一种南瓜蚜传黄化病毒运动蛋白纯化表达方法及其多克隆抗体的制备与流程

文档序号：18907420发布日期：2019-10-18 23:00阅读：462来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测南瓜蚜传黄化病毒及其运动蛋白的血清学方法及其专用纯化表达方法及其多克隆抗体的制备。

背景技术：

南瓜蚜传黄化病毒(cucurbitaphid-borneyellowsvirus，cabyv)是侵染葫芦科作物的重要病毒，属于黄症病毒科(luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(polerovirus)。该病毒局限在寄主植物韧皮部组织，主要通过两种蚜虫(myzuspersicae和aphisgossypii)以持久循回型和非增殖方式传播。近年来，由cabyv侵染引起的葫芦科作物病毒病在我国发生面积不断扩大，严重影响了葫芦科作物的产量及品质，造成重大经济损失，cabyv既可以单一侵染，也可以复合侵染，典型症状是引起叶片的黄化和增厚，造成田间植株约减产50％。

cabyv为正义单链rna(+ssrna)病毒，具有直径为25-30nm的正二十面体球形病毒粒子，由180个蛋白亚基按t＝3形成，包裹着基因组rna，无包膜。病毒粒子较稳定，对氯仿和非离子去垢剂不敏感，但在高盐条件下长时间处理会被破坏。cabyv基因组全长约5.7kb，共含有7个开放阅读框(orfs)，编码7个蛋白，前三个orf通过基因组rna表达，后四个通过亚基因组rna表达，其中orf4编码南瓜蚜传黄化病毒运动蛋白(简称cabyv-mp蛋白)，通过渗透扫描表达，可定位在胞间连丝，在病毒复制和移动过程中发挥重要调节作用。

目前对于cabyv的检测，主要利用rt-pcr技术，据报道血清学技术主要利用cabyv提纯病毒粒子制备的抗血清通过westernblot或elisa进行检测，然而利用mp蛋白制备抗血清检测cabyv尚未见正式报道。

技术实现要素：

本发明首先提供一种南瓜蚜传黄化病毒(cucurbitaphid-borneyellowsvirus，cabyv)运动蛋白(cabyv-mp)表达纯化方法，具体步骤为：

(1)cabyv-mp基因的调取及扩增：

(2)cabyv-mp基因原核表达载体构建；

(3)his-tag-(cabyv-mp)融合蛋白的原核表达；

(4)his-tag-(cabyv-mp)融合蛋白的纯化。

其中，所述cabyv-mp基因的调取及扩增是以含有cabyv全长cdna克隆的pcass-cabyv质粒为模板，以5′-catatgcagggaggcggaggcgaag-3′(下划线为限制性内切酶ndei的识别位点)和5′-ctcgagcctatttcgggttttggacctgg-3′(下划线为限制性内切酶xhoi的识别位点)为引物进行pcr扩增；

其中，所述cabyv-mp基因原核表达载体构建是将步骤(1)中得到的pcr扩增产物和克隆载体pmd19-t进行连接，得到重组质粒pmd19-t-cabyv-mp，用限制性内切酶ndei和xhoi进行酶切，回收酶切片段，取载体pdb.his.mbp，用限制性内切酶ndei和xhoi进行酶切，回收载体骨架，将所述酶切片段和所述载体骨架进行连接，得到重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp；

其中，所述his-tag-(cabyv-mp)融合蛋白的原核表达是将步骤(2)中获得的原核表达载体导入大肠杆菌rosseta中，得到重组菌rosseta-cabyv-mp，取rosseta-cabyv-mp单克隆，接种培养至od600nm值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，18℃、180rpm振荡诱导培养16h，4℃、5000rpm离心6min，收集菌体沉淀，重悬后超声破碎，收集上清液；

其中，所述his-tag-(cabyv-mp)融合蛋白的纯化是将步骤(3)中获得的上清与ni亲和层析柱结合，再用咪唑洗脱液洗脱蛋白；

本发明还提供根据本发明所述表达纯化方法获得的cabyv-mp蛋白，其特征在于所述cabyv-mp蛋白具有如seqidno:4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述cabyv-mp蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述cabyv-mp蛋白基因的核苷酸序列52％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述cabyv-mp蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中seqidno:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有52％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明进一步提供上述cabyv-mp蛋白在制备多克隆抗体中的应用。

其中，所述多克隆抗体是由1体积份融合蛋白溶液(含400μg融合蛋白)和1体积份弗氏完全佐剂混合得到混合液甲以及1体积份融合蛋白溶液(含200μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合得到混合液乙共同免疫新西兰白兔获得的。

本发明最后提供一种用于南瓜蚜传黄化病毒(cucurbitaphid-borneyellowsvirus，cabyv)检测的试剂盒，所述试剂盒包括：根据本发明所述方法获得的cabyv-mp蛋白多克隆抗体。

本发明首先制备了氨基酸序列如seqidno:4所示的cabyv-mp蛋白，然后将cabyv-mp蛋白作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，获得多克隆抗血清(抗体)。采用westernblot，以该多克隆抗体为一抗检测南瓜蚜传黄化病毒及其运动蛋白，该多克隆抗体不仅准确率高、灵敏度高，而且特异性好。本发明可检测待测样品是否含有南瓜蚜传黄化病毒，用于研究运动蛋白的功能，以及构建南瓜蚜传黄化病毒检测试剂盒，具有重大的应用价值和市场前景。

附图说明

图1：cabyv-mp融合蛋白的表达和纯化；

图2：cabyv-mp多克隆抗体的效价测定，其中(a)抗血清的效价测定，(b)抗血清最适使用范围测定；

图3：cabyv-mp多克隆抗体的灵敏度分析；

图4：cabyv-mp多克隆抗体的特异性分析；

图5：cabyv-mp多克隆抗体在病毒检测上的应用，其中(a)为多克隆抗体检测感染cabyv的本生烟叶片，(b)为模拟天然寄主黄瓜感染cabyv的多克隆抗体检测。

具体实施方式：

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠杆菌mc1022由法国斯特拉斯堡大学salahbouzoubaa教授惠赠，大肠杆菌rosseta购自biomed公司，农杆菌gv3101由英国universityofcambridge的davidbaulcombe教授惠赠，公众可从中国农业大学(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

本生烟(nicotianabenthamiana)由英国johninnescentre的davidbaulcombe教授惠赠，公众可从中国农业大学(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

克隆载体pmd19-t(simple)为takara公司的产品。ni亲和层析柱为qiagen公司。双元表达载体pmdc32(curtisandgrossniklaus,2003)、含有cabyv-mp基因重组质粒pcass-cabyv、南瓜蚜传黄化病毒(cabyv)、甜瓜蚜传黄化病毒(mabyv)、丝瓜蚜传黄化病毒(sabyv)、芸薹黄化病毒(bryv)、马铃薯卷叶病毒(plrv)、甘蔗黄叶病毒(scylv)的带有flag标签的mp瞬时表达载体，由本实验室构建，公众可从中国农业大学(即申请人)获得，这里用来检测所制备抗体的特异性。

载体pdb.his.mbp(环形)购自dnasu质粒库，其核苷酸序列如序列表中seqidno:1所示。

下述实施例中的tbst缓冲液均为含0.05％(v/v)tween-20、150mmnacl、20mmtris-hcl(ph7.5)的缓冲液。

实施例1、重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp的构建

1、以含有cabyv全长cdna克隆的pcass-cabyv质粒为模板，以5′-catatgcagggaggcggaggcgaag-3′(下划线为限制性内切酶ndei的识别位点)和5′-ctcgagcctatttcgggttttggacctgg-3′(下划线为限制性内切酶xhoi的识别位点)为引物进行pcr扩增，得到约595bp的pcr扩增产物。

2、将步骤1得到的pcr扩增产物和克隆载体pmd19-t(simple)进行连接，得到重组质粒pmd19-t-cabyv-mp。

3、取重组质粒pmd19-t-cabyv-mp，用限制性内切酶ndei和xhoi进行酶切，回收约570bp酶切片段。

4、取载体pdb.his.mbp，用限制性内切酶ndei和xhoi进行酶切，回收约6.5kb的载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切片段和步骤4得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp。

将重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp进行测序。根据测序结果，对重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp进行结构描述如下：将载体pdb.his.mbp的限制性内切酶ndei和xhoi识别序列间的dna小片段替换为seqidno:2所示的双链dna分子。seqidno:2与限制性内切酶ndei识别序列(catatg)中的atg组成cabyv-mp基因的如seqidno:3所示的核苷酸序列。cabyv-mp基因编码如seqidno:4所示的cabyv-mp蛋白。

重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp中，seqidno:3所示的dna分子与载体骨架上的his-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的seqidno:5所示的融合基因，表达如seqidno:6所示的具有his-tag标签的融合蛋白。

实施例2、融合蛋白的表达和纯化

1、将重组质粒pdb.his.mbp-cabyv-mp导入大肠杆菌rosseta(与材料中菌株一致)，得到重组菌，将该重组菌命名为rosseta-cabyv-mp。

2、完成步骤1后，取rosseta-cabyv-mp单克隆，接种至5mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

3、完成步骤2后，取培养菌液，按体积比为1:1000接种至lb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养至od600nm值为0.6～0.8。加入终浓度为0.1mm的iptg，18℃、180rpm振荡诱导培养16h，4℃、5000rpm离心6min，收集菌体沉淀1。

取培养菌液，按体积比为1:1000接种至lb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养至od600nm值为0.6～0.8，4℃、5000rpm离心6min，收集菌体沉淀2(作为对照)。

4、完成步骤3后，取菌体沉淀(菌体沉淀1或菌体沉淀2)，加入100ml含500mmnacl的ph8.0、20mm的tris-hcl缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率600w，循环程序为：破碎4s，停6s，共3次。4℃、16000rpm离心40min，收集上清液。将上清液加入ni亲和层析柱，再用不同浓度(20mm、40mm、60mm、100mm、200mm、500mm)的咪唑洗脱液洗脱蛋白，收集洗脱液。将每个纯化过程的洗脱液进行sds-page检测，如图1所示。结果表明，上清液中存在融合蛋白浓缩合适的蛋白洗脱液，获得pdb.his.mbp-cabyv-mp融合蛋白。

蛋白洗脱液1：含150mmnacl和200mm咪唑的ph8.0、20mm的tris-hcl缓冲液。

蛋白洗脱液2：含150mmnacl和500mm咪唑的ph8.0、20mm的tris-hcl缓冲液。

5、完成步骤4后，取过柱后溶液，用超滤离心管浓缩至1.5ml，得到浓缩蛋白液。

经检测，加入iptg诱导获得的cabyv-mp浓缩蛋白液中融合蛋白浓度约为1mg/ml。以下均采用加入iptg诱导获得的浓缩蛋白液(以下简称浓缩蛋白液)进行实验。

实施例3、多克隆抗体的制备

1、取浓缩蛋白液，加入生理盐水稀释至200-500μl，得到融合蛋白溶液。

2、将1体积份融合蛋白溶液(含400μg融合蛋白)和1体积份弗氏完全佐剂混合，乳化，得到混合液甲。将1体积份融合蛋白溶液(含200μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，乳化，得到混合液乙。

3、取体重为2kg左右的新西兰白兔1只，经背部皮下注射(8-10个点)混合液甲。

4、完成步骤3的第14d，经背部皮下注射(8-10个点)混合液乙。

5、完成步骤3的第24d，经背部皮下注射(8-10个点)混合液乙。

6、完成步骤3的第34d，经背部皮下注射(8-10个点)混合液乙。7、完成步骤3的第35d，对新西兰白兔的颈动脉采血，分离血清；该血清即为制备的多克隆抗体。具体为：用麻醉剂麻醉新西兰白兔(戊巴比妥钠，30mg/kg，静脉、腹腔、肌肉注射均可)，固定架固定，用手术器械剪开脖子外层皮毛，于气管侧面下方找到颈动脉，止血钳夹紧动脉管并剪断放血，收集；5,000rpm离心10min两次，收集血清。

上述步骤由北京华大蛋白质研发中心有限公司操作。

实施例4、多克隆抗体检测cabyv-mp

将瞬时表达cabyv-mp蛋白的本生烟叶片总蛋白进行sds-page和westernblot检测，采用实施例1中步骤三制备的多克隆抗体作为一抗检测cabyv。具体步骤如下：

1、提取瞬时表达cabyv-mp蛋白的本生烟叶片总蛋白。

2、完成步骤1后，将所述叶片总蛋白进行sds-page，然后用电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(200ma，90min)。

3、完成步骤2后，将所述硝酸纤维素膜置于含5％(w/v)脱脂奶粉的tbst缓冲液中，37℃封闭1h。

4、完成步骤3后，加入实施例1中步骤四制备的多克隆抗体的稀释液(1:1000稀释)，37℃孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，每次10min。

5、完成步骤4后，将所述硝酸纤维素膜置于ap标记的羊抗兔igg二抗工作液(1：20000稀释)，37℃孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，每次10min。

6、完成步骤5后，避光条件下，将所述硝酸纤维素膜置于含330μg/mlnbt和165μg/mlbcip的显色缓冲液中显色至条带清晰，用蒸馏水终止反应。

结果表明，实施例1中步骤三制备的多克隆抗体可以成功检测cabyv。

实施例5、多克隆抗体的效价测定

1.提取瞬时表达cabyv-mp蛋白的本生烟叶片和注射pmdc32空载体的本生烟叶片(作为阴性对照)的总蛋白。

2、取实施例1中步骤三制备的cabyv-mp多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数分别为1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、100000、128000、200000、256000、400000、500000、512000、800000、1000000和1600000。

3、将步骤1提取的总蛋白进行sds-page和westernblot，采用步骤2得到的稀释液作为一抗检测cabyv。

westernblot结果见图2中a。

4、提取瞬时表达cabyv-mp蛋白的本生烟叶片和注射pmdc32空载体的本生烟叶片(作为阴性对照)的总蛋白。

5、取实施例1中步骤三制备的cabyv-mp多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数分别为10000、20000、40000、60000、80000、100000、120000、140000、160000和180000。

6、将步骤4提取的总蛋白进行sds-page和westernblot，采用步骤5得到的稀释液作为一抗检测cabyv。

westernblot结果见图2中b。

结果表明，用瞬时表达cabyv的本生烟叶片检测多克隆抗体效价时，多克隆抗体稀释倍数达到1000000时仍可以检测到微弱的蛋白条带，多克隆抗体稀释倍数达到1600000则不能检测到目的条带，因此，实施例1中步骤四制备的cabyv-mp多克隆抗体的效价约为1：1000000。

用瞬时表达cabyv的本生烟叶片检测多克隆抗体的最佳适用范围，在1：10000～1:100000的范围内显色效果都较为明显。当稀释倍数达到100000时，从显色效果和经济角度，对cabyv侵染的本生烟检测较理想。

实施例6、多克隆抗体的灵敏度分析

1、取瞬时表达cabyv-mp蛋白的本生烟叶片0.1g，充分研磨后加入300μl2×sds蛋白上样缓冲液，得到蛋白样品1(1:4)。

2×sds蛋白上样缓冲液：含4％(w/v)sds、20％(v/v)甘油、0.2％(w/v)溴酚蓝、100mmtris-hcl(ph6.8)的缓冲液。

2、完成步骤1后，取蛋白样品1，2倍倍比稀释，得到稀释倍数分别为8、16、32、64、128、256、512和1024的蛋白样品。

3、另取蛋白样品1，将1体积份蛋白样品1和9体积份2×sds蛋白上样缓冲液混合，得到蛋白样品2(即稀释倍数10，1:40)

4.完成步骤3后，取蛋白样品2，2倍倍比稀释，得到稀释倍数分别为80、160、320和640的蛋白样品。

5、取实施例1中步骤三制备的cabyv-mp多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为1000、10000和20000。

6、将步骤2和步骤4得到的蛋白样品进行sds-page和westernblot，采用步骤5得到的稀释液作为一抗检测cabyv。

cabyv-mp的westernblot结果见图3。

结果表明，0.1g瞬时表达cabyv-mp的本生烟叶片的总蛋白在1:1000浓度条件下蛋白稀释128倍后反应呈阳性，在1:10000条件下蛋白稀释80倍呈阳性，在1：20000条件下蛋白稀释64倍呈阳性。

实施例7、多克隆抗体的特异性分析

待测叶片为瞬时表达cabyv-mp、mabyv-mp、sabyv-3flag-mp、bryv-3flag-mp、plrv-3flag-mp、scylv-3flag-mp和pmdc32空载体的本生烟叶片。

1、提取待测叶片的总蛋白。

2、取实施例1中步骤三制备的cabyv多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为1000、10000和20000。

3、将步骤1获得的总蛋白进行sds-page和westernblot，采用步骤2得到的稀释液作为一抗检测cabyv。westernblot结果见图4，只有瞬时表达cabyv的本生烟叶片的总蛋白在其对应的血清条件下反应呈阳性。结果表明实施例1中步骤三制备的多克隆抗体对cabyv具有较高的特异性，包括与能够混合侵染瓜类的mabyv、sabyv也不存在血清学交叉反应。

实施例8、多克隆抗体在病毒检测上的应用

一、多克隆抗体检测感染cabyv的本生烟叶片

待测叶片为接种cabyv侵染性cdna克隆的本生烟叶片和接种pcass-rz空载体(作为阴性对照)的本生烟叶片。

1、提取待测叶片的总蛋白。

2、取实施例1中步骤三制备的cabyv多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为10000。

3、将步骤1获得的总蛋白进行sds-page和westernblot，采用步骤2得到的稀释液作为一抗检测cabyv。westernblot结果见图5a，结果表明cabyv-mp多克隆抗血清能够特异性检测到本生烟叶片中的cabyv，并且与rt-pcr的检测结果一致。说明cabyv-mp抗血清适用于目前广泛应用的模式植物本生烟中cabyv的检测，具有较高的应用价值。

二、模拟天然寄主黄瓜感染cabyv的多克隆抗体检测

待测叶片为注射空载体pmdc32的本生烟叶片，瞬时表达cabyv-mp的本生烟叶片，健康的黄瓜叶片。

1、提取待测叶片的总蛋白。

2、用健康的天然寄主黄瓜进行cabyv侵染的模拟检测。按照1：4的比例提取在本生烟叶片瞬时表达的cabyv-mp蛋白，与分别按照1：4和1：8比例提取的健康黄瓜叶片的总蛋白进行混合稀释至6个梯度：1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256。以提取注射空载体pmdc32的本生烟叶片和健康的黄瓜叶片蛋白为阴性对照，以提取的瞬时表达cabyv-mp的本生烟叶片蛋白为阳性对照。

3、取实施例1中步骤三制备的cabyv多克隆抗体，加入tbst缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为10000。

4、将步骤1获得的总蛋白进行sds-page和westernblot，采用步骤2得到的稀释液作为一抗检测cabyv。westernblot结果见图5中b。

结果表明，在以1:4提取的黄瓜叶片总蛋白稀释浓度背景下，cabyv-mp多克隆抗血清能够检测到以1：256比例混合稀释的cabyv-mp蛋白，在以1:8提取的黄瓜叶片总蛋白稀释浓度背景下，cabyv-mp多克隆抗血清能够检测到以1：128比例混合稀释的cabyv-mp蛋白，并且健康黄瓜叶片的总蛋白不与该抗血清发生血清学反应，且不影响抗血清与cabyv-mp蛋白发生特异性反应，为该抗血清的田间检测应用以及制备检测cabyv及其运动蛋白的试剂盒提供理论依据。

此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种南瓜蚜传黄化病毒运动蛋白纯化表达方法及其多克隆抗体的制备

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6494

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcg60

cagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc120

ctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg180

gttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttc240

acgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt300

ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattc360

ttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattta420

acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttt480

tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgta540

tccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttat600

tcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaa660

actcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactc720

gtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga780

aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc840

agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaac900

cgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggac960

aattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatat1020

tttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcag1080

tggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggca1140

taaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctac1200

ctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg1260

tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca1320

tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacac1380

cccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaa1440

cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga1500

gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcg1560

gtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagc1620

agagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag1680

aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcc1740

agtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcg1800

cagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac1860

accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggaga1920

aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagctt1980

ccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgag2040

cgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg2100

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