一种集PCR扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置和检测方法与流程

一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置和检测方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物医疗器械技术领域，具体涉及一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置及检测方法。


背景技术：

[0002]
聚合酶链式反应(pcr)是核酸研究中的重要方法，广泛应用于生命科学研究、检验检疫、司法、医学诊断和研究等相关领域。将核酸提取、pcr扩增与毛细管电泳分析进行高效整合是适应当下医疗领域所要求的核酸检测装置具有分析效率高、集成度高、自动化程度高与准确度高等特征的一种新型设计观念。
[0003]
核酸pcr扩增可以分为静态固定扩增式pcr和连续流动式pcr(cfpcr)两种类型。静态固定扩增式pcr测试平台中采用热容较大的金属块进行热循环温度控制，其反应速度理论上受pcr反应体系的热容、温控模块材料的热容、加热器以及传感器的热容等因素制约。在cfpcr测试中，待扩增的样本连续流动经过三个温度不同的恒温带，由于扩增过程中不需要反复地加热或冷却，因此其加热冷却速度一般不受设备系统的热容限制，从而简化了温控设计，缩短了扩增所需的时间，很大程度提高了pcr扩增的效率。
[0004]
毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力的色谱分离分析技术。毛细管电泳系统主要包括毛细管组件、阴极池、阳极池以及胶路系统等。目前，毛细管电泳分离技术常被用于pcr扩增后样本的后处理。
[0005]
专利cn106701566b公开了一种集核酸提取、扩增、检测于一体的机械装置，但其中在一个装置中仅能完成核酸提取与pcr扩增，后续的检测需要到另一个检测装置进行，因此在pcr扩增完成后进行检测的过程中需要人工介入，并未实现真正意义上的集分子诊断的提取、扩增、检测三位于一体。另外，需人工介入的问题导致该装置的操作易造成核酸污染，难以进行临床大规模推广。
[0006]
专利cn208829682u公开了一种一体化dna分析仪，虽然该dna分析仪能够实现集分子诊断的提取、扩增、检测三位于一体，但在该仪器中，高浓pcr产物敞口放置在仪器内，并且该仪器仅通过散热风扇来排除污染物，这种方式不仅无法避免高浓pcr产物污染，反而更容易污染整个装置内环境。
[0007]
专利us9889449b2公开了一种用于六种或更多种染料标记片段的多重扩增和检测的集成系统，其中将pcr扩增与毛细管电泳分析集成为生物芯片，通过生物芯片来实现扩增与检测的二位合一，但其制造成本高，测试通量低，制约了其临床推广。
[0008]
文献《连续流动式pcr微流控装置的研究》(章春笋，邢达.《激光生物学报[j].2007,16(4):501-508.)以及专利cn102605065a均涉及连续流动式pcr微流控技术。文献《连续流动式pcr微流控装置的研究》公开了连续流动式pcr微流控装置，但是其中没有实现将pcr扩增与检测整合在一个装置中。专利cn102605065a公开了一种连续流动巢式pcr微流控方法，但是该方法包括两次pcr扩增，两次扩增之间需要人工介入，不能实现自动化。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置和检测方法，本发明可以实现将pcr扩增与电泳分离分析集于一卡夹内，与配套仪器一道完成扩增后目标样本的检测。本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0010]
本发明第一方面涉及一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置，其包括顺序连通的待检测样本入口19、pcr扩增区2、液体抽吸输送装置3、液体切分器5、温控区18和毛细管电泳系统21，其中所述液体切分器5还连通电泳分析试剂容纳装置20，所述液体抽吸输送装置3还分别连通水容纳装置4和废液袋13。
[0011]
在优选的实施方案中，在所述待检测样本入口19和所述pcr扩增区2之间设置有负压除气缓冲装置1。
[0012]
所述负压除气缓冲装置1的作用是使待检测样本中溶解的气体析出，这样一方面可以避免待检测样本中各液段在变性过程中由于高温析出气泡而造成溶液分段影响扩增效率的情况；一方面可以使后续pcr扩增区2容纳更多的待检测样本，大大提高了仪器的扩增效率；一方面还可以提高整个流路中控制流体运动定位的精度。
[0013]
在优选的实施方案中，所述毛细管电泳系统21包括顺序连接并流路连通的阴极池7、毛细管组件、阳极池10和胶盒14；所述阴极池7上设置有两个阴极电极6，所述阳极池10上设置有阳极电极11；所述毛细管组件包括毛细管17、设置在所述毛细管17外壁周围的毛细管温度控制单元16和设置在所述毛细管17外壁上的检测窗15，所述检测窗15处设置有光学检测组件。
[0014]
在优选的实施方案中，所述阴极池7还分别连通所述温控区18和缓冲液容纳装置9；所述阳极池10还连通溢流胶袋12。
[0015]
在优选的实施方案中，水容纳装置4中的水为双蒸水(ddh2o)。
[0016]
在具体实施方案中，所述待检测样本入口19可与卡夹装置外部的样品加注器或样品托盘等可容纳待检测样本的装置连接。
[0017]
在具体实施方案中，所述pcr扩增区2中可采用静态固定扩增式pcr装置或连续流动式pcr装置，优选采用cfpcr装置，更优选采用管道式cfpcr装置。
[0018]
其中，所述液体切分器5的作用是实现电泳分析试剂和pcr扩增后溶液的成比例混合。
[0019]
其中，所述温控区18的作用是使双链dna受热变性成为单链dna，以便进行后续的毛细管电泳分析。
[0020]
在具体实施方案中，所述毛细管17可以采用市售产品，如polymicro technologiespt公司生产的弹性熔融石英毛细管，一般是采用人造熔融石英半成品拉制而成，类似的也可以使用天热石英、硼硅玻璃、多种塑料或熔融硅材料合成物质来制造，这主要取决于实际的应用需求。进一步，毛细管17作为电泳分离的载体，优选弯曲设置，形成平滑的弧度，达到电泳分离的最佳效果，当然，也可以将毛细管17以其他方式设置，如直接呈直线型设置等。另外，在优选的实施方案中，一个毛细管组件内部仅设置有一根毛细管17，但根据实际需要，如为了提高分析通量或分析效率等，也会采用将多根毛细管17并行排列成毛细管束的形式，如将4根、8根、16根、24根或32根等数量的毛细管17以阵列的形式设置在毛细管组件中，本发明中对此并不做具体限定。
[0021]
在优选的实施方案中，毛细管温度控制单元16包括加热元件、温度传感器和保温元件等，其中温度传感器用于实时反馈毛细管17的温度。
[0022]
其中，所述检测窗15和所述光学检测组件用于实现毛细管电泳的检测分析。
[0023]
其中，所述溢流胶袋12的作用是分散灌胶过程中阳极池10中的压力。
[0024]
其中所述胶盒14、所述电泳分析试剂容纳装置20和所述缓冲液容纳装置9均连接有可使其中内含物向外输送的动力装置。其中，所述动力装置包括可由人力、电力等提供推拉力或抽吸力的装置，例如，所述阴极池7和所述缓冲液容纳装置9之间，所述胶盒14和所述阳极池10之间，所述电泳分析试剂容纳装置20和所述液体切分器5之间均可设置有压电泵8，所述压电泵8为各液体的输送提供动力；或者，所述缓冲液容纳装置9、所述胶盒14和所述电泳分析试剂容纳装置20均连接有柱塞杆，所述柱塞杆受外力挤压后将各液体挤压出来；或者在不同装置中可以结合使用压电泵和柱塞杆。
[0025]
在优选的实施方案中，本发明的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置包括顺序连接并流路连通的待检测样本入口19、pcr扩增区2、液体抽吸输送装置3、液体切分器5、温控区18和毛细管电泳系统21，其中
[0026]
所述液体抽吸输送装置3还分别连通水容纳装置4和废液袋13；
[0027]
所述液体切分器5还连通电泳分析试剂容纳装置20；
[0028]
所述毛细管电泳系统21包括顺序连接并流路连通的阴极池7、毛细管组件、阳极池10和胶盒14；所述毛细管组件包括毛细管17、设置在所述毛细管17外壁周围的毛细管温度控制单元16和设置在所述毛细管17外壁上的检测窗15，所述检测窗15处设置有与其相连的光学检测组件；所述阴极池7还分别连通所述温控区18和缓冲液容纳装置9且所述阴极池7上设置有两个阴极电极6；所述阳极池10还连通溢流胶袋12且所述阳极池10上设置有阳极电极11；
[0029]
其中所述胶盒14、所述电泳分析试剂容纳装置20和所述缓冲液容纳装置9均连接有可使其中内含物向外输送的动力装置。
[0030]
在优选的实施方案中，所述液体抽吸输送装置3包括泵阀一体件311和旋转分注阀312；其中
[0031]
所述泵阀一体件311包括控制其是否与大气连通以及是否与所述水容纳装置4连通的旋转阀，以及与所述旋转阀气路连通的柱塞泵；
[0032]
所述旋转分注阀312在四个方向上开有四个孔，第一个孔连通所述废液袋13，第二个孔连通所述液体切分器5，第三个孔连通所述pcr扩增区2，第四个孔通过所述泵阀一体件311连通所述水容纳装置4；所述旋转分注阀312中包括在阀芯处相通的两条流路通道，其中第一流路通道固定与第四个孔连通，第二流路通道通过阀芯的旋转切换与第一个孔、第二个孔和第三个孔之一连通。
[0033]
在具体实施方案中，所述旋转分注阀312阀芯的旋转由其自身的动力装置(如步进电机)驱动，从而实现第二流路通道与不同孔之间的连通。
[0034]
在优选的实施方案中，所述液体抽吸输送装置3包括第一柱阀321、第二柱阀322、抽吸装置323、第一单向阀324和第二单向阀325，其中所述第一柱阀321一测可切换连接pcr扩增区2和水容纳装置4，另一侧顺序通过流路连接第一单向阀324、第二单向阀325和第二柱阀322的一侧，所述第二柱阀322的另一侧可切换连接废液袋13和液体切分器5，所述第一
单向阀324和第二单向阀325之间连接有抽吸装置323。
[0035]
在具体实施方案中，所述抽吸装置323可以是小型注射器。该实施方案中的卡夹装置，由于卡夹内的液体抽吸输送装置3中均采有无源器件(即无需电力的器件)，因此制作成本更低，进一步降低了本发明卡夹装置的制作成本。
[0036]
本发明第二方面涉及一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的检测方法，该方法使用如本发明第一方面所述的卡夹装置进行，该方法包括以下步骤：
[0037]
1)对毛细管电泳系统21进行灌胶；
[0038]
2)在液体抽吸输送装置3的作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入pcr扩增区2进行pcr扩增；
[0039]
3)在液体切分器5的作用下，pcr扩增后溶液与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性；
[0040]
4)变性后混合液进入毛细管电泳系统21进行毛细管电泳分析。
[0041]
在具体实施方案中，变性后混合液先进入毛细管电泳系统21中的阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样；然后在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管17中进行分离。其中，所述定时间进样通过以下方式实现：毛细管电泳系统21通过控制阳极与阴极施加高压电场的时间来实现样本的定时间进样，由于样本的带电极性，在电场的作用下，样本实现定向移动，从而实现定时间进样。
[0042]
在优选的实施方案中，其中步骤1)包括以下步骤：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满缓冲液。
[0043]
在优选的实施方案中，在步骤4)之后还包括以下步骤：
[0044]
5)在液体抽吸输送装置3的作用下，使水容纳装置4中的水将未进样的变性后混合液推入废液袋13中；
[0045]
6)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7；
[0046]
7)在液体抽吸输送装置3的作用下，使水容纳装置4的水对液体抽吸输送装置3及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0047]
任选地在步骤1)和2)之间还包括步骤a)在液体抽吸输送装置3的作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中的步骤；和/或
[0048]
任选地在步骤6)和7)之间还包括b)在液体抽吸输送装置3的作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中的步骤。
[0049]
在优选的实施方案中，该方法使用如本发明第一方面所述的卡夹装置进行，该方法包括以下步骤：
[0050]
1)灌胶：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满
缓冲液。其中，根据实际情况，灌胶过程可以一次完成，也可以重复多次完成，优选地，灌胶过程重复多次完成。在进行多次灌胶的情况下，可以在每次灌胶后均用缓冲液冲洗阴极池7，也可以仅在最后一次或最后两次灌胶后用缓冲液冲洗阴极池7；另外，灌胶和冲洗可以先后进行，也可以同时进行。优选地，由压电泵8提供动力，将缓冲液容纳装置9中的缓冲液泵出。其中，所述缓冲液可以为包含电泳时用以稳定体系酸碱的溶液，常见的核酸电泳缓冲液有tae、tbe、tpe、tris-甘氨酸和mops等，优选为tbe，更优选为0.5xtbe缓冲液，其含有0.045mol/l tris-硼酸和0.001mol/l edta(ph 8.0)。其中毛细管电泳分析中所采用的凝胶可以为本领域进行pcr扩增后产物分析时通常采用的凝胶，如聚丙烯酰胺凝胶，目前常用的有pop-7和pop-4，优选为pop-7，其包含以下物质：7％的非交叉线性的聚丙烯酰胺分子、8m尿素(用于使毛细管中的dna分子保持持续变性状态)、5％2-吡咯烷酮、10mm n-tris-(羟甲基)甲基-3-酸性硫酸基-氨丙醇(taps)，用naoh调节ph至8.0。
[0051]
2)在液体抽吸输送装置3的作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入pcr扩增区2进行pcr扩增。
[0052]
3)任选地，在液体抽吸输送装置3的作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中。
[0053]
4)在液体切分器5的作用下，pcr扩增后溶液与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性，然后变性后混合液进入阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样。在优选的实施方案中，所述待检测样本先经过负压除气缓冲装置1进行负压脱气，再进入pcr扩增区2进行pcr扩增。其中所述待检测样本包括pcr扩增样本(其包括核酸、酶和引物等)，还可以包括清洗液和/或隔离液；在包括清洗液和/或隔离液的情况下，pcr扩增样本与清洗液和/或隔离液顺序进入pcr扩增区2。其中所述电泳分析试剂中包括参比试剂和高度去离子甲酰胺(hidi)，所述参比试剂为含有标准分子量dna的溶液。在具体实施方案中，每次进样的待检测样本中pcr扩增样本的体积为1μl-60μl，优选2μl-40μl，更优选5μl-30μl，更优选10μl-25μl。在具体实施方案中，进入液体切分器5的pcr扩增后溶液的体积为0.5μl-5μl，更优选0.8μl-2μl，更优选1μl-1.5μl。
[0054]
5)在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管电泳系统21中进行分离。在分离过程中，毛细管温度控制单元16为毛细管17提供可靠稳定的温度环境，整个分离过程在检测窗15处通过光学检测组件中激光诱导荧光系统完成检测。
[0055]
6)在液体抽吸输送装置3的作用下，使水容纳装置4中的水将未进样的变性后混合液推入废液袋13中。
[0056]
7)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7。
[0057]
8)任选地，在液体抽吸输送装置3的作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中。
[0058]
9)在液体抽吸输送装置3的作用下，使水容纳装置4的水对液体抽吸输送装置3及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0059]
在优选的实施方案中，该方法使用如本发明第一方面所述的其中液体抽吸输送装置3包括泵阀一体件311和旋转分注阀312的卡夹装置进行，该方法包括以下步骤：
[0060]
1)灌胶：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极
池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满缓冲液。
[0061]
2)切换所述旋转分注阀312中的第二流路通道与第三个孔连通，在泵阀一体件311的抽吸作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入pcr扩增区2进行pcr扩增，之后pcr扩增后溶液进入所述第二流路通道中。
[0062]
3)任选地，切换所述第二流路通道与第一个孔连通，在泵阀一体件311的推力作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中。
[0063]
4)切换所述第二流路通道与第二个孔连通，在泵阀一体件311的推力作用下，通过液体切分器5的作用，pcr扩增后溶液与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性，然后变性后混合液进入阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样。
[0064]
5)在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管电泳系统21中进行分离。
[0065]
6)在泵阀一体件311的作用下，使水容纳装置4中的水将未进样的混合液推入废液袋13中。
[0066]
7)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7。
[0067]
8)任选地，切换所述第二流路通道先后与第三个孔和第一个孔连通，在泵阀一体件311的作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中。
[0068]
9)切换所述旋转分注阀312中的第二流路通道与第一个孔连通，在泵阀一体件311的作用下，使水容纳装置4的水对液体抽吸输送装置3及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0069]
在优选的实施方案中，该方法使用如本发明第一方面所述的其中液体抽吸输送装置3包括第一柱阀321、第二柱阀322、抽吸装置323、第一单向阀324和第二单向阀325的卡夹装置进行，该方法包括以下步骤：
[0070]
1)灌胶：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满缓冲液。
[0071]
2)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与pcr扩增区2连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入pcr扩增区2进行pcr扩增，之后pcr扩增后溶液进入所述抽吸装置323中。
[0072]
3)任选地，关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中。
[0073]
4)关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与液体切分器5连通，在抽吸装置323的推力作用下，通过液体切分器5的作用，pcr扩增后溶液
与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性，然后变性后混合液进入阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样。
[0074]
5)在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管电泳系统21中进行分离。
[0075]
6)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与水容纳装置4连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使水容纳装置4中的水进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与液体切分器5连通，在抽吸装置323的推力作用下，将未进样的混合液推入废液袋13中。
[0076]
7)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7。
[0077]
8)任选地，打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与pcr扩增区2连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使pcr扩增后溶液进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中。
[0078]
9)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与水容纳装置4连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使水容纳装置4中的水进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，使水对流经元件及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0079]
在具体操作过程中，上述所有方法中的步骤5)和步骤6)必须依次进行，步骤b)(在需要进行此步骤的情况下)和步骤7)必须依次进行。在具体实施方案中，步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤b)和步骤7)可以先后进行，也可以在进行步骤4)的同时依次进行步骤5)、步骤6)、步骤b)和步骤7)或依次进行步骤b)、步骤7)、步骤6)和步骤6)，也可以先进行步骤5)和步骤6)，和/或步骤b)和步骤7)，再进行步骤4)。优选地，在进行步骤4)的同时依次进行步骤5)、步骤6)、步骤b)和步骤7)。优选地，在连续检测的情况下，下一次检测的步骤1)也可以与上一次检测的步骤5)、步骤6)、步骤b)和步骤7)中的一步或多步同时进行，以提高设备的检测效率。
[0080]
在优选的实施方案中，待检测样本为依次包括以下溶液的层状液体混合物：第一稀洗液、第一隔离液、pcr扩增样本、第二隔离液、浓洗液、第三隔离液、第二稀洗液，其中
[0081]
第一隔离液、第二隔离液和第三隔离液彼此独立地选自矿物油中的一种或多种，优选为运动粘度为10-14厘沱的矿物油，其为无色半透明状液体，不溶于水和乙醇，可与乙醚、石油醚以及油溶染料混溶。
[0082]
第一稀洗液和第二稀洗液彼此独立地选自乙醇溶液或去离子水，所述乙醇溶液优选为95％乙醇，优选ar级别乙醇；所述去离子水优选为双蒸水。
[0083]
浓洗液为dna强氧化液，优选为次氯酸钠溶液，优选质量分数为5％-10％的次氯酸钠溶液。
[0084]
pcr扩增样本中包含模板、酶(如taq酶)、引物、dntp(脱氧核糖核苷三磷酸)和缓冲液(如含有mg
2+
、k
+
等的缓冲液，例如100mm kcl溶液)。其中使用的模板、酶、引物和缓冲液包括目前pcr扩增和检测中通常使用的模板、酶、引物和缓冲液，并且其中的引物进行了荧光基团标记。
[0085]
在此实施方案中，进行上述所有检测方法实施方案中的步骤a)和步骤b)，即在检测过程中，所述层状液体混合物中仅pcr扩增样本液段进行后续毛细电泳分析，pcr扩增样本液段之前及之后的液段均在液体抽吸输送装置3的作用下，进入废液袋13中，并同时完成对pcr扩增区2和流经元件及管道的清洗。
[0086]
在优选的实施方案中，所述检测方法在同一卡夹装置中连续进行200-500次。优选地，所述检测方法在同一卡夹装置中连续进行200-400次，更优选地进行200-300次，进一步优选地进行200次。
[0087]
本发明具有以下优点：
[0088]
1)本发明的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置为一体式的管道封闭卡夹，因此高浓pcr产物污染源得到了有效控制，避免了实验室测试间的交叉污染；
[0089]
2)本发明的卡夹装置同时将毛细管电泳分析的试剂内置其中，因此可支持多次重复测试，充分保证了卡夹的上机连续测试数，降低了单次测试成本，提高了临床推广的可能性；
[0090]
3)本发明的卡夹装置可支持一台仪器上同时柔性插入多个卡夹，提高了整台仪器的测试通量；
[0091]
4)本发明的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置和方法省去了pcr扩增与毛细管电泳分析间的人工介入，提高了测试效率；
[0092]
5)本发明的卡夹装置中采用的是单道式毛细管电泳分析，有效避免了当下多道式毛细管电泳分析检测时测试批间的信号干扰，大大提高了仪器的灵敏度与分辨率；
[0093]
6)本发明中首次提出在进行pcr扩增之前使待检测样本进行负压除气，有效避免了待检测样本中各液段在变性过程中由于高温析出气泡而造成溶液分段影响扩增效率的情况，并且还可以使后续pcr扩增区2容纳更多的待检测样本，大大提高了仪器的扩增效率。
附图说明
[0094]
图1为本发明集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置示意图。
[0095]
图2为本发明实施例1中所述的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置示意图。
[0096]
图3为本发明实施例3中所述的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置示意图。
[0097]
其中各附图标记具有以下含义：
[0098]
1-负压除气缓冲装置，2-pcr扩增区，3-液体抽吸输送装置，311-泵阀一体件，312-旋转分注阀，321-第一柱阀，322-第二柱阀，323-抽吸装置，324-第一单向阀，325-第二单向阀，4-水容纳装置，5-液体切分器，6-阴极电极，7-阴极池，8-压电泵，9-缓冲液容纳装置，10-阳极池，11-阳极电极，12-溢流胶袋，13-废液袋，14-胶盒，15-检测窗，16-毛细管温度控制单元，17-毛细管，18-温控区，19-待检测样本入口，20-电泳分析试剂容纳装置，21-毛细管电泳系统。
具体实施方式
[0099]
下面结合实施例和附图进一步详述本发明，但应理解，实施例仅为示例性的，而非
限制性的。
[0100]
实施例1
[0101]
如图2所示的一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置，其包括顺序连接并流路连通的待检测样本入口19、负压除气缓冲装置1、pcr扩增区2、液体抽吸输送装置3、液体切分器5、温控区18和毛细管电泳系统21，其中
[0102]
所述液体抽吸输送装置3包括泵阀一体件311和旋转分注阀312；其中所述泵阀一体件311包括控制其是否与大气连通以及是否与所述水容纳装置4连通的旋转阀，以及与所述旋转阀气路连通的柱塞泵；所述旋转分注阀312在四个方向上开有四个孔，第一个孔连通所述废液袋13，第二个孔连通所述液体切分器5，第三个孔连通所述pcr扩增区2，第四个孔通过所述泵阀一体件311连通所述水容纳装置4；所述旋转分注阀312中包括在阀芯处相通的两条流路通道，其中第一流路通道固定与第四个孔连通，第二流路通道通过阀芯的旋转切换与第一个孔、第二个孔和第三个孔之一连通；所述液体抽吸输送装置3还分别连通水容纳装置4和废液袋13；
[0103]
所述毛细管电泳系统21包括顺序连接并流路连通的阴极池7、毛细管组件、阳极池10和胶盒14；所述毛细管组件包括毛细管17、设置在所述毛细管17外壁周围的毛细管温度控制单元16和设置在所述毛细管17外壁上的检测窗15，所述检测窗15处设置有光学检测组件；所述阴极池7还分别连通所述温控区18和缓冲液容纳装置9且所述阴极池7上设置有两个阴极电极6；所述阳极池10还连通溢流胶袋12且所述阳极池10上设置有阳极电极11；
[0104]
其中所述胶盒14、所述电泳分析试剂容纳装置20和所述缓冲液容纳装置9均连接有可使其中内含物向外输送的动力装置。
[0105]
其中，所述待检测样本入口19与卡夹装置外部的样品加注器连接。
[0106]
所述pcr扩增区2中采用连续流动式pcr装置。
[0107]
所述毛细管17可以为polymicro technologiespt公司生产的弹性熔融石英毛细管。毛细管17直接呈直线型设置且一个毛细管组件内部仅设置有一根毛细管17。毛细管温度控制单元16包括加热元件、温度传感器和保温元件等，其中温度传感器用于实时反馈毛细管17的温度。
[0108]
其中，所述动力装置为在所述阴极池7和所述缓冲液容纳装置9之间设置的压电泵8，且所述胶盒14和电泳分析试剂容纳装置20均连接有柱塞杆，所述柱塞杆受外力挤压后将各液体挤压出来。
[0109]
实施例2
[0110]
采用如实施例1所述的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置进行检测的方法，该方法包括以下步骤：
[0111]
1)灌胶：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满缓冲液。其中，灌胶过程重复多次完成并且在每次灌胶后均用缓冲液冲洗阴极池7，另外，灌胶和冲洗先后进行。其中，使用的缓冲液为0.5xtbe缓冲液，其含有0.045mol/l tris-硼酸和0.001mol/l edta(ph 8.0)，使用的凝胶为pop-7。
[0112]
2)切换所述旋转分注阀312中的第二流路通道与第三个孔连通，在泵阀一体件311的抽吸作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入负压除气缓冲装置1进行负压脱气，再进入pcr扩增区2进行pcr扩增，之后pcr扩增后溶液进入所述第二流路通道中。
[0113]
3)切换所述第二流路通道与第一个孔连通，在泵阀一体件311的推力作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中。
[0114]
4)切换所述第二流路通道与第二个孔连通，在泵阀一体件311的推力作用下，通过液体切分器5的作用，pcr扩增后溶液与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性，然后变性后混合液进入阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样。
[0115]
其中所述待检测样本为依次包括以下溶液的层状液体混合物：第一稀洗液、隔离液、pcr扩增样本、隔离液、浓洗液、隔离液、第二稀洗液，其中隔离液为运动粘度为10-14厘沱的矿物油，第一稀洗液为双蒸水且第二稀洗液为95％乙醇，浓洗液为5％的次氯酸钠溶液。pcr扩增样本中包含模板、taq酶、引物、dntp和100mm mgcl2溶液。每次进样的待检测样本中pcr扩增样本的体积为20μl，进入液体切分器5的pcr扩增后溶液的体积为1μl。
[0116]
5)在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管电泳系统21中进行分离。在分离过程中，毛细管温度控制单元16为毛细管17提供可靠稳定的温度环境，整个分离过程在检测窗15处通过光学检测组件中激光诱导荧光系统完成检测。
[0117]
6)在泵阀一体件311的作用下，使水容纳装置4中的水将未进样的混合液推入废液袋13中。
[0118]
7)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7。
[0119]
8)切换所述第二流路通道先后与第三个孔和第一个孔连通，在泵阀一体件311的作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中。
[0120]
9)切换所述旋转分注阀312中的第二流路通道与第一个孔连通，在泵阀一体件311的作用下，使水容纳装置4的水对液体抽吸输送装置3及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0121]
上述检测方法在进行步骤5)的同时依次进行步骤6)、步骤7)、步骤8)和步骤9)且上述检测方法在同一卡夹装置中连续进行200次才更换设备中的耗材卡夹装置。
[0122]
实施例3
[0123]
如图3所示的一种集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置，其包括顺序连接并流路连通的待检测样本入口19、负压除气缓冲装置1、pcr扩增区2、液体抽吸输送装置3、液体切分器5、温控区18和毛细管电泳系统21，其中
[0124]
所述液体抽吸输送装置3包括第一柱阀321、第二柱阀322、抽吸装置323、第一单向阀324和第二单向阀325，其中所述第一柱阀321一测可切换连接pcr扩增区2和水容纳装置4，另一侧顺序通过流路连接第一单向阀324、第二单向阀325和第二柱阀322的一侧，所述第二柱阀322的另一侧可切换连接废液袋13和液体切分器5，所述第一单向阀324和第二单向阀325之间连接有抽吸装置323。其中所述抽吸装置323是小型注射器。
[0125]
所述液体切分器5还连通电泳分析试剂容纳装置20；
[0126]
所述毛细管电泳系统21包括顺序连接并流路连通的阴极池7、毛细管组件、阳极池
10和胶盒14；所述毛细管组件包括毛细管17、设置在所述毛细管17外壁周围的毛细管温度控制单元16和设置在所述毛细管17外壁上的检测窗15，所述检测窗15处设置有光学检测组件；所述阴极池7还分别连通所述温控区18和缓冲液容纳装置9且所述阴极池7上设置有两个阴极电极6；所述阳极池10还连通溢流胶袋12且所述阳极池10上设置有阳极电极11；
[0127]
其中所述胶盒14、所述电泳分析试剂容纳装置20和所述缓冲液容纳装置9均连接有可使其中内含物向外输送的动力装置。
[0128]
其中，所述待检测样本入口19与卡夹装置外部的样品托盘连接。
[0129]
所述pcr扩增区2中采用连续流动式pcr装置。
[0130]
所述毛细管17可以为polymicro technologiespt公司生产的弹性熔融石英毛细管。毛细管17直接呈直线型设置且一个毛细管组件内部仅设置有一根毛细管17。毛细管温度控制单元16包括加热元件、温度传感器和保温元件等，其中温度传感器用于实时反馈毛细管17的温度。
[0131]
其中，所述动力装置为在所述阴极池7和所述缓冲液容纳装置9之间设置的压电泵8，且所述胶盒14和电泳分析试剂容纳装置20均连接有柱塞杆，所述柱塞杆受外力挤压后将各液体挤压出来。
[0132]
实施例4
[0133]
采用如实施例3所述的集pcr扩增与毛细管电泳分析于一体的卡夹装置进行检测的方法，该方法包括以下步骤：
[0134]
1)灌胶：在动力驱动下将凝胶由胶盒14注入阳极池10中，然后通过快速挤压阳极池10中的凝胶，完成毛细管17的灌胶过程，其中阳极池10溢出的凝胶进入溢流胶袋12中，毛细管17溢出的凝胶进入废液袋13中，然后在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液将溢出到阴极池7中的凝胶冲到废液袋13中并通过两个阴性电极6的反馈保证阴极池7中充满缓冲液。其中，灌胶过程重复多次完成并且在每次灌胶后均用缓冲液冲洗阴极池7，另外，灌胶和冲洗先后进行。其中，使用的缓冲液为0.5xtbe缓冲液，其含有0.045mol/l tris-硼酸和0.001mol/l edta(ph 8.0)，使用的凝胶为pop-7。
[0135]
2)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与pcr扩增区2连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，待检测样本从待检测样本入口19进入负压除气缓冲装置1进行负压脱气，再进入pcr扩增区2进行pcr扩增，之后pcr扩增后溶液进入所述抽吸装置323中。
[0136]
3)关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，将pcr扩增后溶液的前段部分推入废液袋13中。
[0137]
4)关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与液体切分器5连通，在抽吸装置323的推力作用下，通过液体切分器5的作用，pcr扩增后溶液与电泳分析试剂按比例混合后进入温控区18进行加热变性，然后变性后混合液进入阴极池7中并通过两个阴性电极6的反馈完成混合液的定时间进样。
[0138]
其中所述待检测样本为依次包括以下溶液的层状液体混合物：第一稀洗液、隔离液、pcr扩增样本、隔离液、浓洗液、隔离液、第二稀洗液，其中隔离液为运动粘度为10-14厘沱的矿物油，第一稀洗液为95％乙醇且第二稀洗液为双蒸水，浓洗液为10％的次氯酸钠溶
液，pcr扩增样本中包含模板、taq酶、引物、dntp和100mm kcl溶液。每次进样的待检测样本中pcr扩增样本的体积为15μl，进入液体切分器5的pcr扩增后溶液的体积为1.2μl。
[0139]
5)在毛细管电泳系统21中阳极电极11与阴极电极6的共同作用下，所述混合液进入毛细管电泳系统21中进行分离。在分离过程中，毛细管温度控制单元16为毛细管17提供可靠稳定的温度环境，整个分离过程在检测窗15处通过光学检测组件中激光诱导荧光系统完成检测。
[0140]
6)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与水容纳装置4连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使水容纳装置4中的水进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与液体切分器5连通，在抽吸装置323的推力作用下，将未进样的混合液推入废液袋13中。
[0141]
7)在动力驱动下使缓冲液容纳装置9中的缓冲液充满阴极池7。
[0142]
8)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与pcr扩增区2连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使pcr扩增后溶液进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，将剩余的pcr扩增后溶液推入废液袋13中。
[0143]
9)打开第一单向阀324，关闭第二单向阀325并切换所述第一柱阀321使其一侧与水容纳装置4连通，在抽吸装置323的抽吸作用下，使水容纳装置4中的水进入所述抽吸装置323中；关闭第一单向阀324，打开第二单向阀325并切换所述第二柱阀322使其一侧与废液袋13连通，在抽吸装置323的推力作用下，使水对流经元件及管道进行清洗，并将清洗后的废液推入废液袋13中，为下一次检测做准备。
[0144]
上述检测方法中步骤5)、步骤6)、步骤7)、步骤8)和步骤9)依次进行且上述检测方法在同一卡夹装置中连续进行300次才更换设备中的耗材卡夹装置。
[0145]
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。