一种工业大麻提取物的制备方法与流程

本发明涉及提取
技术领域：
，具体涉及一种富含大麻酚类化合物的工业大麻提取物的制备方法。
背景技术：
：大麻(学名：cannabissatival.)为大麻科、大麻属植物，俗称汉麻、线麻、火麻，种植历史悠久，具有重要的农用及药用价值，主要分布在云南、贵州、四川、广西、安徽等地，古代主要用于制作服装、造纸材料、绳索及油脂等。大麻中含有一种毒性成分四氢大麻酚(thc)可使人致幻成瘾，易被不法分子用来提炼毒品，危害社会，曾被多个国家在相当长时期内禁种。由于大麻的经济、药用价值极高，在20世纪80年代，有欧洲国家研究培育出低毒大麻品种并获得推广种植。20世纪90年代，欧盟依据大麻花叶中thc含量的高低，将大麻分为药用型(thc＞0.5％)、中间型(0.3％＜thc＜0.5％)和纤维性(thc＜0.3％)。其中纤维性毒性低，专供工业用途，简称为“工业大麻”，其生长期大麻花叶中的thc含量小于千分之三，不具毒品利用价值，可以合法进行规模化种植与工业化开发利用。鉴于工业大麻的价值较高，我国已在多个省份逐渐解除对工业大麻的限制，并在多部门共同监管下，种植、开发工业大麻。工业大麻浑身是宝，其中大麻酚类化合物具有极高的药用价值。目前，人们已从大麻植株中分离出八十余种大麻酚类化合物。大麻酚类化合物是一类萜烯酚类化合物，其中主要有大麻二酚(cbd)、次大麻二酚(cbdv)、大麻酚(cbn)、大麻萜酚(cbg)、大麻环萜酚(cbc)、thc、δ9-四氢化次大麻酚(thcv)等。这些大麻酚类化合物已被证实具有很强的药理活性，如，cbd不具有神经毒性，其能阻碍thc对人体神经系统的影响，并具有明显的抗痉挛、抗风湿性关节炎、抗焦虑等药理活性，具有巨大产业开发价值；cbd和thcv可影响脂质和糖代谢，可能成为控制2型糖尿病患者血糖的新选择等，cbdv具有较好的抗癫痫活性，同时有研究表明cbdv可减轻恶心症状，有助于治疗胃肠问题，并且这些大麻酚类化合物的联合应用效果更强。大麻酚类化合物中，cbd、cbdv、cbg、cbda等为非精神类活性成分，cbn、thc等为精神活性成分。目前，对非精神活性大麻酚类化合物提取制备的研究相对较少，而且非精神活性成分与精神活性成分结构相似，难以去除。现有技术大多是提取工业大麻中大麻二酚单体，未综合考虑其他大麻酚类化合物。专利申请cn106860492a和cn109568389a公开了大麻酚类化合物的提取制备方法，但其工艺繁琐，所用试剂为二类试剂，有一定毒害性，会对实验人员及环境造成伤害。技术实现要素：为克服现有技术的不足，本发明提供一种富含大麻酚类化合物cbdv、cbg和cbd的工业大麻提取物的制备方法。上述制备方法包括如下步骤：(1)将大麻药材粉末利用水-有机试剂混合溶剂ⅰ提取，得提取液，浓缩，得浓缩浸膏；(2)将步骤(1)所得浸膏加入纯化水，保温搅拌溶解，冷却至室温后，通过加入盐溶解然后静置分层或通过离心分层，分离上层清液，得粗提物；(3)将步骤(2)所得粗提物溶解，脱色，过滤，得脱色溶液，浓缩，得浓缩浸膏；(4)将步骤(3)所得浸膏溶解，进行柱层析，用水-有机试剂混合溶剂ⅱ洗脱，收集大麻酚类化合物成分的洗脱液。任选地，(5)将步骤(4)所得洗脱液浓缩，得浓缩浸膏。进一步地，上述大麻酚类化合物包括cbdv、cbg和cbd等。更进一步地，上述大麻酚类化合物还包括thcv。进一步地，上述大麻为工业大麻。进一步地，步骤(1)中，大麻药材选自：大麻叶、大麻花、大麻根、大麻秆芯和大麻籽粕中的一种或两种以上任意比例的组合；优选地，该大麻药材为大麻花和/或大麻叶；进一步优选地，该大麻花和/或大麻叶采用盛花期的大麻花和/或大麻叶。进一步地，步骤(1)中，大麻药材粉末的粒度为将大麻药材粉碎后过1号筛所得粉末；更进一步地，大麻药材粉末的粒度为将大麻药材粉碎后过3号筛所得粉末。进一步地，步骤(1)中，大麻药材粉末为烘烤后的大麻药材粉末。再进一步地，上述烘烤温度为100-200℃。再进一步地，上述烘烤时间为60-200min。进一步地，步骤(1)中，水-有机溶剂混合溶剂ⅰ中的有机溶剂选自：甲醇、乙醇和丙酮中的一种或两种以上任意比例的组合；在本发明的一个实施例中，该有机溶剂为乙醇。进一步地，步骤(1)中，水-有机溶剂混合溶剂ⅰ中有机溶剂的浓度为70％-99％(具体如70％、80％、85％、90％、95％、99％)。在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所用混合溶剂为浓度90-99％的乙醇水溶液。进一步地，步骤(1)中，大麻药材粉末与水-有机试剂混合溶剂ⅰ的料液比为1:5-1:15(具体如1:5、1:8、1:10、1:12、1:15，w/v)。进一步地，步骤(1)中的提取方法选自：冷浸法、超声提取法、回流提取法和浸漉法中的一种或两种以上的组合；在本发明的一个实施例中，该提取方法为冷浸法。进一步地，步骤(1)中，提取次数为1-5次，每次提取时间可为0.5-2小时。进一步地，步骤(1)中，浓缩为减压浓缩，浓缩压力为-0.08～-0.09mpa。进一步地，步骤(1)中，浓缩温度为55-75℃(具体如55、60、65、70、75℃)。在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：将大麻药材进行粉碎，烘烤，加入水-有机试剂混合溶剂，搅拌提取，得提取液，将该提取液离心过滤，得滤液，将该滤液进行浓缩，得浓缩浸膏。进一步地，步骤(2)中，纯化水的用量为大麻药材粉末当量1-3倍。进一步地，步骤(2)中，保温温度为55-95℃(具体如55、60、65、70、75、80、85、90、95℃)。进一步地，步骤(2)中，保温搅拌时间为0.5-3h(具体如0.5、1、2、3h)。进一步地，步骤(2)中，盐为强碱盐，其强碱离子如li+、na+，k+，ca2+等，酸根离子如：碳酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫酸氢根、枸橼酸根、酒石酸根、苹果酸根、抗坏血酸根、甲磺酸根、草酸根、卤离子等；具体地，该盐可选自：碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸氢钠、枸橼酸钠、酒石酸钠、苹果酸钠、抗坏血酸钠、甲磺酸钠、草酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、硫酸氢钾、枸橼酸钾、酒石酸钾、苹果酸钾、抗坏血酸钾、甲磺酸钾、草酸钾、氯化锂、溴化锂、碘化锂、氯化钠、溴化钠、碘化钠、氯化钾、溴化钾、碘化钾中的一种或两种以上的组合。进一步地，步骤(2)中，加盐后静置时间为2-6h(具体如2、3、4、5、6h)。进一步地，步骤(2)中，离心的方式选自：蝶式离心、管式离心中一种或两者串联使用。进一步地，步骤(3)中，将步骤(2)所得粗提物溶解所用溶剂为水-有机溶剂混合溶剂ⅲ，其中有机溶剂选自：甲醇、乙醇和丙酮中的一种或两种以上任意比例的组合；在本发明的一个实施例中，该有机溶剂为乙醇。再进一步地，上述水-有机溶剂混合溶剂ⅲ中有机溶剂的浓度为70％-95％(具体如70％、75％、80％、85％、90％、95％)。在本发明的一个实施例中，将步骤(2)所得粗提物溶解所用溶剂为95％乙醇水溶液。进一步地，步骤(3)中，上述溶剂的用量为大麻药材粉末当量的1-5倍(具体如1、2、3、4、5倍)。进一步地，步骤(3)中，脱色所用脱色剂选自：活性炭、硅藻土、活性白土、脱色砂、滑石粉和纸浆中一种或两种以上的组合。进一步地，步骤(3)中，脱色所用脱色剂的质量为大麻药材粉末的0.01-0.10倍(具体如0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10)。进一步地，步骤(3)中，脱色的温度为5-60℃(具体如5、10、20、25、30、40、50、60℃)；在本发明的一个实施例中，脱色温度为室温。进一步地，步骤(3)中，脱色的时间为30-60min(具体如30、40、50、60min)。进一步地，步骤(4)中，将步骤(3)所得浸膏溶解所用溶剂为水-有机溶剂混合溶剂ⅳ，其中有机溶剂选自：甲醇、乙醇和丙酮中的一种或两种以上任意比例的组合；在本发明的一个实施例中，该有机溶剂为乙醇。再进一步地，上述水-有机溶剂混合溶剂ⅳ中有机溶剂的浓度为70％-95％(具体如70％、75％、80％、85％、90％、95％)。在本发明的一个实施例中，将步骤(3)所得粗提物溶解所用溶剂为95％乙醇水溶液。进一步地，步骤(4)中，上述溶剂的用量为大麻药材粉末当量的0.05-0.20倍(具体如0.05、0.08、0.10、0.15、0.20倍)。进一步地，步骤(4)中，柱层析所用填料选自：键合硅胶(如十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶)、聚合填料、硅胶中的一种或两种以上的组合；在本发明的一个实施例中，该填料为十八烷基硅烷键合硅胶。进一步地，步骤(4)中，柱层析所用填料的粒径为10-100μm(具体如10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100μm)。进一步地，步骤(4)中，柱层析所用层析柱的径高比为3:2-3:12。进一步地，步骤(4)中，水-有机溶剂混合溶剂ⅱ中的有机溶剂选自：甲醇、乙醇和丙酮中的一种或两种以上任意比例的组合；在本发明的一个实施例中，该有机溶剂为乙醇。进一步地，步骤(4)中，水-有机溶剂混合溶剂ⅱ中的有机溶剂的浓度为70％-95％(具体如70％、75％、80％、85％、90％、95％)。在本发明的一个实施例中，上述水-有机溶剂混合溶剂ⅱ为浓度为70-95％的乙醇水溶液。进一步地，步骤(4)中，洗脱流速为2-5bv/h(具体如2、3、4、5bv/h)。进一步地，步骤(5)中，浓缩为减压浓缩。本发明还提供上述方法所制备的工业大麻提取物，其富含大麻酚类化合物cbdv、cbg和cbd，特别是其中上述大麻酚类化合物的总含量可高达80％以上，转移率可高达99％以上。本发明还提供上述工业大麻提取物及其制备方法在制备药物、医疗美容产品和化妆品中的应用。本发明还提供一种包含本发明上述工业大麻提取物的药物、医疗美容产品和化妆品。本发明采用加盐和离心的方式富集大麻酚类化合物，一步即可完全去除水溶性杂质，避免应用常规的水沉工艺或应用大孔树脂去水溶性杂质时引入的甲苯、二甲苯等溶剂残留，极大地节省了生产成本和质量控制成本，且可完全排除精神活性成分thc，工艺中仅用到纯化水和毒性很低的三类有机试剂，试剂环保，工艺操作简单，仪器设备易得，可以降低成本，减少污染，利于工业化生产。本发明制备的工业大麻提取物富含大麻酚类化合物cbdv、cbg和cbd，特别是上述大麻酚类化合物的总含量可高达80％以上，转移率可高达99％以上。附图说明图1所示为空白对照(95％乙醇)的液相色谱图。图2所示为大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)对照品的液相色谱图。图3所示为实施例1上样液中大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)的液相色谱图。图4所示为实施例1得到的大麻提取物中大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)的液相色谱图。图5所示为实施例2上样液中大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)的液相色谱图。图6所示为实施例2得到的大麻提取物中大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)的液相色谱图。具体实施方式除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及
技术领域：
的技术人员通常理解的相同的含义。本发明中所述的“大麻提取物”是指从大麻提取部位(如大麻花和/或叶)的原料中提取得到的产品，其可为液体或固体形式，其中包含至少一种大麻酚类化合物，优选地，包含cbd、cbdv、cbg和thcv，特别地，不含thc。除非特别说明，本发明中所述的“含量”一般为质量含量，例如，在提取物中cbdv的含量为x％，是指：在提取物中，cbdv的质量占提取物总质量的x％。本发明中所述的“x倍药材当量”等描述，是指采用的溶剂如纯化水、乙醇溶液等的体积是药材质量的x倍，具体地，如“1倍药材当量”，如药材质量为1g，所用溶剂的用量为1ml。为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案做进一步完整地描述。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，不构成对本发明保护范围的限定，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面实施例和对比例中样品检测分析采用高效液相色谱法，具体方法如下：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相a，以0.1％甲酸乙腈为流动相b，按表1的洗脱程序洗脱；检测波长为220nm。理论板数按cbd峰计算应不低于5000。表1洗脱程序time/mina(0.1％甲酸水溶液)b(0.1％甲酸乙腈)030％70％630％70％1223％77％2223％77％22.230％70％2630％70％对照品溶液的制备：精密称取cbd对照品，加甲醇制成0.15mg/ml的对照品溶液，即得；精密称取cbdv对照品，加甲醇制成0.01mg/ml的对照品溶液，即得；精密称取thcv对照品，加甲醇制成0.01mg/ml的对照品溶液，即得；精密称取cbg对照品，加甲醇制成0.01mg/ml的对照品溶液，即得；精密称取四氢大麻酚对照品，加甲醇制成0.01mg/ml的对照品溶液，即得。供试品溶液的制备：取样品溶液1.1ml，加甲醇定容至25ml，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。图1所示为空白对照(95％乙醇)液相色谱图，图2所示为大麻酚类化合物(cbdv、cbg、cbd、thcv、thc)对照品的液相色谱图，其中，各大麻酚类化合物的保留时间分别为：cbdv：5.680min；cbg：9.055min；cbd：9.590min；thcv：10.363min；thc：16.976min。实施例1(1)将工业大麻花叶药材进行粉碎，过1号筛，100℃烘烤200min，取一定量烘烤后的大麻花叶药材，按料液比1:8(w/v)加入95％乙醇，室温搅拌提取两次，每次1小时，过滤，合并提取液，离心过滤，离心过滤液减压浓缩(65℃，-0.08～-0.09mpa)至浸膏，加入药材当量3倍的纯化水，在75℃下保温搅拌30分钟，置分液罐中冷却至室温，加入碳酸钠搅拌溶解后，室温静置3h，分离上层，即得大麻粗提物。(2)将所得大麻粗提物用药材当量3倍量的95％乙醇搅拌溶解，加入药材当量的0.05倍活性炭，室温搅拌40分钟，然后过滤，滤液混匀后浓缩至浸膏，加入药材当量的0.1倍的95％乙醇进行溶解，得上样液，通过高效液相色谱法对其进行分析，色谱图如图3所示。上样进行柱层析，层析填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为30μm，用75％乙醇为流动相，流速为4bv/h进行洗脱，收集第1到第2.5倍柱体积馏分，减压浓缩至稠膏，即得富含大麻酚类化合物的提取物，通过高效液相色谱法对其进行分析，色谱图如图4所示。其中，大麻酚类化合物总含量为80.6％，其中cbdv含量为10.99％、cbg含量为1.42％、cbd含量为66.38％、thcv含量为1.81％，thc未检出。实施例2(1)将工业大麻花叶药材进行粉碎，过3号筛，200℃烘烤60min，取一定量烘烤后的大麻花叶药材，按料液比1:10(w/v)加入90％乙醇，室温搅拌提取两次，每次1小时，过滤，合并提取液，离心过滤，离心过滤液减压浓缩(65℃，-0.08～-0.09mpa)至浸膏，加入药材当量2倍量纯化水，在70℃下保温旋转30分钟，将转溶溶液进行蝶式离心分层，转速为5000转/分钟，分离上层，即得大麻粗提物。(2)将所得大麻粗提物用药材当量3倍量的95％乙醇搅拌溶解，加入药材当量的0.05倍硅藻土，室温搅拌30分钟，然后过滤，滤液混匀后浓缩至浸膏，加入药材当量的0.08倍的95％乙醇进行溶解，得上样液，通过高效液相色谱法对其进行分析，色谱图如图5所示。上样进行柱层析，层析填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为75μm，用70％乙醇为流动相，流速为3bv/h进行等度洗脱，收集第0.5到第2倍柱体积馏分，减压浓缩至稠膏，即得富含大麻酚类化合物的提取物，通过高效液相色谱法对其进行分析，色谱图如图6所示。其中，大麻酚类化合物总含量为76.8％，其中cbdv含量为10.47％、cbg含量为1.28％、cbd含量为63.34％、thcv含量为1.71％，thc未检出。对比例1参照实施例1步骤(1)中的提取、浓缩步骤和参数，由相同重量的大麻花叶进行提取、浓缩，将浸膏加入药材当量6倍量的纯化水，搅拌混悬，于12℃以下静置分层8小时，收集下层沉淀，即得大麻粗提物。对比例2参照实施例2步骤(1)中的提取、浓缩步骤和参数，由相同重量的大麻花叶进行提取、浓缩，将浸膏加入药材当量4倍量的纯化水，混悬，经大孔树脂纯化，先用纯化水洗脱除去水溶性杂质，再用90％乙醇洗脱，浓缩后，即得大麻粗提物。分别检测实施例1-2和对比例1-2所制备的粗提物中大麻酚类化合物的总含量和转移率。检测结果如表2所示。表2不同粗分离方法效果对比序号粗分离温度粗分离时间(h)总含量转移率实施例1室温323.25％99.87％实施例2室温0.523.89％99.56％对比例1＜12℃818.56％87.17％对比例2室温623.12％88.45％对比例3参照实施例1步骤(2)中的脱色、浓缩、溶解和柱层析步骤和参数，由相同重量的大麻花叶粗提物(实施例1步骤(1)制备)，经脱色处理，浓缩，浸膏用95％乙醇溶解，得上样液，进行柱层析，层析填料为十八烷基硅烷键合硅胶，用65％甲醇水溶液洗脱，收集除thc外的其他大麻酚类化合物的馏分，合并，浓缩，即得大麻提取物成品。对比例4参照实施例2步骤(2)中的脱色、浓缩、溶解和柱层析步骤和参数，由相同重量的大麻花叶粗提物(实施例2步骤(1)制备)，经脱色处理，浓缩，浸膏用95％乙醇溶解，得上样液，进行柱层析，层析填料为十八烷基硅烷键合硅胶，用55％乙腈水溶液洗脱，收集除thc外的其他大麻酚类化合物的馏分，合并，浓缩，即得大麻提取物成品。分别检测实施例1-2和对比例3-4所制备的提取物中大麻酚类化合物的总含量和转移率。检测结果如表2所示。表3不同分离纯化方法效果对比序号柱层析填料和洗脱剂总含量转移率thc含量实施例1十八烷基硅烷键合硅胶；75％乙醇80.60％92.54％未检出实施例2十八烷基硅烷键合硅胶；70％乙醇76.80％88.18％未检出对比例3十八烷基硅烷键合硅胶；65％甲醇69.44％85.70％未检出对比例4十八烷基硅烷键合硅胶；55％乙腈68.32％84.47％未检出以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12