一种筛选最佳绿藻组合混合培养的方法与流程

本发明属于藻类生物技术领域，具体涉及一种筛选最佳绿藻组合混合培养的方法。该方法涉及到羊角月牙藻（selenastrumcapricornutum）和蛋白核小球藻（chlorellapyrenoidosa）两种藻。

背景技术：

绿藻是一类种类繁多、分布广泛、营养丰富、细胞形态多样、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。尤其在环境保护领域具有显著的作用，绿藻作为水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作用，是反映水体环境质量的重要指标。羊角月牙藻（selenastrumcapricornutum）、蛋白核小球藻（chlorellapyrenoidosa）因其个体小、繁殖快、敏感度高等特点，是目前水生生态毒理学研究中生物毒性测试中常用的藻种。同时，污水中高浓度的氮和磷是绿藻生长的必要元素，利用绿藻处理城市生活污水，能降低污染物含量的同时收获含有绿藻单细胞的饲料，具有成本低、经济效应好等特点。

然而，现有技术中藻的培养主要是以单一藻种类培养模式为主，即使通过寻找合适藻生长繁殖的最佳条件如温度、光照、营养盐和培养方式等因素进行藻类培养，但仍然未能达到高密度的培养效果，这就直接影响继续扩繁成功率及使用效果；同时单一藻种培养不适于污水体系，污水体系里的杂藻、原生动物等能够降低单一藻种的生产效率甚至使培养系统崩溃。选择合适的绿藻进行混合培养能够达到预想的培养效果。目前关于微藻混合培养的研究多集中于水华微藻生长抑制，而关于获取高密度绿藻混合培养模式的研究鲜有报道。因此，提供一种易操作、实用性强、生态环保的多种藻种混合培养最佳组合筛选方法，实现高效率且高密度绿藻培养效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种筛选最佳绿藻组合混合培养的方法。使之能够实现高密度绿藻培养的效果。

具体步骤为：

（1）藻种纯培养：购买藻种，并准备好相对应的培养基；收到藻种后，在无菌操作下将5~10ml藻种直接转入250ml的锥形瓶中，并加入已配置好的新鲜培养基定容至100ml，封好瓶口，放置在光照培养箱内培养，每隔2~3d按1:1稀释转接藻种，接转至3代后作为试验用藻；每次接种时先在显微镜下观察藻种生长情况。

（2）藻种混合培养设计：两个藻种组合实验共设置3个处理组和2个对照组，并设置实验中的每个藻种处理3个平行，在两个藻种混合体系中，设定纯培养与混合培养的相同细胞初始总密度。

（3）藻种混合培养：选择步骤（1）得到的纯培养条件下处于对数生长期的两种试验用藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用培养基稀释保证两种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养。

（4）测定混合培养藻种相关指标：自接种日次日起为第一天，每次测定应在同一时间点，分别测定藻细胞密度、叶绿素a、吸光值和生物量4个指标。

（5）筛选最佳组合：依据步骤（4）测定的相关指标结果，并与对照组比较，筛选出藻细胞密度大、叶绿素a含量高、吸光值大、生物量大的为最佳组合。

所述步骤（1）中藻种具体指羊角月牙藻和蛋白核小球藻，光照培养箱培养条件为培养温度25℃，光照条件1000~2000lux，时间设置12hr昼:12hr夜。

所述步骤（2）中的3个处理组指的是按3个不同比例而设置的，2个对照组分别指的是在相同条件下，纯培养的羊角月牙藻及纯培养的蛋白核小球藻。

所述步骤（3）中两种藻的初始接种藻细胞浓度为5×10⁵个/ml。

所述步骤（4）中测定藻细胞密度用血球计数板测定绿藻的藻细胞密度；叶绿素a的测定方法为乙醇-超声法；吸光值采用紫外可见分光光度计uv9000s测定；生物量采用干重法测定。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种操作简单、实用性强、生态环保的筛选最佳绿藻组合混合培养的方法；该方法具有培养速度快，培养稳定性好。

（2）本发明可实现高密度、低成本培养绿藻，培养后的绿藻具有活性，可大量繁殖。

附图说明

图1为本发明实施例中不同比例sc-cp混合培养中各组分的细胞密度图。

图2为本发明实施例中不同比例sc-cp混合培养中各组分的叶绿素a含量图。

图3为本发明实施例中不同比例sc-cp混合培养中各组分的吸光值图。

图4为本发明实施例中不同比例sc-cp混合培养中各组分的生物量图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，以及所用仪器的厂商说明书。其中，藻种购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库（fachb），羊角月牙藻及蛋白核小球藻的编号分别为【fachb-271】、【fachb-5】。

实施例：

1.1配制培养基：羊角月牙藻（sc）、蛋白核小球藻（cp）两种绿藻的纯培养及混合培养均采用bg11培养基，其配方见表1。按照表1的配方配制bg11培养基配方，其制备方法为：将表1中的成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000ml容量瓶中，密封并贴好标签，并用蒸馏水定容至1000ml，在121℃、101kpa下灭菌20min，灭完菌冷却后，置于4℃冰箱保存，有效期2个月。

表1bg11培养基配方

注：使用1mnaoh或hcl将ph调至7.1。

1.2藻种纯培养：购买藻种且收到藻种后，将试管内的藻液摇匀，在无菌操作下将各藻种（5~10ml）直接转入250ml的锥形瓶中,并加入已配置好的新鲜培养基定容至100ml，封好瓶口，放置在光照培养箱内培养，并将光照培养箱设置培养温度25℃，光照条件1000~2000lux，时间设置12hr昼:12hr夜，每隔2~3d按1:1稀释转接藻种，在藻类细胞代谢最旺盛时期接种（上午10~11时左右）反复接种2~3次，每天分三个阶段，定时用手摇动一次，待藻类基本达到同步生长阶段，并处于对数生长期时，作为试验用藻。每次接种时先在显微镜下观察藻种生长情况。

1.3确定初始接种藻细胞浓度：用血球计数法，将处于对数生长期的羊角月牙藻、蛋白核小球藻在纯培养下的原液在显微镜下数藻细胞计数，每种藻计数不少于三次，取平均值，并用bg11培养基将原藻液稀释到同一藻细胞浓度为5×10⁵个/ml。

1.4藻种混合培养设计：羊角月牙藻（sc）与蛋白核小球藻（cp）两种藻组合实验共设置3个处理组和2个对照组，并设置实验中的每个处理3个平行，在sc-cp混合体系中，设定混合培养与纯培养的初始总密度同为5×10⁵个/ml，且培养总体积同为120ml，其具体设计如表2。

表2两种绿藻混合培养实验处理

1.5藻种混合培养：在无菌操作下，将纯培养条件下已确定好初始接种藻细胞浓度为5×10⁵个/ml的sc与cp两种藻，再按已设计好的比例均匀混合，共设置3个处理组和2个对照组，并设置实验中的每个处理3个平行，置于250ml的锥形瓶中培养，封好瓶口，同样置于光照培养箱中培养，且培养箱设置的培养条件与纯培养的条件相同，并且每天分三个阶段，定时用手摇动一次，交叉调换瓶的位置，使其光照均匀，培养至15d。

1.6测定混合培养藻种相关指标

1.6.1藻细胞密度的测定

用血球计数板测定绿藻的藻细胞密度。取混合均匀的藻液1ml，然后滴加1%的鲁格试剂进行固定，混合均匀后用血球计数板测定单位体积下各绿藻的藻细胞密度，每个样品测定三次，计算平均值，得到每个样品的藻细胞密度。自接种日次日起为第一天，每隔一天测定计数一次，每次计数应在同一时间点。其结果见图1。

1.6.2叶绿素a的测定

用乙醇-超声法。自接种日次日起为第一天，共测3次，分别为第5d、第10d、第15d。取混合均匀的藻液20ml，然后将所得的藻液在10000r.min^-1离心10min，离心后倒掉上清液。然后加入95%的乙醇溶液，超声破碎20min，然后避光24h,避光后将超声破碎液在10000r.min^-1离心10min，将离心后的上清液倒入比色皿中，测定665nm，649nm的吸光度，利用以下公式测定叶绿素a的含量，测定叶绿素a的单位为mg.l^-1。其结果见图2。

chla=13.95×od665-6.88×od649(1)

1.6.3吸光值的测定

应用紫外可见分光光度计对羊角月牙藻、蛋白核小球藻两种藻进行全波扫描，其吸收峰均在680-684nm之间，本实施例取681nm,取3ml混合均匀藻液，用紫外分光光度计测量其od值。自接种日次日起为第一天，每隔一天测定计数一次，每次计数应在同一时间点。其结果见图3。

1.6.4生物量的测定

将0.22μm滤膜放入培养箱先进行烘干，测定烘干后测定滤膜的质量为w0。取培养第15d的藻液5ml，经过0.22μm烘干滤膜过滤后，将滤膜放入80℃恒温培养箱中进行烘干，测定烘干后滤膜质量为

w1。单位体积下每一种藻的生物量w=200×(w1-w0)，测得生物量的单位为g·l^-1。其结果见图4。

1.7筛选最佳组合

依据测定指标结果，并与对照组比较进而筛选最佳组合。

由图1~4结果可知，羊角月牙藻与蛋白核小球藻在适当的条件下以适宜的接种比例混合培养，混合培养体系中的藻细胞密度、叶绿素a、吸光值、生物量相对于纯培养都有所提高，羊角月牙藻、蛋白核小球藻的生长受到了不同程度的相互促进作用，且蛋白核小球藻成为了优势群种。其中，当羊角月牙藻与蛋白核小球藻的混合比例为40:80时，混合培养过程中的藻细胞密度、叶绿素a、吸光值、生物量达到最大值，则筛选的最佳组合为羊角月牙藻与蛋白核小球藻的混合比例为40:80的组合。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，只为说明本发明的技术构思及特点，并非对本发明做任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。其目的在于让任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。