一种以太平洋牡蛎壳为钙源的L-天冬氨酸螯合钙制备方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种以太平洋牡蛎壳为钙源的L-天冬氨酸螯合钙制备方法。

背景技术：

牡蛎作为我国四大养殖贝类之首，也是全球重要的养殖对象，盛产于整个沿海地区，素有“海中牛奶”的美誉。我国的牡蛎产量居世界首位，2017年的牡蛎海水养殖产量达487.94×10⁴t，占我国贝类养殖总产量的34％，占全球牡蛎产量的85.95％。目前，牡蛎的加工主要集中在牡蛎肉方面，而占牡蛎绝大部分重量的牡蛎壳被大量丢弃。研究发现，每生产1kg牡蛎，就会产生370-700g副产物，几乎全部都是壳。在我国，每年处理约1 000万吨壳体废物，这些废弃物通常被丢弃到垃圾填埋场，或加工成饲料库存等，但废弃物填埋、堆肥和海洋倾倒等都会引起诸多环境问题，如未经处理的壳中残留的附着肉腐烂和微生物分解产生H2S，NH3和胺等导致空气污染和土壤污染，以及对海洋生态系统的破坏，并且占用了宝贵的土地和滩涂资源。因此，在牡蛎加工业中迫切需要一种能较好利用废弃牡蛎壳的方法。

目前牡蛎壳的利用主要包括中药制剂、土壤调理剂、工业吸附剂、骨仿生材料、食品抗菌剂等。但仍不同程度地存在废物消纳量有限、产品市场容量小、成本过高等问题，导致资源利用不充分。因此，需要一种绿色、高效、实用、低成本的方法来充分利用废弃牡蛎壳资源。

因牡蛎壳中39％以上都是钙元素。因此，可将其用作生产氨基酸螯合钙的钙源。本发明中涉及的水相加热磁力搅拌的制备方法，是一种高效、实用、低能耗的新方法，该方法操作简单，不需要昂贵设备，无辐射，能耗低，是一种推广性较强的螯合方式。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以太平洋牡蛎壳为钙源的L-天冬氨酸螯合钙制备方法，本发明的有益效果是方法具有较高的产品得率和可观的螯合率，螯合工艺简单，成本低，不需昂贵设备，工业上容易实现大批量生产。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

(1)用毛刷多次刷洗牡蛎壳表面的泥沙、杂质、残肉等，于NaOH溶液中浸泡48h；

(2)用自来水对步骤(1)中的牡蛎壳进行充分清洗，并用蒸馏水冲洗多次，放置于烘箱中烘干；

(3)将步骤(2)中得到的干燥的牡蛎壳用榔头敲碎成小块，置于高速粉碎机中粉碎1min后，过筛制得备用壳粉；

(4)将L-天冬氨酸和牡蛎壳粉按一定比例配料，加入5倍体积的氨基酸和壳粉总质量的蒸馏水，加热到一定温度，调节pH；

(5)使用恒温磁力搅拌一定时间，趁热过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状；

(6)无水乙醇沉淀提纯，收集沉淀，于-20℃冰箱预冻，置于冷冻干燥机中干燥制得成品。

进一步，所述步骤(4)中，氨基酸为L-天冬氨酸，所述的天冬氨酸为食品级L-天冬氨酸，纯度97％以上。

进一步，所述步骤(5)中，减压浓缩至即将有白色晶体析出时即为浓缩结束。

进一步，所述步骤(6)中，采用旋蒸后浓缩液体积8～12倍的无水乙醇进行螯合钙产物的提纯，温度设定-20℃，时间16～24h，离心收集沉淀。

附图说明

图1是不同目筛壳粉的螯合率比较；

图2是不同目筛壳粉的钙含量比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明技术方案实施例如下：

(1)多次用毛刷刷洗完牡蛎壳之后，浸泡在质量分数为5％的NaOH溶液中48h；

(2)用自来水对步骤(1)中的牡蛎壳进行充分清洗，并用蒸馏水冲洗多次，将清洗干净的牡蛎壳置于50～60℃的烘箱中进行充分干燥；

(3)将步骤(2)中得到的干燥的牡蛎壳用榔头敲碎成小块，置于高速粉碎机中粉碎1min后，过筛制得备用壳粉，过筛以得到均匀细致的牡蛎壳粉，有利于提高螯合反应效率；

(4)氨基酸为L-天冬氨酸，所述的天冬氨酸为食品级L-天冬氨酸，纯度97％以上。L-天冬氨酸和5倍质量体积的蒸馏水置于恒温磁力搅拌器中保温一定时间后，与壳粉进行充分混合，使钙元素和L-天冬氨酸摩尔质量比为1:1～1:3，用NaOH溶液和HCl溶液调节体系pH值为3～7，反应时间为60～120min，反应温度为40～60℃；

(5)使用恒温磁力搅拌一定时间，趁热过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状；趁热将反应后的液体过滤，弃去沉淀，保留上清液，将所得的上清液利用旋转蒸发仪在40～60℃的下进行中快速减压浓缩，使上清液体积浓缩至原有体积的40～50％，当旋蒸瓶内壁上即将有白色晶体析出时即为浓缩结束。

(6)无水乙醇沉淀提纯，收集沉淀，于-20℃冰箱预冻，置于冷冻干燥机中干燥制得成品。利用氨基酸金属螯合物在无水乙醇中溶解度极低，而游离的氨基酸和金属离子均能溶于无水乙醇的原理，采用旋蒸后浓缩液体积8～12倍的无水乙醇进行螯合钙产物的提纯，温度设定-20℃，时间16～24h，离心收集沉淀，用无水乙醇反复洗涤，沉降，离心，直至上清液与茚三酮和二硫腙试剂反应均无颜色变化为止，将沉淀在-20℃冰箱中预冻，置于冷冻干燥机中干燥制得成品。

螯合反应过程中pH、温度、时间、物料摩尔比的单因素优化实验：

(1)用毛刷多次刷洗牡蛎壳表面的泥沙、杂质、残肉等，于NaOH溶液中浸泡48h；

(2)用自来水对步骤(1)中的牡蛎壳进行充分清洗，并用蒸馏水冲洗多次，放置于烘箱中烘干；

(3)将步骤(2)中得到的干燥的牡蛎壳用榔头敲碎成小块，置于高速粉碎机中粉碎1min后，过筛制得备用壳粉；

(4)将L-天冬氨酸和牡蛎壳粉按一定比例配料，加入5倍体积的氨基酸和壳粉总质量的蒸馏水，加热到一定温度，调节pH；

(5)使用恒温磁力搅拌一定时间，趁热过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，无水乙醇沉淀提纯，收集沉淀，于-20℃冰箱预冻，置于冷冻干燥机中干燥制得成品。

表1为螯合反应过程中溶液pH的优化；表2为螯合反应过程中反应温度的优化。表3为螯合反应过程中反应时间的优化。表4为螯合反应过程中物料摩尔比的优化。

表1

表2

表3

表4

由表1-4可知，最佳的螯合反应条件为：L-天冬氨酸与牡蛎壳粉CaCO3摩尔比2:1，时间90min，温度50℃，pH 5.0。考虑到牡蛎壳粉廉价易得，为降低成本且利于与L-天冬氨酸充分反应，可将牡蛎壳粉适当过量10～20％。

过不同目筛的壳粉对螯合反应效果的实验：

(1)将高速粉碎机粉碎的牡蛎壳粉分别过100目筛、200目筛、300目筛，得到200～100目筛壳粉、300～200目筛壳粉、＜300目筛壳粉；

(2)将L-天冬氨酸和不同目筛的牡蛎壳粉按摩尔比2:1配料，加入5倍体积的氨基酸和壳粉总质量的蒸馏水，调节pH为5.0，加热到50℃，水浴螯合反应90min；(3)反应结束后，将液体趁热过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，无水乙醇沉淀提纯，收集沉淀，于-20℃冰箱中预冻，置于冷冻干燥机中干燥制得成品。

由图1-2可知，300～200目筛和＜300目筛壳粉的螯合率和钙含量均显著高于200～100目筛的壳粉。＜300目筛壳粉在螯合反应后的钙含量最高，为11.2％，与300～200目筛壳粉相比，两者之间的螯合率差异不显著。因此，从生产成本和能耗的角度考虑，选用300～200目筛的壳粉作为最适反应原料。

L-天冬氨酸螯合钙体外模拟肠道钙转运试验：

(1)将8只雌性C57小鼠(7至8周龄)饲养在空调动物房中(20-24℃，55-65％湿度)。在试验前禁食约12h，允许自由饮水。

(2)12h后处死C57小鼠并从Treitz韧带处开始取出小肠。每量取7cm肠段剪下，立即置于DPBS缓冲溶液中彻底冲洗，每段肠子末端用棉线扎紧，从另一端注入300μl样品后扎紧，然后放入Hanks’平衡盐溶液中(136mM NaCl，8.17mM KCl，1.0mM MgCl2,11.1mM葡萄糖，20mM HEPES，调节至pH 7.4)，于37℃培养箱中保温放置，分别计时1～3h。

(3)收集不同时间的浆膜溶液，用原子吸收分光光度计测定钙的转运率。

实验结果在1h内，葡萄糖酸钙和自制螯合钙的钙释放速度都显著快于氧化钙和钙立速，1-2h的葡萄糖酸钙和另外两种氨基酸螯合钙产品的钙转运速度均继续加快，但两组螯合钙组间无显著差异，3h后肠外葡萄糖酸钙和自制螯合钙的钙含量显著高于钙立速，但除了自制螯合钙外其他组的钙转运量均有所降低，可能是随着实验时间的延长，肠外渗透压增大，钙离子部分回到肠道中。

体外模拟肠道钙转运试验结果表明，自制的L-天冬氨酸螯合钙具有较好的钙转运效果，其转运效果优于无机补钙剂，且与市售氨基酸螯合钙的补钙效果差异不大，可作为一种新型牡蛎壳源的钙营养补充剂。

综上，本发明克服了现有氨基酸螯合钙制备方法的诸多缺点，具有以下优点：①所使用的氨基酸为食品级L-天冬氨酸，来源广泛，成本低廉，安全无毒无污染，已被批准为食品添加剂在较多食品中有所应用，纯度97％以上，且为酸性氨基酸，螯合效果优良；②所使用的钙源是来自贝类产量最高的牡蛎壳，含有大量天然生物钙，价格低廉，安全无毒，且经过300～200目筛的壳粉，粒度均匀，平均粒度大小在50～75μm左右，此条件下可获得较高的螯合率，能够有效利用废弃牡蛎壳中的钙源，扩大牡蛎壳的消纳量，促进壳体废物资源化，推动牡蛎加工业的绿色可持续发展；③所使用的水相加热磁力搅拌的制备方法，是一种高效、实用、低能耗的新方法，该方法操作简单，不需要昂贵设备，无辐射，无污染，是一种推广性较强的螯合方式。

本发明能够丰富水产品副产物资源加工利用理论，极大地促进牡蛎养殖规模和加工产业的发展。

本发明优点还在于：

(1)牡蛎壳中含有丰富的钙元素，重金属含量低，杂质少，但是目前对于牡蛎壳在市场上并没有较好的食品或特殊医学用途食品以供食用，从而导致牡蛎壳在食品领域的市场容量小，且易造成固体废弃物资源的浪费。本发明赋予了牡蛎壳一种新的螯合制备方式，能够有效利用牡蛎壳的钙源，扩大牡蛎壳的消费量，促进壳体废物资源化利用，推动牡蛎加工业的绿色可持续发展。

(2)所采用的氨基酸为食品级L-天冬氨酸，来源广泛，成本低廉，安全无毒无污染，纯度高，螯合效果优良。

(3)所采用的牡蛎壳粉为过300～200目筛的壳粉，粒度均匀，平均粒度大小在50～75μm左右，此条件下的能耗低，且可获得较高的螯合率。

(4)将食品级L-天冬氨酸与细分过筛的牡蛎壳粉配比使用，采用在推动废弃牡蛎壳资源化的同时制备出具有较高产量和螯合率的氨基酸螯合钙产品，以期用于食品添加剂或钙营养强化剂等途径。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。