谱如图1所示；产物标品的常规hplc图谱如图2所示；反应液的常规hplc图谱如附图3；消旋产物的手性hplc图谱如附图4所示；r型产物标品的手性hplc图谱如附图5所示；反应液的手性hplc图谱如图6所示。底物转化率为90.6％，s型产物手性纯度为96.6％。

序列表

<110>尚科生物医药（上海）有限公司

<120>生物催化制备(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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