一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用。

背景技术：

血吸虫病是由血吸虫感染引起的人畜共患寄生虫病，对人类和动物健康构成严重威胁，及时准确诊断对疾病控制至关重要。常规的方法是检测粪便中是否存在虫卵，然而这种方法敏感性不高，易出现假阴性结果。使用基于pcr技术方法虽实现了更精准的结果，但由于成本和实验条件等问题，还难以实现大规模应用。而基于elisa的抗原抗体检测方法具有较少的交叉污染性，并且价格合理且易于操作，已成为血吸虫病诊断的较好方法之一。

细胞外囊泡是由细胞释放到细胞外环境中的微小囊泡，不仅在发育、免疫调节、血管生成和细胞迁移等诸多生命进程中发挥重要作用，还在多种疾病的诊断中成为良好的诊断标识分子。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种日本血吸虫多免疫表位重组蛋白及其在检测血吸虫病中的应用

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是克服了目前日本血吸虫感染检测方法特异性和灵敏度有限的问题，和/或降低检测成本。

为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白，该重组蛋白为seqidno.1所示的表位肽68、seqidno.2所示的表位肽71或seqidno.3所示的串联表位肽。

进一步地，串联表位肽的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明的另一个方面提供了一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白的制备方法，重组蛋白为如上所述的日本血吸虫免疫表位重组蛋白；该制备方法为合成法或表达纯化法。

可选地，表达纯化法为原核表达纯化法。

可选地，原核表达纯化法的步骤为：将编码重组蛋白的核苷酸序列连接到原核表达载体上，用重组原核表达载体转化原核表达菌株，培养转化后的原核表达菌株，收集细胞，破碎后从裂解液中纯化所述重组蛋白。

可选地，原核表达载体为pet系列表达载体；原核表达菌株为大肠杆菌表达菌株。

进一步可选地，原核表达载体为pet32a(+)载体；原核表达菌株为大肠杆菌bl21菌株。

可选地，纯化方法为层析法；较佳地为亲和层析法；进一步可选的为镍离子亲和层析法。

本发明的第三个方面提供了一种检测日本血吸虫感染的方法，其使用如上所述的日本血吸虫免疫表位重组蛋白，该方法包括如下步骤：

将重组蛋白包被于基质上；

加入待检测样本，使其与重组蛋白进行反应；

检测上述反应的结果。

可选地，上述检测为检测抗原与抗体反应，检测方法时在上述反应的产物中加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗igg的抗体后孵育、显色并测定化学发光值。

可选地，待检测样本可以为本领域常规所指被日本血吸虫感染的样本，较佳地为被日本血吸虫感染后的血清样本。

本发明的第四个方面提供了上述日本血吸虫免疫表位重组蛋白在制备诊断日本血吸虫的产品中的应用。

本发明的第五个方面提供了一种检测日本血吸虫感染的试剂盒，包括如上所述的日本血吸虫免疫表位重组蛋白。

可选地，该试剂盒还包括免疫反应封闭液、免疫反应终止液和偶联有显色反应酶的抗igg的抗体。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合。

本发明的重组蛋白能有效、快速地检测日本血吸虫感染，并且在日本血吸虫的早期感染检出中具有较好的灵敏度。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个实施例中重组串联表位肽的表达和纯化的sds-page图。a.诱导含有串联表位肽的重组质粒的原核表达菌体电泳分析；其中，m：分子量标记(单位kda)；泳道1：未诱导含重组质粒的菌体；泳道2：诱导后含重组质粒的菌体；泳道3：空载体对照。b.sds-page电泳分析纯化的重组串联表位肽；其中，m：分子量标记(单位kda)；泳道1：纯化后的重组串联表位肽。箭头表示重组串联表位肽。

图2是本发明的一个实施例中elisa检测条件的优化的结果图。a.ph7.4条件下的elisa结果。b.ph9.6条件下的elisa结果。c.不同肽浓度(表位肽68)(0.5μg/ml和2μg/ml)和不同血清稀释度(1:50、1：100和1：200)的eilsa结果。

图3是本发明的一个实施例中elisa分析感染日本血吸虫的小鼠和图对肽表位68和肽表位71的识别结果。a和b是感染日本血吸虫的小鼠对表位肽71和表位肽68的识别结果；c和d是感染日本血吸虫的兔对表位肽68和表位肽71的识别结果。

图4是本发明的一个实施例中分析感染日本血吸虫的小鼠血清识别重组串联表位肽的蛋白免疫印迹图。

图5是本发明的一个实施例中elisa分析感染日本血吸虫尾蚴的小鼠/兔的血清识别重组串联表位肽的结果。a.elisa检测感染日本血吸虫尾蚴的小鼠血清中的重组串联表位肽的抗体；b.elisa检测感染日本血吸虫尾蚴的兔血清中的重组串联表位肽的抗体。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

下述实施例中的实验材料、仪器和试剂的来源如下：

实验动物与生物材料：昆明系小鼠和新西兰大白兔购自上海杰思捷实验动物有限公司；日本血吸虫尾蚴购自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制研究所。

实验细胞与试剂：大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌dh5α感受态细胞和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)购自天根生化科技(北京)有限公司；pet32a(+)质粒购自novagen公司；his·bandresin试剂盒、immobilon^tmwesternchemiluminescenthrpsubstrate购自默克公司，goatanti-mouseigg,hrpconjugated、goatanti-rabbitigg,hrpconjugated、goatanti-humanigg,hrpconjugated购自北京康为世纪生物科技有限公司、bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自于上海碧云天生物技术有限公司；iptg、氨苄青霉素购自生工生物工程股份有限公司；脱脂牛奶购自碧迪医疗器械(上海)有限公司、pvdf膜购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司、吐温20购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

实验仪器：thermoscientificfresco17离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；tecaninfinitem200pro多功能酶标仪购自于帝肯(上海)贸易有限公司；fj-20高速分散均质机购自上海标本模型制造厂；olympusbx53显微镜购于奥林巴斯(中国)有限公司；jy92-iidn超声波细胞破碎仪购自上海净信实业发展有限公司；蛋白凝胶电泳电源、电泳槽、转印槽均购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

实施例1血吸虫特异性细胞外囊泡蛋白的生物信息学分析和抗原表位预测

通过对日本血吸虫细胞外囊泡的蛋白进行质谱分析以及数据查询最后获得了7个日本血吸虫特异性、具有诊断潜能的蛋白分子，使用dnastar软件预测可能抗原表位，选择了具有良好亲水性和强抗原性的肽：表位肽68(如seqidno.1所示)和表位肽71(如seqidno.2所示)，由吉尔生化(上海)有限公司化学合成。

实施例2重组串联表位肽的克隆、表达和纯化

编码串联表位肽的核酸序列cdna片段(序列如seqidno.4所示)由上海杰李生物技术有限公司合成，然后将其和表达载体pet32a(+)均用限制性内切酶kpni和hindiii双酶切，酶切产物进行胶回收连接，然后将含有正确插入的重组质粒转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中。筛选阳性重组菌接种于lb氨苄培养基中，当od600nm值为0.6-0.8时，加入1.0mmiptg，37℃诱导表达8小时。然后使用his·bindresin纯化试剂盒纯化富集重组蛋白，并通过12.0％的蛋白胶进行sds-page分离鉴定。诱导后的重组蛋白及纯化蛋白的sds-page分析结果如图1所示，图1a中第2泳道箭头所指为诱导后的菌体中表达的串联表位肽，图1b中第1泳道箭头所指为纯化后的串联表位肽。

实施例3感染日本血吸虫不同天数的小鼠和兔血清样本的制备以及可溶性虫卵抗原(sea)制备

清洁级小鼠和新西兰大白兔分别通过腹部皮肤贴片感染约200条和2000条日本血吸虫尾蚴。感染后每隔7天，小鼠通过眼眶采血，兔子通过耳缘静脉采血。收集全血后，在室温下静置30min，然后4℃，1,000-2,000×g离心20min，收集血清。

收集感染日本血吸虫尾蚴42天的兔肝脏，将其剪成小块状，放入高速组织捣碎机，加入适量4℃预冷的磷酸盐缓冲液(pbs)，高速匀浆。将匀浆液依次通过60、80、120、160和200目筛网，收集滤液，5000×g离心10min后用pbs洗涤三次，然后用100ml含有7.5u胰蛋白酶的pbs重悬沉淀，置于摇床中37℃孵育2小时。重复离心，直至除去上部宿主肝脏糊状物，得到金黄色颗粒。在显微镜下检查分离的虫卵质量并用适量的pbs稀释。虫卵通过反复冻融，在冰上超声处理，然后12,000×g离心20min，收集上清即为sea(即虫体蛋白)。

实施例4elisa条件优化

将实施例1中化学合成的表位肽68和表位肽71分别用碳酸盐缓冲液(ph9.6；na2co3：0.159g/100ml；nahco3：0.293g/100ml)在两种不同稀释浓度情况下(0.5μg/ml和2μg/ml)包被96孔板，每孔100μl，以sea为阳性对照，4℃包被过夜。然后，弃掉包被液，pbst洗涤三次，每孔加入100μl1％明胶，37℃封闭1小时。弃掉封闭液，pbst洗涤三次，然后用两种不同ph值(7.4和9.6)的pbs稀释感染血吸虫的兔血清作为一抗，每孔100μl，做三个不同稀释度(1：50，1：100和1：200)，同时以阴性血清作为阴性对照，37℃温育1小时。弃掉一抗，pbst洗涤三次，然后加入hrp标记山羊抗兔igg，37℃反应1小时。然后，弃掉二抗，pbst洗涤三次后，每孔加入100μltmb显色液，37℃显色10min左右，每孔加入50μl2mh2so4终止液，然后在酶标仪中测定450nm处吸光度。

比较图2a和图2b可知，elisa测定的最佳ph值为ph7.4，血清最佳稀释度为1：200(图2c)。

效果实施例1

将实施例1中化学合成多肽用碳酸盐缓冲液(ph9.6；na2co3：0.159g/100ml；nahco3：0.293g/100m)以2μg/ml的稀释度包被96孔板，每孔100μl，同时以sea为阳性对照，4℃过夜。弃掉包被液，pbst洗涤三次，每孔加入100μl1％明胶，37℃封闭1小时。弃掉封闭液，pbst洗涤三次，然后用ph值7.4的pbs1：200稀释感染血吸虫不同天数的兔血清和小鼠血清作为一抗，每孔100μl，同时添加阴性血清作为阴性对照，37℃温育1小时。弃掉一抗，pbst洗涤三次，然后分别加入hrp标记的山羊抗兔/鼠igg(1：4000)以及抗人igg(1:8000)，37℃反应1小时。弃掉二抗，pbst洗涤三次后，每孔加入100μltmb显色液，37℃显色10min左右，每孔加入50μl2mh2so4终止液，然后在酶标仪中测定450nm处吸光度。

如图3a-d所示，感染日本血吸虫的小鼠分离的血清能识别表位肽68和表位肽71。与未感染的血清相比，感染日本血吸虫的兔或人血清能显着地识别到这两种表位肽，特别是新西兰大白兔感染后的早期(7天)。

效果实施例2评价重组串联表位肽检测日本血吸虫感染的效果

将实施例2所制备的纯化后的串联表位多肽通过10％的sds-page分离，然后转移到pvdf膜上，用含0.1％吐温20的pbs(ph7.4)配制的5％脱脂奶粉进行封闭。将膜与1：200稀释的感染血清在封闭缓冲液中室温孵育1小时，然后用0.1％pbst洗涤5次，每次5min。然后加入1:5000稀释的hrp标记的山羊抗鼠igg二抗，室温孵育1小时。pbst洗涤3次后，用ecl化学发光试剂盒显色。

如图4所示，蛋白质印迹结果表明感染日本血吸虫不同天数的小鼠血清可以特异性的识别串联表位肽，甚至在感染的早期阶段(感染后7天)。

效果实施例3

将实施例2所制备的纯化后的串联表位肽用碳酸盐缓冲液(ph9.6；na2co3：0.159g/100ml；nahco3：0.293g/100ml)稀释后包被96孔板，每孔100μl，同时加入sea做阳性对照，4℃包被过夜。第二天弃掉包被液，pbst洗涤三次，然后每孔加入100μl1％明胶，37℃封闭1小时。再弃掉封闭液，pbst洗涤三次，然后用ph值7.4的pbs1：200稀释感染日本血吸虫不同天数的兔血清和小鼠血清作为一抗，每孔100μl，同时添加阴性血清作为对照，37℃温育1小时。弃掉一抗，pbst洗涤三次，然后分别加入hrp标记的山羊抗兔/鼠igg(1：4000)以及抗人igg(1:8000)，37℃反应1小时。弃掉二抗，pbst洗涤三次后，每孔加入100μltmb显色液，37℃显色10min左右，每孔加入50μl2mh2so4终止液，然后在酶标仪中测定450nm处吸光度

elisa结果表明感染日本血吸虫不同天数的小鼠和兔血清可以识别串联表位肽，其比阴性对照更敏感(图5a和b)。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120>一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用

<130>01822-19001pix

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>日本血吸虫(schistosomajaponicum)

<400>1

glyilegluasnservalserproleulysglnproasncys

1510

<210>2

<211>15

<212>prt

<213>日本血吸虫(schistosomajaponicum)

<400>2

cysglnlysglytyrlysthrprotyrgluglnasplyshistyr

151015

<210>3

<211>44

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cysglnlysglytyrlysthrprotyrgluglnasplyshistyrthr

151015

leualaargaspileglyglyseraspprogluargmetcysglyile

202530

gluasnservalserproleulysglnproasncys

3540

<210>4

<211>135

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgtcagaaaggttataaaaccccgtatgaacaggataaacattataccctggcacgtgat60

attggtggtagcgatccggaacgtatgtgtggtattgaaaacagcgttagcccgctgaaa120

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