本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种复合微生物菌剂的制备及应用方法。
背景技术：
：土壤是我们人类赖以生存的基础，是农业最基本和最重要的生产资料，是农业产业链环中的物质和能量循环的枢纽，是自然界具有再生作用的自然资源，特别是表耕层土壤，是植物的重要养分来源。近年来，我国土壤退化现象日益严重，其中以农田可耕性下降表现较为典型，耕地越种越硬，地力越来越贫瘠，使农作物的生长严重受阻，进而导致农产品的产量和质量严重下降。板结作为土壤退化的一个典型表现，其主要原有是长期使用化肥和化学农药，严重影响和破坏了土壤中有益微生物的繁殖和种群数量，最终导致土壤的可耕性变得越来越差，作物品质严重下降。针对上述存在问题，本发明一种复合微生物菌剂及应用能够有助于的解决这个土壤难题，利用其三种有益微生物在土壤中大量定植和繁殖，以及三种有益微生物菌的代谢产物，使其不仅具有改良土壤的功能，也可以提高农作物品质，提高苹果的含糖量。本发明是一种高效绿色环保的复合微生物菌剂，在新的生物肥料研发方面和应用方面都具有广阔的理论和实践意义。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，利用各菌株之间互利共生、协生等关系，本发明提供了一种复合微生物菌剂及复合微生物菌剂的制备方法。本发明提供的一种复合微生物菌剂，含有多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌。所述的多粘类芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11586；所述的酿酒酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11238；所述的乳酸乳球菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016235但本发明不局限于该菌，本发明的复合微生物菌剂中的三种菌不限于特定编号的多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌、乳酸乳球菌，本领域技术内公知的属于上述菌的微生物均可适用于本发明的复合微生物菌剂。本发明的复合微生物菌剂中各个菌的活孢子数分别为：多粘类芽孢杆菌≥3亿/ml、酿酒酵母菌≥1亿/ml、乳酸乳球菌≥2亿/ml。本发明的复合微生物菌剂是将多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌分别发酵得到二级发酵液后，将三种菌的二级发酵液按照体积比3:2:2的比例接种到三级发酵培养基中发酵，当发酵液中多粘类芽孢杆菌的活孢子数≥3亿/ml、酿酒酵母菌的活孢子数≥1亿/ml、乳酸乳球菌的活孢子数≥2亿/ml时发酵结束，制得本发明复合微生物菌剂。本发明提供了制备上述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌分别进行一级种子发酵、二级种子发酵，得到二级发酵液；将多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌的二级发酵液分别按照体积比3％、2％、2％的比例接种到三级发酵培养基中发酵，当发酵液各个菌的活孢子数分别为：多粘类芽孢杆菌≥3亿/ml、酿酒酵母菌≥1亿/ml、乳酸乳球菌≥2亿/ml时发酵结束，制得复合微生物菌剂。上述方法中，步骤(1)中步骤(1)中多粘类芽孢杆菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：红糖3％-6％，甘蔗糖蜜2％-4％,蛋白胨0.8％-2.0％，酵母浸膏0.5％-1.5％，nacl0.3％-0.8％，k2hpo40.1％-0.4％，硫酸镁0.02％-0.09％，mnso40.08％-0.16％，余量为水，ph6.8-7.2；②乳酸乳球菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：蔗糖2％-3.5％，黄豆粉1％-1.5％，玉米浆干粉0.8％-2.0％，柠檬酸氢二铵0.1％-0.6％，硫酸亚铁0.01％-0.09％，k2hpo40.03％-0.12％，mgso4·7h2o0.01％-0.03％，mnso4·4h2o0.01％-0.05％，余量为水，ph6.8-7.2；③酿酒酵母菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：甘蔗糖蜜1.0％-2.5％，酵母粉0.3％-1.5％，麦芽粉0.3％-1.5％，蛋白胨1.5％-3.5％，余量为水，ph6.8-7.2；步骤(1)中多粘类芽孢杆菌发酵方法为：取多粘类芽孢杆菌斜面保藏的菌种，接种于200ml一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为23-30℃、转速180r/min，发酵时间24～36h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50l发酵罐二级种子培养基中，接种量为3％，装液量为20l、发酵温度为23-30℃、搅拌转速150r/min，培养36-48h得到二级种子液，备用。步骤(1)中乳酸乳球菌发酵方法为：将经活化的乳酸乳球菌斜面保藏的菌种，直接接种于液体种子培养基，23-30℃、160r/min培养24-36h，得到一级种子液；将摇瓶种子液按2％的接种量接种于50l发酵罐中，装液量为20l，23-30℃、120r/min发酵36-48h，得到二级种子液，备用。步骤(1)中酿酒酵母菌发酵方法为：取酿酒酵母菌斜面保藏菌种接种于300ml一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为23-30℃、转速180r/min，发酵时间24-36h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50l发酵罐二级种子培养基中，接种量为2％，装液量为20l、发酵温度为23-30℃、搅拌转速180r/min，培养36-48h得到二级种子液，备用。本发明复合微生物菌剂制备方法的步骤(2)中将三种菌接种到三级发酵培养基中后，发酵方法为：发酵温度控制在23-30℃，进行24-36h的有氧发酵，使多粘类芽孢杆菌成为优势菌群并迅速增殖，使ph降至4.0-5.2，进行恒压厌氧发酵，温度仍然控制在23-30℃，进行24-36h的厌氧发酵，使酿酒酵母菌及乳酸乳球菌成为优势菌群并迅速增殖。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明的复合微生物菌剂利用其三种有益微生物菌在土壤中大量繁殖，提高土壤中的有益活菌数，且通过三种有益微生物菌的代谢产物使其不仅具有改良土壤功能，也可以增加苹果的含糖量，提高品质。(2)本发明制备复合微生物菌剂的方法不仅解决了单菌发酵生产的能耗高、工艺繁琐等问题，而且还能提高各菌种生物活性，扩大单一菌剂的功能，并解决菌种退化等问题。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若没有特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例使用的多粘类芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11586；以下实施例使用的酿酒酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11238；以下实施例使用的乳酸乳球菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016235。实施例1复合微生物菌剂的制备：本发明提供了制备上述复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌分别进行一级种子发酵、二级种子发酵，得到二级发酵液；将多粘类芽孢杆菌、酿酒酵母菌及乳酸乳球菌的二级发酵液分别按照体积比3％、2％、2％的比例接种到三级发酵培养基中发酵，当发酵液各个菌的活孢子数分别为：多粘类芽孢杆菌≥3亿/ml、酿酒酵母菌≥1亿/ml、乳酸乳球菌≥2亿/ml时发酵结束，制得复合微生物菌剂。上述方法中，步骤(1)中步骤(1)中多粘类芽孢杆菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：红糖4％，甘蔗糖蜜2.6％,蛋白胨1.5％，酵母浸膏1.0％，nacl0.4％，k2hpo40.2％，硫酸镁0.05％，mnso40.12％，余量为水，ph6.9；乳酸乳球菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：蔗糖2.5％，黄豆粉1.0％，玉米浆干粉1.2％，柠檬酸氢二铵0.3％，硫酸亚铁0.08％，k2hpo40.06％，mgso4·7h2o0.02％，mnso4·4h2o0.03％，余量为水，ph6.9；酿酒酵母菌发酵时采用的一级、二级种子培养基成分按重量百分比计为：甘蔗糖蜜1.5％，酵母粉1.0％，麦芽粉1.0％，蛋白胨2.5％，余量为水，ph7.1；步骤(1)中多粘类芽孢杆菌发酵方法为：取多粘类芽孢杆菌斜面保藏的菌种，接种于200ml一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为28℃、转速180r/min，发酵时间30h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50l发酵罐二级种子培养基中，接种量为3％，装液量为20l、发酵温度为28℃、搅拌转速150r/min，培养48h得到二级种子液，备用。步骤(1)中乳酸乳球菌发酵方法为：将经活化的乳酸乳球菌斜面保藏的菌种，直接接种于液体种子培养基，28℃、160r/min培养30h，得到一级种子液；将摇瓶种子液按2％的接种量接种于50l发酵罐中，装液量为20l，28℃、120r/min发酵48h，得到二级种子液，备用。步骤(1)中酿酒酵母菌发酵方法为：取酿酒酵母菌斜面保藏菌种接种于300ml一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为28℃、转速180r/min，发酵时间20h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50l发酵罐二级种子培养基中，接种量为2％，装液量为20l、发酵温度为28℃、搅拌转速180r/min，培养48h得到二级种子液，备用。本发明复合微生物菌剂制备方法的步骤(2)中将三种菌接种到三级发酵培养基中后，发酵方法为：发酵温度控制在28℃，进行30h的有氧发酵，使多粘类芽孢杆菌成为优势菌群并迅速增殖，使ph降至4.0-5.2，进行恒压厌氧发酵，温度仍然控制在28℃，进行28h的厌氧发酵，使酿酒酵母菌及乳酸乳球菌成为优势菌群并迅速增殖。最终当发酵液中多粘类芽孢杆菌的活孢子数≥3亿/ml、酿酒酵母菌的活孢子数≥1亿/ml、乳酸乳球菌的活孢子数≥2亿/ml时发酵结束，制得本发明复合微生物菌剂。实施例2：本发明一种复合微生物菌剂对土壤的改良应用本实施例通过以下方法进行：包括以下步骤：(1)用浅耕机将板结土壤翻转过来并用旋耕机将土块打碎；(2)在土壤表层喷淋,用水稀释本发明复合微生物菌剂，所述用水稀释的复合微生物菌剂中，按照比例为1：300与水混合后先在土壤表层喷淋并用2-3厘米碎土掩盖，然后再次施加所述复合微生物菌剂，最后再掩盖一层3-5厘米碎土。(3)在土壤中使用后，本发明可以很好的解决土壤板结问题，并增加和提高土壤微生物种群数量。并且能恢复微生物种群数量在10亿到15亿左右，并且在改良土壤的过程中无任何化学残留，没有对环境的污染，是一种绿色环保微生物菌剂。实施例3：一种复合微生物菌剂在果树方面的应用本实施例以提高苹果嘎啦品质，试验地点：杨凌区苹果试验田，苹果试验小区面积120㎡，小区栽植12株果树。1、试验处理：处理一：实施例一制备的复合微生物菌剂，在苹果采收前50天，将其与水充分混合后(比例为：1：300)结合渗灌技术处理，每平米实施50l稀释后的菌液，在采收前30天，将其与水充分混合后，对其进行叶面喷施一次，每平方米实施30l稀释后的菌液；处理二：将处理一中的菌液换成等量的市售化学肥料；处理三：将处理一中的菌液换成等量的清水。2、试验方法：采摘之后对比各个试验处理下的苹果的着色度以及苹果的甜度，着色结果见表一，甜度检测见表二。表一三种处理下苹果着色试验结果由表1可以看出，实施例1制备的一种复合微生物菌剂对苹果着色效果明显好于处理二与处理三，着色50％以上的比例分别为70.1％，51.1％，46.8％，由此可以说明实施例1制备的复合微生物菌剂对苹果着色有明显促进作用。表二三种试验处理下苹果甜度试验结果处理一处理二处理三甜度8.57.66.8由表二可以看出，本发明的一种复合微生物菌剂对苹果甜度提高的效果明显好于处理二及处理三，比对照甜度提高了25％，说明本发明实施例所制备的复合微生物菌剂对苹果甜度有着明显的促进作用。实施例4：本发明一种复合为微生物菌剂在提高土壤微生物数量的应用。选取15㎡的试验田为试验小区。试验处理：处理一：实施例一制备的复合微生物菌剂，将其与水充分混合后(比例为：1：300)喷淋施加入试验小区土壤中，每平方米使用量为20l稀释后的菌液；处理二：将处理一中的复合微生物菌剂换为市售的土壤改良剂；处理三：将处理一中的菌液换为清水。试验方法：每个处理组共施用3次，每次间隔一周，周后一次处理30天后，取样调查统计土壤微生物总菌数。土壤微生物数量调查结果见表三。表三三种处理下的土壤微生物数量由表三可以看出，本发明一种复合微生物菌剂对土壤中微生物数量的恢复有着明显的促进作用，比起市售土壤改良剂所带来的改良，本发明更加高效，可以使得微生物的数量提高到10亿-15亿左右。综上，本发明一种复合微生物菌剂在土壤改良修复以及提高苹果的品质的方面有着明显的促进作用，并且本发明菌剂属于一种绿色环保的生物菌剂，不会对环境造成污染，以及可以解决过去过度使用农药化肥所带来的土壤问题。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 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