一种水稻种子耐贮藏性基因sd1及其分子标记和应用的制作方法

本发明属于作物分子生物学领域，具体地说，涉及一种水稻种子耐贮藏性基因sd1及其分子标记和应用。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，种子在贮藏过程中活力衰退严重影响农业生产，而稻谷陈化变质不仅降低其食用价值，更增加食品安全风险。粮食作物种子耐贮藏性包括两方面：维持种子生活力以及保留粮食原有食用品质。种子耐贮藏性受基因型与贮藏环境等影响，遗传因子调控的种子保护与生物大分子损伤修复机制发挥决定性作用(rajjouanddebeaujou2008,宋松泉等2008)。作物种子收获后受贮藏环境诱导不可避免地发生老化，导致生活力下降,进而影响其种用价值与作物产量(yamauchiandwinn1996)。种子耐贮藏性强的品种，经过一段时间贮藏后仍具有较高的生活力与播种价值，延长商品用种供应时效性。因此，种子耐贮藏性是重要的农艺性状和商品特性，直接关系到在农业生产上种子生产利用效果。其次，我国农业生产已经进入粮食生产过剩时期，每年都会有超过10000万吨小麦、稻谷等转入各类粮食企业仓库长期贮藏(国家统计局2017)。而水稻种子寿命一般为1-2年，在潮湿热带地区种子更容易劣变，寿命也更短。生活力降低也伴随着粮食品质下降，仓储损失率急剧增加。

种子受贮藏环境诱导代谢增强，活性氧过度累积诱导生物大分子损伤，如脂膜过氧化、蛋白羰基化以及核酸链断裂，导致种子劣变。以抑制活性氧产生或增强清除能力为基础的植物自身保护机制以及氧化损伤修复系统是调控种子耐贮藏性的关键。水稻是重要的粮食作物，其产区湿热环境容易诱导种子劣变，导致其种子寿命也更短，一般只有1-2年。因此，提高水稻种子耐贮藏性能保留粮食原有加工和营养品质，延长粮食供应时效性，对保障粮食供应安全具有重大的社会效益和经济价值。目前研究者已经利用多个水稻遗传群体检测到超过50个种子耐贮藏性相关qtls，然而它们的遗传与生理基础以及分子调控机理缺乏深入研究，仍需要挖掘更多的种子耐贮藏基因，为改良贮藏性，保留粮食食用品质以及指导粮食科学贮藏提供科学指导。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种水稻种子耐贮藏基因sd1及其分子标记和应用。

本发明通过以水稻zs97为背景连续多代回交构建nil-sd1^nip与zs97的近等基因系，证明了zs97中无功能的半矮秆突变体基因sd1会增加种子的耐贮藏性。

本发明提供的水稻种子耐贮藏性基因sd1，其为如下任一：

(1)所述sd1的全长序列如seqidno.2所示；或

(2)seqidno.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸编码相同功能蛋白的基因，或

(3)所述sd1的全长序列为seqidno.4所示序列的第139位插入一个t；或

(4)所述sd1的全长序列为seqidno.4所示序列的第134-137位的4个碱基缺失，即缺失catt；

(5)所述sd1的全长序列为seqidno.4所示序列的第127-144位的18个碱基缺失，即缺失ccggagccattcgtgtgg。

上述(1)，该基因发挥功能是野生型sd1序列(seqidno.4)的第2599位c碱基突变为g，导致蛋白提前终止，功能丧失。其cds序列如seqidno.5所示。

本发明还提供了水稻种子耐贮藏性基因sd1编码的蛋白，其具有：

1)如seqidno.3所示的氨基酸序列；或

2)seqidno.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由2)衍生的蛋白质。

本发明提供了含有sd1基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒。

本发明提供了上述水稻种子耐贮藏性基因sd1、或其编码的蛋白、或含有该基因的生物材料在提高植物种子耐贮藏性能中的应用。

本发明提供了上述水稻种子耐贮藏性基因sd1、或其编码的蛋白、或含有该基因的生物材料在延长植物种子种用时间、提高种子质量中的应用。

本发明发现含有sd1基因的种子对氧化胁迫耐受能力显著地增强(图1)，种子经过人工老化后发芽率显著地提高(图1)，本发明通过crispr技术诱导sd1基因功能丧失突变植株，可以增加种子在氧化胁迫和人工老化后的发芽率(图2)。第一次绿色革命中水稻功能性半矮秆基因sd1的应用极大的降低了株高，增加了粮食产量，本研究发现其隐性等位基因sd1可以增加种子的抗氧化能力与耐贮藏性，为如何利用sd1基因提供了新思考。

基于此，本发明提供了所述的水稻种子耐贮藏基因sd1、其编码的蛋白、含有其的生物材料在植物育种、种质资源改良、制种、或培育转基因植物中的应用。

上述应用中，所述的植物为水稻、大豆、小麦、大麦、高粱、小米、芝麻、油菜、玉米、花生。优选地，所述植物为水稻。

本发明提供了所述的水稻种子耐贮藏基因sd1、其编码的蛋白、含有其的生物材料在培育耐贮藏性水稻新品种中的应用。

本发明提供了所述的水稻种子耐贮藏基因sd1、其编码的蛋白、含有其的生物材料在调控水稻种子耐贮藏性状、提高水稻种子耐贮藏性中的应用。

进一步地，本发明提供了水稻sd1基因在负调控水稻种子耐贮藏性中的应用，所述水稻sd1基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。水稻sd1基因的cds序列如seqidno.1所示。

本发明提供了水稻sd1基因在负调控水稻种子抗氧化胁迫中的应用，所述水稻sd1基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明提供了水稻耐贮藏基因sd1的分子标记，其为indel分子标记，相比于半矮秆基因sd1，其所示的核苷酸序列的第二个内含子中存在一段25bp的缺失，即seqidno.4所示的野生型sd1基因的第1262-第1286的共25bp的片段缺失。

本发明所述的分子标记可通过核苷酸序列如seqidno.6-7所示的引物对pcr扩增得到。

本发明还提供了一种用于检测水稻耐贮藏基因sd1的引物对，其为：sd1-f：cgggaagaaaccgacctga(seqidno.6)

sd1-r：cgtggctgttggcacctct(seqidno.7)

本发明提供了上述分子标记的以下任一种应用，

(1)在植物育种、种质资源改良、制种或培育转基因植物中的应用；

(2)在培育耐贮藏性水稻新品种、或抗氧化胁迫能力强的水稻新品种中的应用；

(3)在水稻种子耐贮藏改良育种中的应用；

(4)筛选耐贮藏能力强的水稻种子、或抗氧化胁迫能力强的水稻种子，或淘汰耐贮藏能力弱、或抗氧化胁迫能力弱的水稻种子中的应用；

(5)筛选种用时间长，质量高的水稻种子中的应用；

(6)在检测本发明所述分子标记基因型中的应用。

上述应用，具体地，可通过核苷酸序列如seqidno.6-7所示的引物对样品基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增产物在全自动毛细管电泳仪中检测，若电泳结果出现一条大小为468bp的特征条带，则待测水稻含有野生型sd1，水稻种子耐贮藏性低；若电泳结果出现一条大小为443bp的特征条带，则待测水稻含有突变型sd1种子耐贮藏性高；若电泳结果出现上述两条特征条带，则待测水稻为杂合型。

20μlpcr反应体系为：dna模板100ng，10×pcrbuffer2μl，2mmdntp混合液2μl，10μm引物sd1-f和sd1-r各0.3μl，rtaqdna聚合酶0.1μl，ddh2o补至20μl；

pcr扩增程序设置为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环32次；72℃延伸7分钟，结束反应。

本发明通过构建zs97背景的sd1的nip与zs97近等基因系，证明了zs97中无功能的半矮秆突变体基因sd1会增加种子耐贮藏性和调控种子抗氧化性。本发明利用crispr技术诱导正常水稻品种中半矮秆基因sd1功能丧失突变体植株，发现sd1突变体增强种子耐贮藏性，证实了该基因具有重要的应用价值。该发明为利用sd1基因进行水稻种子耐贮藏性改良育种提供了新的路径。本发明还提供了用于检测sd1基因的分子标记，利用该分子标记可以检测sd1等位基因与基因选择，实现其在培育强种子耐贮藏性的水稻品种中的应用。

附图说明

图1为sd1近等基因系种子在氧化胁迫(左图)和人工老化后(右图)的发芽率情况对比图。

图2为sd1突变体基因型(上图)以及在氧化胁迫(左下图)和人工老化(右下图)后的发芽情况。

图3为sd1突变体在氧化胁迫(左图)和人工老化(右图)后的发芽率。

图4为sd1在nip、zs97中第二个内含子上的序列差异，图中zs97为突变体水稻。

图5为分子标记进行检测的效果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例中使用的水稻(oryzasativa)品种nip、zs97为标准品种。

实施例1通过近等基因系验证sd1调控水稻种子耐贮藏性

为了验证sd1的遗传效应，对nip和zs97中的sd1基因进行测序比较。发现zs97的sd1相比于nip在二个内含子1262-1286处存在25bp的缺失；在编码区存在4处snp突变导致氨基酸的改变。其中第2599位(seqidno.4序列中的该位点)的snp(c/g)使zs97蛋白提前终止，功能丧失。通过连续多代回交构建nil-sd1^nip，其遗传背景为zs97，全基因组仅在sd1处含有nip片段(小于2mb)。在氧化胁迫条件下：将饱满、成熟一致种子nil-sd1^nip和zs97分别分装到垫有3张滤纸的玻璃培养皿(直径9cm)，加入15ml260mmh2o2溶液，25℃恒温避光培养，7天后统计发芽种子。依据胚芽或胚根突破种皮超过2mm作为种子发芽标准，结果表明nil-sd1^nip种子发芽率为78％显著地低于zs97的发芽率97％(图1)。

在人工老化条件下：挑选饱满、成熟一致的150粒种子装入10mlpe管，然后将该批种子统一放置到种子老化箱中在温度44℃，湿度95％条件下进行加速老化，老化时间(6-8天)根据种子批次不同做相应调整。老化结束后将种子从老化箱中取出，每管种子混匀后进行发芽试验，结果发现nil-sd1^nip种子发芽率63％显著地低于zs97的发芽率98％(图1)。

以上实验通过自然群体中zs97蛋白提前终止突变体证明了其相较野生型有更强的耐贮藏性和抗氧化胁迫性。

实施例2水稻种子耐贮藏基因sd1的获得与表型分析

1.遗传转化载体与sd1水稻突变体植株构建

采用crispr技术构建sd1突变体的方式进一步确定该基因的功能。本发明中crispr载体由华中农业大学赵云德教授提供，crispr靶位点设计根据crisper2.0，将靶位点设计在第一个外显子，靶位点序列为agatcccggagccattcgtg，pcxun空载体使用kpni酶切线性化后与osu3-f/r扩增pcr产物进行同源重组，连接产物转化dh5α大肠杆菌，复苏后菌液涂到kana抗性的la培养皿，37℃培养14h。挑取单克隆扩繁抽提质粒，使用osu3-f测序，靶位点无突变即得到最终载体。把构建好的正确载体转入农杆菌eha105，参照(hieietal1994)将菌株导入中花11的愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织，分化、生根并最终转移到大田得到转基因植株。

2、表型分析经过对t1代转基因植株进行测序，得到3个不含cas蛋白的sd1移码突变体，其移码突变情况见图2，mt1在300位置处提前终止，mt2在194位置处提前终止，mt1移码突变，突变体材料未老化种子发芽率在95％以上，说明sd1不影响种子原始生活力。经过与实施例1类似的氧化胁迫处理发现突变后种子对氧化胁迫耐受能力显著地增强(图3)，野生型的发芽率为78％，三个突变体的发芽率分别为95％、95％和98％，经过与实施例1类似的人工老化试验后发现，突变体经过人工老化后发芽率显著地提高(图3)，野生型的发芽率为64％，三个突变体的发芽率为95％、95％和90％。证实了sd1突变体相蛋白提前终止，使种子的抗氧化能力提高、耐贮藏性增强。本实施例说明，sd1基因(seqidno.4)发生突变，使sd1蛋白编码提前终止，能够提高种子耐贮藏性和抗氧化胁迫性。

实施例3sd1分子标记的获得

为了将半矮秆基因sd1与本实验中的突变体sd1区分开，本实施例对nip、zss97进行比较测序，发现二者在第二个内含子区域存在一个25bp的插入缺失：zs97的sd1基因相对于sd1基因的第二个内含子上缺失25bp(见图4)。在msu网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载sd1的基因序列，截取以该25bp插入缺失变异为中心的上下游400bp的序列，利用软件primerpremier5设计引物，用以扩增包括该25bp插入缺失位点的片段，设计的基因标记命名为sd1，相应引物序列分别为sd1-f:5′-cgggaagaaaccgacctga-3′(seqidno.6)

sd1-r:5′-cgtggctgttggcacctct-3′(seqidno.7)

引物由上海生工生物公司合成。

利用设计的基因标记sd1-f/r，对样品dna进行pcr扩增，利用基因标记检测sd1的多态性。

pcr反应体系：总体积20μl包括：dna模板100ng，2μl10xpcrbuffer，2μl2mmdntp混合液，10μlm的引物osfa3f和osfa3r各0.3μl，0.1μlrtaqdna聚合酶。在pcr热循环仪上进行pcr反应。pcr扩增程序设置为：94℃先预变性4分钟，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环32次，最后72℃延伸7分钟结束反应。

pcr产物在全自动毛细管电泳仪读取基因型带型。结果如图5所列，基因sd1在nip、zs97中具有多态性，基因标记sd1扩增成功，带型清晰，多态性明显、扩增片段大小适中，说明开发的标记可成功检测水稻不同品种中sd1的基因变异。

电泳结果出现一条大小为468bp的特征条带，相应待测水稻种子的耐贮藏性低；电泳结果出现一条大小为443bp的特征条带，相应待测水稻种子的耐贮藏性高；若电泳结果出现上述两条特征条带，则待测水稻为杂合型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种水稻种子耐贮藏性基因sd1及其分子标记和应用

<130>khp191113351.5

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1170

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>2575

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>388

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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151015

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354045

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385

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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