本发明属于兽医生物制品
技术领域：
，具体涉及一种水貂肺炎克雷伯氏菌及其应用。
背景技术：
：水貂是一种主要用于生产皮毛的特种养殖，水貂皮以皮板轻薄、柔韧结实而著称，是制作衣服、衣领、帽子、袖口和饰口的主要原料皮。从水貂皮的品质和价值看，其利用率也高于狐、貉皮等大毛细皮，尤其是国内市场潜力很大。而狐、貉皮等大毛细皮，由于毛绒较水貂皮粗长，不及水貂皮华丽，国内市场不适合制大衣，而只适合制作衣领、袖口、披肩等饰品，故利用率较水貂皮低。但近几年随着水貂价格的增长，养殖量越来越大，养殖密度不断增加，使得疾病不断增加。这其中以水貂出血性肺炎对水貂养殖的危害最大。水貂出血性肺炎症主要发生在秋季夏毛脱落时。水貂脱掉夏毛时，脱下的毛在场内四处飞扬，黏附于毛上的细菌随时可污染饲料和饮水而发生感染。水貂出血性肺炎症状主要呈现急性发作，常无症状死亡，病死水貂口鼻有血样泡沫流出。呼吸困难，出血性肺炎变化和肺水肿，脏器组织出血性病理变化，胃肠道黏膜溃疡，个别水貂眼部分泌物增多，有的爪子肿大，常呈地方性流行。给养殖户造成了较大的经济损失。水貂出血性肺炎发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用会导致克致病菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防。目前各国在水貂出血性肺炎的预防中多以菌体灭活疫苗产品为主，将流行血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种水貂肺炎克雷伯氏菌及其应用，所提供的克雷伯氏菌为一种发生变异的新型菌株，其所制备的疫苗能对水貂提供更全面的防护，从而弥补现有技术的不足。本发明提供的肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapeneumoniae)sd-1株，于2019年6月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：17901；本发明所提供的肺炎克雷伯氏菌sd-1株用于制备疫苗；所述的疫苗，优选的形式为灭活疫苗；本发明另一个方面提供一种灭活疫苗，其中包含有灭活的抗原和疫苗佐剂，其中灭活的抗原为灭活的肺炎克雷伯氏菌(klebsiellasp.)sd-1株；所述的疫苗佐剂，为水性疫苗佐剂；更具体的，为氢氧化铝胶。本发明所提供的肺炎克雷伯氏菌是从注射了疫苗后发病死亡的水貂中筛选获得的，该菌株相比于目前的克雷伯氏菌产生了变异，为一新型的发生变异的致病株。使用该菌来制备疫苗，从而对水貂提供更完善的免疫保护。具体实施方式本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual，3nded.(sambrook,2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。实施例1：菌株的分离纯化及理化性质分析2018年在青岛某一水貂养殖场养殖的水貂中出现了出血性肺炎的症状，但发病群体之前已经免疫注射过正式上市的水貂出血性肺炎绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌病、肺炎克雷伯杆菌病三联灭活疫苗。1)取死亡的水貂，用手术刀无菌打开病死水貂的胸腔和腹腔；剪开病死水貂的肝脏，充分暴露其内部组织；用无菌棉签蘸取肝脏内容物后，用生理盐水进行梯度稀释，在lb固体琼脂培养基上做划线，将划上细菌的培养皿在37℃恒温培养10-12h后；选取单菌落；将每个单菌落在尿路菌群显色培养基上进行培养；2)将在显色培养基上，显示不同颜色的菌株，每3个显示不同颜色的作为一组接种到lb液体培养基进行扩大培养后，4000rpm离心收集菌体；将菌体用0.5％无菌生理盐水重悬，利用比浊法将菌株的细菌浓度定为1×107cfu/ml，用于注射感染。4)取已经使用水貂出血性肺炎、多杀性巴氏杆菌病、肺炎克雷伯杆菌病三联灭活疫苗免疫的健康水貂进行注射感染实验；腹腔注射0.2ml不同待筛选菌株组合的菌悬液，对照组注射同体积的0.5％无菌生理盐水。对于出现发病状况的水貂，对应的带选菌的组合的三株单菌落，分别再单独进行注射感染。最终筛选到了一株在尿路菌群显色培养基上生长为蓝色菌落的菌株，注射感染表明其会导致已注射过水貂出血性肺炎疫苗的水貂出现出血性肺炎的症状。所分离的菌株在血清lb琼脂培养基上可形成圆形隆起菌落，呈灰白色；革兰氏染色为阴性。采用细菌基因组dna提取试剂盒提取细菌的dna，应用16srrna细菌鉴定引物进行pcr扩增，经电泳、回收、克隆、测序。并对测序结果进行分析。将pcr扩增产物送测序公司进行测序，经ncbi序列比对后，16srrna序列与克雷伯氏菌的同源性最高；疑似该菌株为克雷伯氏菌属。由于khe基因可以作为鉴定肺炎克雷伯氏菌的靶标基因，使用扩增khe基因的引物对来对所筛选的菌株的基因组dna进行检测；其中引物对的序列信息如下：上游引物：5′-tgattgcattcgccactgg-3′、下游引物：5′-ggtcaacccaacgatcctg-3′、扩增结果证实在菌株株中出现了阳性片段，与16srrna相符，证实所筛选的菌株为肺炎克雷伯氏菌，命名为sd-1株。考虑到sd-1株会使已注射了相对应该疫苗的水貂产生病变，为了验证sd-1株的致病基因是否产生了突变，对肺炎克雷伯氏菌sd-1株与致病相关的rmpa基因、uge基因、maga基因、wabg基因、荚膜多糖k2基因；以及进行扩增测序。采用easypurequickgelextractionkit回收pcr产物，连接于peasy-bluntcloningvector或pmd18-tvector(promega)转化trans-5α感受态细胞，经鉴定后测序；利用dnaman软件推导氨基酸序列。将测得的致病相关基因片段分别于与genbank上已发表的肺炎克雷伯氏菌序列进行氨基酸的同源性比对。结果表明，与致病相关的uge基因、maga基因、wabg基因在氨基酸水平上多处突变,其中rmpa基因的核苷酸序列为seqidno:1,氨基酸序列为seqidno:2；与已报到的相比，氨基酸同源性仅为70％，可能就是已有的克雷伯氏菌基因免疫效果不佳的原因所在。actgggctacctctgcttaacaagacatttgaagcagtaattaataaatcaatattgatgaagcacaaaaaaaacataagagtattggctgactgcgggtttttttattcatccacatggagagggtacaaaatgttaagatccacattacatatgataagccaatggacacggcttcatgtttcggggggggggcggtttcacctttgcagcaggtgtgcttattacctttatgttaaaatgcaagatccactaaaaagtattggctcaaaactatatcttgcactctcaaagaaaaatgtactgggaattgtaaaacattatcctcggctaacaaaaaaagaacaatggatgctgcaa(seqidno:1)tglpllnktfeavinksilmkhkknirvladcgffysstwrgykmlrstlhmisqwtrlhvsgggrfhlcsrcayylyvkmqdplksigsklylalskknvlgivkhyprltkkeqwmlq(seqidno:2)。实施例2：sd-1株的致病效果检测首先将肺炎克雷伯氏菌sd-1株划线接种到lb固体平板培养基上，37℃培养24小时；然后挑选单个菌落到接种到lb液体培养基，37℃通气搅拌培养24h后，4000rpm离心10min后收集沉淀，沉淀用灭菌生理盐水进行重悬，菌悬液进行活菌计数，准备进行动物注射感染实验。选取30-40日龄的健康易感水貂20头，随机分为4组，每组5头。将肺炎克雷伯氏菌sd-1株的发酵菌液稀释为1.0×106cfu、4.0×106cfu/ml、6.0×106cfu/ml三种不同的梯度，接种5头试验貂2.0ml/只，另外1组注射灭菌生理盐水2.0ml作为对照。观察7-20天，记录临床发病情况。结果表明菌液注射组大部分水貂出现体温升高、食欲减退，腹式呼吸，咳血或鼻孔流出红色泡沫性液体等水貂出血性肺炎临床症状，并导致死亡；而对照组水貂的体温无明显变化，亦无临床症状和死亡(表1)。表1：肺炎克雷伯氏菌sd-1株的感染能力上述结果表明，肺炎克雷伯氏菌sd-1株能使30～40日龄的健康易感貂5/5发病的最小发病量为4.0×106cfu/ml；表明本发明所筛选的菌株具有强的致病性。实施例3：使用肺炎克雷伯氏菌sd-1株制备疫苗1、制备灭活疫苗：首先将肺炎克雷伯氏菌sd-1株划线接种到lb固体平板培养基上，37℃培养24小时；然后挑选单个菌落到接种到lb液体培养基，37℃通气搅拌培养24h后，按菌液总量0.1％加入甲醛溶液，灭活24小时，期间搅拌3次；获得灭活菌液加入体积百分比为30％的氢氧化铝胶进行配苗；按此方法制备3批疫苗。疫苗灭活检验：将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊，表明制备的疫苗符合要求。制备的疫苗按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42页进行检验，无细菌生长。将制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量三种注射量来后肢内侧肌肉接注射健康水貂，在免疫10天后，免疫的水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身免疫不良反应，且免疫的水貂进食正常，说明疫苗对水貂具有安全性。2、疫苗的免疫效果将2-3月龄的健康水貂随机分成六组，每组10只；其中疫苗注射组共40只，对照组20只水貂。疫苗注射第一组20只后肢内侧肌肉接种注射实施例2所制备的5×107cfu/ml的水貂克雷伯氏菌灭活疫苗0.2ml；疫苗注射第二组另外20只注射市售的水貂出血性肺炎三联灭活疫苗，对照组只注射生理盐水。在免疫30d后，分别使用肺炎克雷伯氏菌d的标准菌株cmcc(b)46117和atcc13883肺炎克雷伯氏菌混合菌，以及sd-1株进行感染实验。实验组和对照组肌肉接种注射感染的细菌，并饲养观察7天，记录各组试验水貂的发病和死亡情况。实验结果如表1和表2所示。表1：使用cmcc(b)46117和atcc13883肺炎克雷伯氏菌混合菌进行感染的疫苗免疫效果数据表组别攻毒数量(只)存活数量(只)存活率(％)疫苗组110990疫苗组21010100对照组10330表2：qdndsd-1株进行感染的疫苗免疫效果数据表组别攻毒数量(只)存活数量(只)存活率(％)疫苗组11010100疫苗组210660对照组10220上述感染实验结果表明，本发明的sd-1株制备的灭活疫苗能对sd-1株的感染提供完全的保护，该组实验动物未表现任何临床症状，也无死亡现象，而现有的疫苗只能对sd-1株的感染提供部分保护。因此，已有的水貂克雷伯氏菌制备的疫苗对本发明所筛选的水貂克雷伯氏菌sd-1株的交叉保护性不够，需要与qdndsd-1株来制备联苗，从而提供更完全的保护。序列表<110>青岛农业大学<120>一种水貂肺炎克雷伯氏菌及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1actgggctacctctgcttaacaagacatttgaagcagtaattaataaatcaatattgatg60aagcacaaaaaaaacataagagtattggctgactgcgggtttttttattcatccacatgg120agagggtacaaaatgttaagatccacattacatatgataagccaatggacacggcttcat180gtttcggggggggggcggtttcacctttgcagcaggtgtgcttattacctttatgttaaa240atgcaagatccactaaaaagtattggctcaaaactatatcttgcactctcaaagaaaaat300gtactgggaattgtaaaacattatcctcggctaacaaaaaaagaacaatggatgctgcaa360<210>2<211>120<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2thrglyleuproleuleuasnlysthrpheglualavalileasnlys151015serileleumetlyshislyslysasnileargvalleualaaspcys202530glyphephetyrserserthrtrpargglytyrlysmetleuargser354045thrleuhismetileserglntrpthrargleuhisvalserglygly505560glyargphehisleucysserargcysalatyrtyrleutyrvallys65707580metglnaspproleulysserileglyserlysleutyrleualaleu859095serlyslysasnvalleuglyilevallyshistyrproargleuthr100105110lyslysgluglntrpmetleugln115120当前第1页12