1.一种禽多瘤病毒的检测引物,其特征在于,包括如下引物:
apv上游引物为ap-f:5’-cagaacatatcgaaatgg-3’;
apv下游引物为ap-r:5’-tgcagatatcaagactgcc-3’。
2.一种禽多瘤病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有:
(1)如权利要求1所述的禽多瘤病毒的检测引物,
(2)特异性核酸探针,所述特异性核酸探针为经地高辛标记的有731bp的序列1。
3.根据权利要求2所述的禽多瘤病毒试剂盒,其特征在于,包括apv反应液、apv阳性对照、阴性对照、尼龙膜、碱基磷酸酶标记的抗地高辛抗体、显色底物nbt/bcip溶液和其他试剂,所述apv反应液包括pcr缓冲溶液、dntp、apv引物和特异性核酸探针。
4.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒,其特征在于,所述apv阳性对照为未经标记的731bp的序列1。
5.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为经检验合格spf鸡胚制备的cef提取的dna。
6.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒,其特征在于,所述其他试剂为变性液、中和液、预杂交液、洗液i、洗液ii、缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液
7.一种禽多瘤病毒的检测方法,其特征在于,按照如下步骤进行:
步骤一:核酸样品的制备
样品dna的提取:取待检测组织样品每份0.1g研磨后,加入0.5ml抽提缓冲液和终浓度为100μg/ml的蛋白酶k于55℃消化过夜;
加入等体积苯酚/氯仿溶液,充分振荡混匀后,12000r/min离心5分钟,上清液转移至另一离心管中,再加入两倍体积的无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1小时以上,12000r/min离心15分钟,弃去上清;
再加入1ml70%的无水乙醇洗涤1次,沉淀溶解于适量te缓冲液中,即为样品dna;
步骤二:斑点分子杂交及免疫检测
(1)取一张试剂盒中的尼龙膜,划好格子,做好标记;
(2)把试剂盒中的阴性对照核酸和apv阳性对照核酸各取1μl及步骤一中提取的样品dna各取2μl分别点样到(1)中尼龙膜各个格子的中央;
(3)用镊子把(2)中尼龙膜点样面朝上,放于已用变性液饱和的滤纸上变性10分钟,再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上中和5分钟;
(4)将(3)中的尼龙膜用镊子取出,点样面朝上放于平皿中室温干燥10分钟,至尼龙膜表面没有明显的水珠即可,在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2小时固定dna;
(5)将10ml预杂交液加入平皿中,用镊子将(4)中尼龙膜转移至预杂交液后,在电热恒温水槽中65℃反应2小时,每15分钟摇动1次尼龙膜平皿;
(6)在(5)步骤开始1.5小时后,取10ml预杂交液和4μlapv-vp1特异性核酸探针加入50ml的离心管中,置于沸水中煮沸变性10分钟,取出后立即放于冰浴中速冻5分钟,即为杂交液;
(7)将平皿中的(5)预杂交液倒掉,把(6)中的杂交液倒入平皿中,需盖过尼龙膜,后转入65℃杂交6小时以上;
(8)取出平皿,倒掉(7)中杂交液,在尼龙膜上加入10ml洗液
(9)倒掉(8)中洗液
(10)倒掉(9)中洗液
(11)倒掉(10)中缓冲液
(12)将2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物经12000r/min离心5min,加入到10ml缓冲液
(13)倒掉(12)溶液,在平皿中加入10ml缓冲液
(14)倒掉(13)溶液,在平皿中加入10ml缓冲液
(15)倒掉(14)溶液,在平皿中加入10ml缓冲液
(16)倒掉显色液,加入水反复冲洗,及时终止显色并拍照记录结果;
步骤三:结果分析与判定
(1)apv阳性对照出现褐色显色,阴性对照无显色,判定试验有效;
(2)样品有显色的为阳性,无显色为阴性。
8.一种如权利要求1所述引物在制备检测禽多瘤病毒物品中的应用。