一种用于检测miRNA的水凝胶的制备方法及应用与流程

本发明涉及水凝胶制备与图像处理技术，尤其是一种用于检测mirna的水凝胶的制备方法及应用。

背景技术：

mirna是存在于人体的一类微小rna，有关mirna在癌症中的功能已经有大量的文献研究，多项研究表明在人类外周血也存在mirna，并且多种癌症患者的外周血mirna表达谱发生特异性改变越来越多证据表明循环mirna可作为一种新颖的分子标志物应用于癌症诊断和预后评估.传统的基于mirna的检测如基因测序、荧光定量pcr等，但是这些检测方式毫无例外都需要大型的仪器配合，不仅费时、费力，而且只适合医院等一些检测机构，无法造福于每个家庭以实现便携、惠民大众化。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于检测mirna的水凝胶的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种基于水凝胶的mirna检测技术。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于检测mirna的水凝胶的制备方法，具体步骤如下：

1)透光掩模版的图案设计：掩膜板直径为30mm、厚度为1mm；

2)停止流动光刻平台的搭建；

3)水凝胶检测；

4)制备连接有mirna适配体的水凝胶微粒。

优选的，上述用于检测mirna的水凝胶的制备方法，所述步骤1)透光掩模版的图案设计，具体步骤如下：使用l-edit软件，选定直径为30mm的区域作为工作区域，在此工作区域的中心位置选取长为5-7mm、宽为3-5mm的区域做另一图层，然后用工作区域减去此图层便得到中心区域为长方形的掩膜板，另外利用此种方法继续合成长方形、正方形、圆形或三角形。

优选的，上述用于检测mirna的水凝胶的制备方法，所述步骤2)停止流动光刻平台的搭建，具体步骤如下：

(1)将上述掩膜板置于显微镜的光路中，调整好角度与聚焦位置；

(2)将pdms芯片(高60μm，长1cm)分别载气通道的两端打孔，一端为进样孔，一段为出样孔；

(3)将紫外光源连入显微镜的光路中调整焦距使光源聚焦到通道中，调整目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为40×。

优选的，上述用于检测mirna的水凝胶的制备方法，所述步骤4)制备连接有mirna适配体的水凝胶微粒，具体步骤如下：

(1)制备预聚物溶液：将3.5毫升peg-da700液体，2毫升peg200液体，0.5ml光引发剂darocur1173液体与4毫升的3×te缓冲液混匀，做为预聚物溶液待用；

(2)将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为500-1000μm/min；

(3)开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光50-100ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；

(4)将收集到的颗粒用1×tet缓冲液清洗数次，最后重悬于300-1000μl的1×tet缓冲液中，4℃保存待用。

优选的，上述用于检测mirna的水凝胶的制备方法，所述步骤4)(3)中利用紫外光固化合成mirna适配体(以mirna21为例)的水凝胶微粒的长宽比为(50-100)μm×(30-50)μm。

一种基于水凝胶的mirna检测技术，是基于水凝胶颗粒的mirna检测，通过改变掩膜板的形状控制透光的形状可以实现不同形状的水凝胶，实现不同的编码模式，结合图像处理以识别不同的形状达到混检多检的目的。

优选的，上述基于水凝胶的mirna检测技术，具体应用方法是：

(1)取50微升的水凝胶颗粒加入50微升的tet(含700毫摩尔每升的氯化钠)；

(2)取5微升(10-1000amol)的待检mirna于95微升的tebuffer中(含500毫摩尔每升的氯化钠)；

(3)将上述两溶液混起来于金属浴中90分钟(55℃，1500r/min)；

(4)将反应液于tet中清洗三次；

(5)900r/min离心3分钟后加入取下部液体100微升，加入245μl的杂交缓冲液(900tet、0.031克nacl、100微升nebbuffer、2微升atp、0.33微升通用连接子、1.88微升t4dna连接酶)；

(6)金属浴中30分钟(21.5℃、1500r/min)；

(7)加入5μl稀释100倍的sape(与亲和素连接的藻红蛋白)。

本发明结构有如下有益效果：

上述用于检测mirna的水凝胶的制备方法，水凝胶微粒制备过程简易，并且将微粒制备与适配体连接一步完成，缩短了检测所需的准备时间；可以精准控制合成微粒的形状与图案，以实现多种mirna混检时的图形编码功能；实现疾病初检的大众化。

所述制备方法是一种批量生产水凝胶的技术，使用停止流动光刻的方法，并通过改变掩膜板的形状来改变合成的水凝胶的形状以达到不同的形状代表不同的mirna.用图形编码的技术代替传统的荧光编码，使得编码容量大大提高，并且不需要额外的光源装置进行激发，通过图像处理的方式对不同形状的水凝胶进行识别解决了传统检测方法的费时，费力费用又高的弊端，同时图像的处理与手机端app进行结合，实现了检测智能化便携化，使用户足不出户便可实现对癌症的预防与检测，在疾病检测领域有重要的意义。

附图说明

图1：利用停止流动光刻方法制备的水凝胶微粒显微镜明场照片。

图2：利用停止流动光刻方法制备的水凝胶与不同浓度待检物反应后的图。

图3：非待检物加入后水凝胶颗粒荧光场(对照)图。

具体实施方式

实施例1

用于mirna的检测的水凝胶制备,具体步骤如下：

1)透光掩模版的图案设计的设计方法：使用l-edit软件，选定直径为30mm的区域作为工作区域，在此工作区域的中心位置我们选取长为5mm、宽为3mm的区域做另一图层，然后用工作区域减去此图层便得到中心区域为长方形的掩膜板。

2)停止流动光刻平台的搭建：将上述掩膜板置于显微镜的光路中，调整好角度与聚焦位置。将pdms芯片(高60μm，长1cm)分别载气通道的两端打孔，一端为进样孔，一段为出样孔。将紫外光源连入显微镜的光路中调整焦距使光源聚焦到通道中，调整目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为40×。

3)水凝胶检测:将水凝胶注入芯片中，将紫外光引入上述调节好的光路中。调节粗细准焦螺旋，直到可以看到目的形状水凝胶(图1左)。

4)连接有mirna适配体的水凝胶微粒的制备：将捕获目标mirna的商业化探针(购自上海生工)按1：100混合于水凝胶溶液中，按3)的方法照射即可得到水凝胶颗粒(图1左)。

实施例2

用于mirna的检测的水凝胶制备,具体步骤如下：

1)透光掩模版的图案设计的设计方法：使用l-edit软件，选定直径为30mm的区域作为工作区域，在此工作区域的中心位置我们选取长为3mm、宽为3mm的区域做另一图层，然后用工作区域减去此图层便得到中心区域为正方形的掩膜板。

2)停止流动光刻平台的搭建：将上述掩膜板置于显微镜的光路中，调整好角度与聚焦位置。将pdms芯片(高60μm，长1cm)分别载气通道的两端打孔，一端为进样孔，一段为出样孔。将紫外光源连入显微镜的光路中调整焦距使光源聚焦到通道中，调整目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为40×。

3)水凝胶检测：将水凝胶注入芯片中，将紫外光引入上述调节好的光路中。调节粗细准焦螺旋，直到可以看到目的形状水凝胶(图1中)。

4)连接有mirna适配体的水凝胶微粒的制备：将捕获目标mirna的商业化探针(购自上海生工)按1：100混合于水凝胶溶液中，按3)的方法照射即可得到水凝胶颗粒(图1中)。

实施例3

用于mirna的检测的水凝胶制备,具体步骤如下：

1)透光掩模版的图案设计的设计方法：使用l-edit软件，选定直径为30mm的区域作为工作区域，在此工作区域的中心位置我们选取半径为3mm的区域做另一图层，然后用工作区域减去此图层便得到中心区域为圆形的掩膜板。

2)停止流动光刻平台的搭建：将上述掩膜板置于显微镜的光路中，调整好角度与聚焦位置。将pdms芯片(高60μm，长1cm)分别载气通道的两端打孔，一端为进样孔，一段为出样孔。将紫外光源连入显微镜的光路中调整焦距使光源聚焦到通道中，调整目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为40×。

3)水凝胶检测：将水凝胶注入芯片中，将紫外光引入上述调节好的光路中。调节粗细准焦螺旋，直到可以看到目的形状水凝胶(图1右)。

4)连接有mirna适配体的水凝胶微粒的制备：将捕获目标mirna的商业化探针(购自上海生工)按1：100混合于水凝胶溶液中，按3)的方法照射即可得到水凝胶颗粒(图1右)。

实施例4

基于水凝胶mirna的检测技术，检测具体步骤如下：

1)基于水凝胶颗粒mirna的检测：

取五十微升的水凝胶颗粒加入五十微升的tet(含七百毫摩尔每升的氯化钠)，

取五微升(10-1000amol)的待检mirna于九十五微升的tebuffer中(含五百毫摩尔每升的氯化钠)，将上述两溶液混起来与金属浴中90分钟(55℃，1500r/min)，将反应液于tet中清洗三次，900r/min离心3分钟后加入取下部液体一百微升，加入245μl的杂交缓冲液(九百tet、零点零三一克nacl、一百微升nebbuffer、二微升atp、零点三三微升通用连接子、一点八八微升t4dna连接酶)。金属浴中30分钟(21.5℃、1500r/min)加入5μl稀释100倍的sape(与亲和素连接的藻红蛋白)(图2)。

实施例5

基于水凝胶mirna的检测技术，检测具体步骤如下：

1)取五十微升的水凝胶颗粒加入五十微升的tet(含七百毫摩尔每升的氯化钠)，

取五微升(10-1000amol)的待检mirna于九十五微升的tebuffer中(含五百毫摩尔每升的氯化钠)，将上述两溶液混起来与金属浴中90分钟(55℃，1500r/min)，将反应液于tet中清洗三次，900r/min离心3分钟后加入取下部液体一百微升，加入245μl的杂交缓冲液(九百tet、零点零三一克nacl、一百微升nebbuffer、二微升atp、零点三三微升通用连接子、一点八八微升t4dna连接酶)。金属浴中30分钟(21.5℃、1500r/min)加入5μl稀释100倍的sape(与亲和素连接的藻红蛋白)(图2)。

实施例6

基于水凝胶mirna的检测技术，检测具体步骤如下：

1)取五十微升的水凝胶颗粒加入五十微升的tet(含七百毫摩尔每升的氯化钠)，

取五微升(10-1000amol)的待检mirna于九十五微升的tebuffer中(含五百毫摩尔每升的氯化钠)，将上述两溶液混起来与金属浴中90分钟(55℃，1500r/min)，将反应液于tet中清洗三次，900r/min离心3分钟后加入取下部液体一百微升，加入245μl的杂交缓冲液(九百tet、零点零三一克nacl、一百微升nebbuffer、二微升atp、零点三三微升通用连接子、一点八八微升t4dna连接酶)。金属浴中30分钟(21.5℃、1500r/min)，加入5μl稀释100倍的sape(与亲和素连接的藻红蛋白)(图2)。

实施例7

重复实施例6，但加入的为非待检mirna作为对照，具体步骤如下；

1)取五十微升的水凝胶颗粒加入五十微升的tet(含七百毫摩尔每升的氯化钠)，

取五微升(10-1000amol)的非待检mirna于九十五微升的tebuffer中(含五百毫摩尔每升的氯化钠)，将上述两溶液混起来与金属浴中90分钟(55℃，1500r/min)，将反应液于tet中清洗三次，900r/min离心3分钟后加入取下部液体一百微升，加入245μl的杂交缓冲液(九百tet、零点零三一克nacl、一百微升nebbuffer、二微升atp、零点三三微升通用连接子、一点八八微升t4dna连接酶)。金属浴中30分钟(21.5℃、1500r/min)，加入5μl稀释100倍的sape(与亲和素连接的藻红蛋白)，结果如图3，与图2相比仅有非常弱的荧光信号证明非待检物与本申请所述水凝胶颗粒结合非常弱，也说明此种方法具有极大的可实施性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。