非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法与流程

本发明属于mirna检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的方法。

背景技术：

微小rna(mirna)是一类内源性非编码rna小分子，广泛存在于真核生物中，参与细胞的发育、分化、增殖与凋亡等生物学过程。作为基因表达的调控者，通过与其靶基因3端非翻译区不完全匹配结合进而抑制靶基因翻译，并调控着机体内三分之一以上基因的表达。最近的研究表明，mirna的显着异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤、病毒感染、神经退行性疾病密切相关。因此mirna的早期检测和辅助诊断已经成为现今的研究热点。

poly(a)通常是指位于mrna上的150-200个腺嘌呤核糖核苷酸碱基残基，由于此发现，人们研究重组了一种poly(a)聚合酶，poly(a)聚合酶是通过atp转化的amp在rna3’尾巴端添加一段长的腺嘌呤核糖核苷酸碱基序列，本反应不依赖于模板的存在。poly(a)聚合酶加尾技术，除了能提供更多的mirna检测方法外，还能提高mirna的稳定性，保护其降解，提高检测的重复性。atp生物发光技术因其无需外界光源刺激、不需要培养、操作简便、重现性好、快速完成检测等特点广泛的应用。amp和atp之间通过酶和辅料的作用可以实现amp-adp-atp的转换，结合荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测。所以本发明拟结合使用纳米磁珠结合分子茎环探针技术，特异性的将目标mirna从复杂基质中分离出来，通过poly(a)聚合酶，对mirna进行加尾，同时提供了更多可用于检测的腺嘌呤核糖核苷酸碱基，经过核酸外切酶t的作用切割成amp，用于生物循环发光检测，实现信号的级联放大效应，制备一种基于polya加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种非诊断目的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种非诊断目的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的方法，包括下述步骤：

1)高特异性的磁球探针的制备:将链霉亲和素化的磁球与生物素化的分子茎环探针进行孵育反应得到；

2)磁球探针结合分离目标mirna:将步骤1)得到的磁球探针加入到待测样品中进行反应，磁分离纯化去除上清液，出去非目标rna分子；

3)poly(a)加尾放大信号：poly(a)聚合酶协同poly(a)聚合酶缓冲溶液针在步骤2)得到结合有目标mirna的磁球探针上进行聚合反应，在mirna的3’羟基末端延伸出重复的腺嘌呤核糖核苷酸序列，实现信号放大；

4)生物循环发光信号放大：核酸外切酶t对磁球上结合的腺嘌呤核糖核苷酸序列进行切割反应，形成amp；通过加入腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、脱氧胞嘧啶三磷酸和磷烯醇丙酮酸谷氨酸，可以实现amp-adp-atp的转换，结合荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，通过收集生物发光信号强度的变化即可实现mirna的超灵敏定量检测。

所述的生物素化的分子茎环探针的碱基序列号为5’-caacatcagtctgataagctaactgatgtccgg-bio-3’。

步骤1)的具体步骤为：采用链霉亲和素化的磁球磷酸缓冲溶液洗涤，接着加入生物素化的分子茎环探针(hdna)进行孵育反应一段时间，孵育结束后磁分离重悬；其中，磷酸缓冲溶液pbs浓度范围为0.005-0.02m，pbs体积是50-100μl；链霉亲和素化磁珠和生物素化hdna的摩尔配比为1:200-500，孵育反应时间为60-120min,孵育结束后，磁分离洗涤3-5次，除去未反应的hdna，得到hdna标记的高特异性磁球探针，磁分离洗涤后，重悬溶液为pbs，重悬体积为50-100μl。

步骤2)的具体步骤为：磁球探针的加入量为4-10μg，固定于96孔化学发光板中，待测样本体积为5-15μl，加入的pbs体积为10-20μl，磁球探针结合分离目标mirna反应温度为37℃-50℃，反应时间为20-45min，磁分离洗涤3-5次，洗涤溶液为pbst，重悬溶液为pbs，重悬体积为10-40μl。

步骤3)的具体步骤为：poly(a)聚合酶的加入量为0.5-3u，poly(a)聚合酶缓冲溶液的加入量为2-5μl，poly(a)加尾放大信号反应的温度为在37℃-50℃，反应时间为25-50min。

步骤4)的具体步骤为：核酸外切酶t的加入量为0.5-3u，反应温度为20℃-40℃，腺苷酸激酶和丙酮酸激酶的加入量为0.5-3u，脱氧胞嘧啶三磷酸和磷烯醇丙酮酸谷氨酸的加入量为0.05-0.5mm,生物发光信号为荧光素酶检测体系，包含0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶,生物循环发光信号收集时间为2-20min，通过相应时间内的生物发光信号累积与相应mirna浓度的关系，建立此发明检测技术的标准曲线。

本发明还包括一种试剂盒，包括所述的磁球探针、poly(a)聚合酶协同poly(a)聚合酶缓冲溶液、核酸外切酶t、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、脱氧胞嘧啶三磷酸和磷烯醇丙酮酸谷氨酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.显著提高mirna的检测灵敏度。主要通过放大检测信号，降低背景噪音两方面的有机结合，即以poly(a)特异性加尾提供更多待检测的腺嘌呤核糖核苷酸，用于生物循环发光检测；通过生物发光作为检测信号，生物发光无需额外光激发的特点克服了背景噪音的干扰；从而显著提高了检测的灵敏度。

2.实现血清中mirna的快速、灵敏直接检测，针对血清样品，无需额外的提取步骤。

3.实现样品中mirna的高效特异性检测，通过分子茎环探针与磁球的协同作用，可以从待测样品中高特异性的分离出待检mirna，实现高特异性检测。

附图说明

图1为非诊断目的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的方法检测原理示意图；

图2为基于磁球探针poly(a)加尾反应流式表征结果图；

图3制备的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的灵敏度实验图；

图4制备的基于poly(a)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测mirna的特异性实验图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的试剂盒检测mirna原理如图1所示，首先将亲和素化的磁球与生物素化的dna分子茎环探针结合，制备高特异性的磁球探针。在有目标物存在的情况下，首先，磁球探针可以高效特异性的从临床样本中富集待检样本中的目标mirna，mirna结合到磁球探针上；接着，通过poly(a)加尾技术，在目标mirna的3’羟基末端延伸出重复的腺嘌呤核糖核苷酸序列如图2所示，可以观察得到，不存在目标mirna时，poly(a)加尾步骤不会发生；最后，经过核酸外切酶作用切割成amp，amp和atp之间通过酶和辅料的作用可以实现amp-adp-atp的转换，结合荧光素酶检测体系，从而实现循环生物发光，实现mirna的超灵敏检测，检测灵敏度曲线结果如图3所示，其灵敏度可以达到am级别。当不存在目标物的情况下，磁球探针无法从样本中结合到目标物质，因此后续反应无法进行，不产生生物发光信号，检测特异性结果如图4所示，特异性良好，不与非目标mirna结合形成生物发光信号。本试剂盒中所用到的引物及dna、rna序列均由上海生工合成。

特异性hdna的设计：通过对目标mirna的序列分析，根据配对tm温度值和△g能量值的差异，创造性的设计特异性的hdna茎环探针。mirna配对tm温度值为57℃，△g能量值为-12.3，因此设计的hdna探针tm值高于57℃，△g能量值应高于-12.3，hdna探针可以高效特异的结合目标mirna。使用单碱基错配的mirna以及样品可能存在的其他非目标mirna，对hdna的特异性进行评价，选择特异性最好的hdna。其中用到的核酸序列如表1示出：

表1

本发明的实施过程步骤如下：

(1)精确称量链霉亲和素化磁球，用移液枪取定量的生物素化hdna溶于100ul的pbs反应溶液，混合溶液于2ml的ep管中，ep管放在旋转培养器上，调制旋转培养器转速约50r/min，室温旋转约1.5-2h。然后将上述液体转入1.5ml的尖头ep管，充分收集沉淀物，离心，洗涤获得磁球探针，磁球探针固定在化学发光板中。

(2)poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；高特异性磁球探针的制备：将链霉亲和素化的磁球用0.01m的磷酸缓冲溶液(pbs)洗涤三次，然后加入hdna，其中磁球和hdna按照摩尔比1:200-500比例在500ul的0.01mpbs中反应2h；反应结束后，采用磁力架进行分离纯化，用含0.2％-2％吐温的0.01mpbs(pbst)至少洗涤三次，除去未反应的hdna，得到hdna标记的高特异性磁球探针。

(3)poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；poly(a)加尾放大信号实验操作步骤：将高特异性磁球探针加入到96孔化学发光板中、待检mirna和磁球探针按照体积比1-3:1混合于pbs中，放置到在培养箱中，在37℃-50℃反应20-45min后，磁分离纯化除去上清，此步骤可以除去非目标rna分子。磁分离结束后，加入10-25μl的pbs进行重悬，混匀后加入0.5-3u的poly(a)聚合酶及poly(a)聚合酶缓冲液，摇床低速震荡使其混匀，然后将上述混合溶液置于培养箱中，在37℃-50℃下反应25-50min，反应结束后，用0.01m；

(4)poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；生物循环发光信号放大实验操作步骤如下：在步骤3)的基础上，加入0.5-3u核酸外切酶t，反应温度为20℃-40℃条件下反应30-60min后，核酸外切酶t对磁球上结合的腺嘌呤核糖核苷酸序列进行切割，形成amp。通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，可以实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，通过2-20min的信号收集，此间生物发光信号累积与相应mirna浓度的关系，建立此发明检测技术的标准曲线，实现mirna的超灵敏定量检测。

实施例1:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；磁球探针加入量的优化：用移液枪取含10^-11m的mirna待检样品，分别加入0、1、2、3、4、5、6、7μg制备好的磁球探针，与待检样品作用后，磁分离洗涤，加入poly(a)酶反应体系，在目标mirna存在的条件下，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2-20min间的生物发光累积信号，得出最佳的磁珠加入量。

实施例2:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；；poly(a)聚合酶加入量的优化：在化学发光板中加入适量的制备好的磁球探针，用移液枪加入含10^-11m的mirna待检样品，与待检样品作用后，磁分离洗涤，分别加入0.5、1、1.5、2、2.5、3upoly(a)酶及相应的poly(a)反应缓冲溶液，在目标mirna存在的条件下，反应25-50min，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2-20min间的生物发光累积信号，得出最佳的poly(a)酶加入量。

实施例3:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；poly(a)聚合酶反应时间的优化：在化学发光板中加入适量的制备好的磁球探针，用移液枪加入含10^-11m的mirna待检样品，与待检样品作用后，磁分离洗涤，分别加入适量的poly(a)酶及相应的poly(a)反应缓冲溶液，在目标mirna存在的条件下，反应20、30、40、50min，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2-20min间的生物发光累积信号，得出最佳的poly(a)聚合酶反应时间。

实施例4:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；生物循环发光信号收集时间的优化：在化学发光板中加入适量的制备好的磁球探针，用移液枪加入含10^-11m的mirna待检样品，与待检样品作用后，磁分离洗涤，分别加入适量的poly(a)酶及相应的poly(a)反应缓冲溶液，在目标mirna存在的条件下，反应合适时间，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2、4、6、8、10、12、14、16、18、20min间的生物发光累积信号，得出最佳的生物循环发光信号收集时间。

实施例5:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；绘制poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒检查区间标准曲线:在化学发光板中加入适量的制备好的磁球探针，用移液枪加入浓度梯度为10^-17、10^-16、10^-15、10^-14、10^-13、10^-12、10^-11、10^-10的目标mirna待检样品，磁球探针与待检样品作用后，磁分离洗涤，分别加入适量的poly(a)酶及相应的poly(a)反应缓冲溶液，在目标mirna存在的条件下，反应合适时间，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2-20min间的生物发光累积信号，绘制poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒检查区间标准曲线，结果如图3所示。

实施例6:poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒制备方法；poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒特异性评价：在化学发光板中加入适量的制备好的磁球探针，分别用移液枪加入浓度梯度为10^-14的目标mirna待检样品、及10^-11的单碱基错配mirna、完全错配mirna、mirna141、let-7d，磁球探针与待检样品作用后，磁分离洗涤，分别加入适量的poly(a)酶及相应的poly(a)反应缓冲溶液，在目标mirna存在的条件下，反应合适时间，长出poly(a)尾，在核酸外切酶的作用下生产amp，通过加入0.5-3u的腺苷酸激酶(ak)、0.5-3u丙酮酸激酶(pk)、0.05-0.5mm的脱氧胞嘧啶三磷酸(dctp)和0.05-0.5mm的磷烯醇丙酮酸谷氨酸(pep)，实现amp-adp-atp的转换，结合0.01-0.5mm的荧光素和0.1-1u的荧光素酶检测体系后实现atp的循环检测，收集2-20min间的生物发光累积信号，绘制poly(a)加尾及生物循环发光技术超敏检测mirna试剂盒特异性结果曲线，结果如图4所示。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。