敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用。
背景技术：
：口蹄疫(fmd)是一种高度传染性疾病，主要影响猪、牛、绵羊、山羊、鹿和其他偶蹄动物。口蹄疫的致病因子是口蹄疫病毒(fmdv)，属于小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒属。病毒基因组包含长度为8.5kb的正单链rna链，编码四种结构蛋白(vp1-vp4)，八种非结构蛋白(l，2a，2b，2c，3a，3b，3c以及3d)和一些切割中间体。病毒蛋白具有多种功能，可以通过许多不同的机制实现fmdv的传播和复制，并抵消宿主的抗病毒反应。tlr是一种i型跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸的重复序列结构域、胞内保守的toll/il-1受体结构域和跨膜结构域构成。tlrs是机体抵抗外界微生物入侵的第一道免疫防线，同时也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，属于模式识别受体家族。目前已鉴定tlrs有13种，其分布十分广泛，主要表达于各种免疫细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及小胶质细胞等。tlrs能识别包括细菌、病毒和真菌等在内的微生物，并能与它们的保守序列结合。一旦tlrs活化完成，一系列保守级联反应开始启动，并最终激活两个主要的细胞内转录因子：nf-κb和干扰素调节因子。toll样受体4(tlr4)属于模式识别受体(prr)家族。它们是高度保守的受体，可识别保守的病原体相关分子模式(pamp)，因此成为抵御感染的第一道防线。tlr4长期以来被认为是革兰氏阴性脂多糖(lps)的受体。此外，它还结合由组织损伤产生的内源性分子。因此，tlr4是一种关键受体，感染和非感染刺激都会诱导促炎反应。由外源或内源配体触发的tlr4介导的炎症也参与几种急性和慢性疾病，具有作为炎症反应的放大器的关键作用。tlr4的基因定位于9号染色体，主要分布于单核巨噬细胞，可以识别细菌脂多糖(lipopolysaccharide,lps)、细菌磷壁酸和宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heat-shockproteins,hsp)等。tlr4基因首次是在人类细胞表面被鉴定出，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，全长有2526bp的cds序列，包含三个外显子，在家畜中能够编码841个氨基酸。经过近几年的研究，发现更多的tlr4的生物学功能，主要包括诱导免疫炎性因子引发炎症反应、诱导畜禽机体的特异性免疫、协助机体清除体内病毒和与其他tlrs分子产生协同作用等(moltenimonica,gemmasabrina,rossetticarlo.theroleoftoll-likereceptor4ininfectiousandnoninfectiousinflammation.[j].mediatorsofinflammation,2016,2016.)。由于其功能大多均参与机体的免疫反应，因此其在畜禽机体内主要表达在单核巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞和骨髓单核细胞等参与宿主防御功能的细胞中。crispr-cas9基因编辑技术是继zfn和talen技术之后迅速发展起来的第三代基因组编辑技术，其是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr-cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定dna修饰的技术，在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。技术实现要素：本发明利用crispr-cas9基因编辑技术，获得敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系，所得细胞系可用于促进口蹄疫病毒复制。本发明具体采用以下技术方案：本发明提供一种敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系，该细胞系的保藏编号为cctccno：c2019174。本发明还提供一种敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，将含有sgrna的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞，经抗性筛选得到所述tlr4基因敲低的细胞系；所述sgrna由seqidno.1～2所示核苷酸序列退火得到。进一步地，敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法具体包括以下内容：步骤1：根据猪源tlr4基因序列设计sgrna引物f和sgrna引物r；所述sgrna引物f的核苷酸序列如seqidno：1所示，sgrna引物r的核苷酸序列如seqidno：2所示；步骤2：酶切慢病毒载体，将sgrna引物f和sgrna引物r退火得到sgrna，将酶切后的慢病毒载体和sgrna连接，所述慢病毒载体为pgl-u6-grna；步骤3：将步骤2得到的重组慢病毒载体进行包装；步骤4：将步骤3得到的慢病毒感染猪肺泡巨噬细胞，筛选获得敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系。进一步地，所述sgrna引物f和sgrna引物r退火的反应体系为：sgrna引物f1μl，sgrna引物r1μl，退火buffer48μl；反应程序：90℃，4min，70℃，10min，37℃，20min，10℃，20min。本发明还提供一种用于敲低tlr4基因表达的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括上述的sgrna。上述敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系可用于促进口蹄疫病毒复制。本发明的有益效果在于：1、本发明构建了用于敲低pam细胞tlr4基因的sgrna引物对，与对照引物对相比，该引物对的敲低效率显著。2、与未敲低的细胞系相比，本发明制备的敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2～3倍。附图说明图1为三对sgrna引物构建的sgrna的敲低效果图。图2为prk-ha-tlr4质粒的剂量依赖性降解vp3蛋白。图3为过表达tlr4的pam细胞感染fmdv后fmdv的3d基因表达情况。图4为过表达tlr4的pam细胞感染fmdv后细胞中vp3的蛋白含量。图5为过表达tlr4的pam细胞感染fmdv后tcid50检测结果。图6为fmdv感染pam细胞后，野生型pam细胞和敲低tlr4的pam细胞中fmdv的3d基因表达情况。图7为fmdv感染pam细胞后，野生型pam细胞和敲低tlr4的pam细胞中vp3蛋白含量。图8为fmdv感染pam细胞后，野生型pam细胞和敲低tlr4的pam细胞的tcid50检测结果。图9为pcdna3.1-ha-n的质粒图谱。图10为pcdna3.1-3xflag-c的质粒图谱。图1、2、4和7中，αtlr4表示用的内源性tlr4的抗体，αβ-actin表示用的细胞内参的抗体，αflag表示flag标签的抗体，αha表示ha标签的抗体，tlr4表示内源性tlr4的表达量，β-actin表示细胞内参的表达量，flag-vp3表示vp3是带flag标签的，表示vp3的含量，ha-tlr4表示tlr4是带ha标签的，表示tlr4的含量，αvp3表示vp3内源性抗体，vp3表示vp3的蛋白量的多少，con表示空载。图3中con表示的是表达的空载pcdna3.1，tlr4表示过表达载体pcdna3.1-ha-tlr4。图5中ev表示过表达空载体pcdna3.1，tlr4表示过表达载体pcdna3.1-ha-tlr4。图6中coni表示的是敲除的空载egfp的pam细胞(对照)，tlr4-rnai#1表示敲除的tlr4的细胞系。图8中coni表示的是敲除的空载egfp的pam细胞(对照)，tlr4-rnai#1表示敲除的tlr4的细胞系。保藏信息：保藏时间：2019年07月24日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：cctccno：c2019174；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；分类命名：猪肺泡巨噬细胞tlr4-1。具体实施方式以下实施例是为了更好的说明本发明的技术方案，而不是以此来限制本发明的保护范围。实施例中所用fmdv由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫病毒参考实验室提供，慢病毒载体pgl-u6-grna由武汉大学舒红兵教授赠送，公众可从ntcc典型培养物保藏中心购买，trans5α感受态细胞、293t细胞、hek-293t细胞、pk-15细胞、pam细胞均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司。实施例1tlr4基因敲除的pam细胞系的构建1.1sgrna的设计根据猪源tlr4基因序列(geneid:399541)，确定外显子序列，根据外显子序列结构选择敲除位点，利用软件设计出三对sgrna引物，分别为：sgrna-f-1:5’-caccggccaggacgaagactgggtg-3’(seqidno.1)sgrna-r-1:5’-aaaccacccagtcttcgtcctggcc-3’(seqidno.2)；sgrna-f-2:5’-caccggggaggacagcgtcctgggg-3’(seqidno.3)sgrna-r-2:5’-aaacccccaggacgctgtcctcccc-3’(seqidno.4)；sgrna-f-3:5’-caccggcaggaatacctacctggag-3’(seqidno.5)sgrna-r-3:5’-aaacctccaggtaggtattcctgcc-3’(seqidno.6)。1.2载体构建1.2.1酶切空质粒(pgl-u6-grna)和胶回收用限制性内切酶bsmbi酶切5μg质粒，37℃，2h：表1限制性内切酶bsmb1酶切体系bsmbi5μl慢病毒载体5μgnebbuffer10μl灭菌水补至50μl凝胶提取试剂盒消化过的质粒，凝胶纯化，并在elutionbuffer中洗脱。1.2.2sgrna引物退火反应表2退火sgrna反应体系sgrna-f1μlsgrna-r1μl退火buffer48μlpcr程序设置：90℃，4min，70℃，10min，37℃，20min，10℃，20min。1.2.3质粒连接和转化筛选表3质粒连接反应体系sgrna6μl酶切载体2μlt4连接酶1μlt4buffer1μl将表3所述反应体系混匀，室温孵育1h，获得重组质粒。1.2.4转化筛选转化：在含有100μltrans5α感受态细胞的ep管中加入10μl重组质粒，混匀。冰上放置30min，然后将ep管放到42℃循环水浴热激90s。取出，迅速冰浴5min。每管加1ml无抗lb液体培养基，37℃、220rpm慢摇复苏30min。将复苏好的菌液于6000rpm、室温条件下离心3min，吸去800μl上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，然后涂布于含有氨苄青霉素的固体lb培养基上。将平板置于37℃培养箱中培养过夜。筛选：将阳性克隆挑出，提质粒，随后进行酶切鉴定，反应体系如下：表4重组质粒酶切反应体系重组质粒8.2μlecori0.4μlkpni0.4μl10×buffer1μl将表4所述的反应体系在室温下孵育30min，进行凝胶电泳。电泳结果中10000bp处为慢病毒载体，300bp处为sgrna，结果表明，筛选出来的阳性质粒为重组质粒。1.3慢病毒包装把构建好的重组质粒以及pst1374-cas9-d10a质粒(重组质粒和pst1374-cas9-d10a质粒的质量比为1:1，pst1374-cas9-d10a质粒购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司)利用lipofectamine3000脂质体转染进293t细胞中，转染8～12h后将培养基换为10％fbs、无双抗的dmem中，继续孵育12～24h，待细胞病变达到70％时，将细胞上清收集并用0.22μm的滤膜将上清过滤待用。1.4感染细胞用pam细胞铺12孔板，待细胞长到30％时加入1ml慢病毒、1ml10％fbs、无双抗的dmem和1.5μlpolybrene，感染8～12h后重复感染，12h后将细胞消化，转到6孔板中，并用加了1％嘌呤霉素的dmem进行培养，待细胞长满后，取一半细胞进行wb(蛋白免疫印迹)实验，验证tlr4基因是否敲低。结果如图1所示，所构建的三对sgrna中，只有sgrna-f-1和sgrna-r-1构建的sgrna(1#)敲低效率显著，另外两个效果不显著，故后面只用1#检测对口蹄疫病毒的影响。实施例2tlr4降解fmdv结构蛋白vp3的分析2.1实验步骤(1)将hek-293t细胞铺12孔板，待细胞长至60％～80％时，将信号通路分子质粒pcdna3.1-ha-tlr4(购于兰州瑞博莱生物科技有限公司)按0μg、2μg、4μg、6μg分别与fmdv的pcdna3.1-flag-vp3质粒(购于兰州瑞博莱生物科技有限公司)1μg共转染到hek-293t细胞中；pcdna3.1-ha-tlr4由tlr4基因片段插入如图9所示的pcdna3.1-ha-n载体的ecori和xhoi之间构建而成，pcdna3.1-flag-vp3由vp3基因片段插入图10所示的pcdna3.1-3xflag-c载体的ecori和xhoi之间构建而成。(2)转染24h后收样，用冷却的pbs洗1～2遍，加入100μl的sdsloadingbuffer进行裂解，wb方法检测vp3蛋白的表达情况。2.2实验结果结果如图2所示，随着pcdna3.1-ha-tlr4质粒的剂量逐渐上升，vp3的蛋白含量逐渐下降。因此，上述信号通路分子tlr4能够降解vp3蛋白，说明tlr4能够降解vp3蛋白。实施例3过表达tlr4对vp3蛋白降解的影响3.1fmdv感染细胞3.1.1实验步骤(1)将pk-15细胞铺到12孔板上，待细胞长至60％～80％时，利用lipofectamine3000脂质体转染prk-ha-tlr4(5μg)以及相应空载体pcdna3.1(5μg)，转染18h后分不同时间点(0,6,12h)感染fmdv(moi＝0.1)；(2)收样后，分别进行q-pcr检测fmdv的3d基因的拷贝数，tcid50以及wb检测vp3蛋白的含量。q-pcr反应试剂：2×onesteprt-pcrbufferⅲ(12.5μl)，takaraextaqhs(0.5μl)，primerscriprtenzymemixⅱ(0.5μl)，正向引物(5’actgggttttacaaacctgtga-3c)(0.5μl)，反向引物(5’gcgagtcctgccacgga-3c)(0.5μl)，探针(5fam-tcctttgcacgccgtgggac-tamra--3a)(1μl)，rna(2μl)，h2o(7.5μl)；wb检测：分别收集上述样品，加sds-loadingbuffer裂解后，用wb法检测vp3蛋白的表达情况。tcid50检测：感染fmdv结束后收集细胞上清液，用dmem培养基将病毒作连续10倍稀释，即10-1,10-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。用排枪吸去细胞铺满80％左右的96孔板中的培养液，再用pbs洗2次(此目的是去除血清，因为血清会影响病毒的吸附)，弃掉；每个稀释度取100ul加入96孔板，每个稀释度作8个重复。终体积为200ul。并设置空白对照，即200uldmem培养基。置于37℃培养。按时间点观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。结果的计算用reed-muench两氏法。3.1.2实验结果如图3所示：q-pcr结果表明pam细胞可以被fmdv感染，并且随着病毒感染时间的增加，过表达tlr4的pam细胞中fmdv基因拷贝数减少。如图4所示：wb检测结果显示，随着病毒感染时间的增加，过表达tlr4后vp3蛋白的含量较空载有所减少。如图5所示：tcid50检测显示过表达tlr4细胞致死率较空载有所下降。已知tlr4是一种关键受体，感染和非感染刺激都会诱导促炎反应，具有作为炎症反应的放大器的关键作用。口蹄疫病毒也会引起机体发生炎症反应，是一种炎症诱导病毒(guiboxiang,chenqin,huchuanxia,zhucaihui,heguimei.effectsofcalcitriol(1,25-dihydroxy-vitamind3)ontheinflammatoryresponseinducedbyh9n2influenzavirusinfectioninhumanlunga549epithelialcellsandinmice.[j].virologyjournal,2017,14)。但当感染口蹄疫病毒，过表达tlr4的pam细胞反而抑制了口蹄疫病毒的复制，并没有如预期促进口蹄疫病毒的复制。实施例4敲低tlr4对促进vp3蛋白增加的影响4.1.1实验步骤(1)pamwt细胞(未敲低tlr4的野生型pam细胞)和实施例1制备的pam敲低tlr4基因的细胞铺于12孔板，12h后接fmdv(moi＝0.1)，分别在6h和12h收集样品，进行绝对定量q-pcr实验，检测fmdv的3d基因的拷贝数，tcid50以及wb检测。q-pcr反应试剂：2×onesteprt-pcrbufferⅲ(12.5μl)，takaraextaqhs(0.5μl)，primerscriprtenzymemixⅱ(0.5μl)，正向引物(5’actgggttttacaaacctgtga-3c)(0.5μl)，反向引物(5’gcgagtcctgccacgga-3c)(0.5μl)，探针(5fam-tcctttgcacgccgtgggac-tamra--3a)(1μl)，rna(2μl)，h2o(7.5μl)；q-pcr反应条件：42℃，15min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；步骤2～4共40个循环。wb检测：分别收集上述样品，加sds-loadingbuffer裂解后，用wb法检测vp3蛋白的表达情况。tcid50检测：感染fmdv结束后收集细胞上清液，用dmem培养基将病毒作连续10倍稀释，即10-1,10-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。用排枪吸去细胞铺满80％左右的96孔板中的培养液，再用pbs洗2次(此目的是去除血清，因为血清会影响病毒的吸附)，弃掉；每个稀释度取100ul加入96孔板，每个稀释度作8个重复。终体积为200ul。并设置空白对照，即200uldmem培养基。置于37℃培养。按时间点观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。结果的计算用reed-muench两氏法。4.1.2实验结果q-pcr结果如图6所示：不论是在fmdv感染pam细胞后6h还是12h后，敲低tlr4的pam细胞中fmdv的3d基因拷贝数均显著高于wtpam细胞，该结果表明，敲低tlr4后，fmdv感染pam细胞的能力显著增强。wb检测如图7所示：随着病毒感染时间的增加，敲低tlr4后vp3的蛋白含量较空载有所增加。tcid50检测如图8所示：敲低tlr4细胞致死率较空载有所上升。以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。sequencelisting<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用<130>无<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1caccggccaggacgaagactgggtg25<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2aaaccacccagtcttcgtcctggcc25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3caccggggaggacagcgtcctgggg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4aaacccccaggacgctgtcctcccc25<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>5caccggcaggaatacctacctggag25<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>6aaacctccaggtaggtattcctgcc25当前第1页12