一种利用SSR标记构建狗牙根核心种质的方法与流程

本发明涉及植物种质资源评价技术领域，更具体的说是涉及一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法。

背景技术：

狗牙根属于禾本科画眉草亚科虎尾草族的c4型多年生草本植物，是世界三大暖季型草坪草之一，也是一种优良牧草。国内外学者在狗牙根种质资源的收集、遗传多样性评价等方面已取得一定的进展，这些研究为狗牙根种源的核心种质的构建奠定了良好的基础。

中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所近年来收集了大量的狗牙根种源，已从形态、分子、抗逆性、坪用价值、饲用价值等方面对所收集的代表性资源进行了研究，然而，现有研究一般停留在利用形态标记构建狗牙根核心种质资源。如何更快、更有效地研究，对于加快发掘优异的资源为育种服务显得尤为重要。

因此，如何利用ssr标记构建狗牙根核心种质是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的引物，包括：

引物对1：

sc12-f：5’-gcagctgaaaacctccagat-3’；seqidno.1；

sc12-r：5’-ggccacttgatcacacactc-3’；seqidno.2；

引物对2：

sc14-f：5’-atgagaacggagacggagac-3’；seqidno.3；

sc14-r：5’-gtactggacgaaggatcggt-3’；seqidno.4；

引物对3：

sc17-f：5’-atggaaggagtcttcgctgt-3’；seqidno.5；

sc17-r：5’-ggaaaccatggtgctctctt-3’；seqidno.6；

引物对4：

sc18-f：5’-atggtcaggagtggaaggag-3’；seqidno.7；

sc18-r：5’-gactgatgatcgccttgttg-3’；seqidno.8；

引物对5：

sc19-f：5’-gctccagcagatagaaggct-3’；seqidno.9；

sc19-r：5’-cacgagcatggacttgaact-3’；seqidno.10；

引物对6：

sc24-f：5’-tcaccagaccaccagcttc-3’；seqidno.11；

sc24-r：5’-gagaacgggccaaggtact-3’；seqidno.12；

引物对7：

sc33-f：5’-gagggcgtacaggaagaaca-3’；seqidno.13；

sc33-r：5’-ccgagaaggacttggtgaag-3’；seqidno.14；

引物对8:

sc40-f：5’-ctgtatcttatgctggtttg-3’；seqidno.15；

sc40-r：5’-cgtgctctgcctctgcta-3’；seqidno.16；

引物对9：

sc42-f：5’-tacgactccgtcaccaac-3’；seqidno.17；

sc42-r：5’-ggccatcgctaatcaatc-3’；seqidno.18；

引物对10：

sc44-f：5’-gggtagtagtagcaggttgg-3’；seqidno.19；

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引物对11：

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sc48-r：5’-tttgcagagcccgtaactct-3’；seqidno.22；

引物对12：

sc49-f：5’-caaggaccacatcaccatca-3’；seqidno.23；

sc49-r：5’-cggccattgattatctgtga-3’；seqidno.24；

引物对13：

sc51-f：5’-tcctgaggggttctcactg-3’；seqidno.25；

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引物对14：

sc53-f：5’-tgacgtcgttggtgtagagc-3’；seqidno.27；

sc53-r：5’-cgactccatctggtccaact-3’；seqidno.28；

引物对15：

sc54-f：5’-agatcggggtggggaaga-3’；seqidno.29；

sc54-r：5’-gtacatctccagcagcgaca-3’；seqidno.30；

引物对16：

sc55-f：5’-atccaatgagtgggactcca-3’；seqidno.31；

sc55-r：5’-ccagcttgcttgggattaaa-3’；seqidno.32；

引物对17：

sc56-f：5’-tgatggtgatgcaatggact-3’；seqidno.33；

sc56-r：5’-gctgtcttgggttcagcttc-3’；seqidno.34；

引物对18：

sc58-f：5’-ggcagctcctctctccttaaa-3’；seqidno.35；

sc58-r：5’-accatgaccttgtcctcgtc-3’；seqidno.36；

引物对19：

sc59-f：5’-acatgtctccgtcccatca-3’；seqidno.37；

sc59-r：5’-atgagtcggtccttcttgg-3’；seqidno.38；

引物对20：

sc61-f：5’-aggggaagaagggtaagcag-3’；seqidno.39；

sc61-r：5’-caccaaatccaccaaaggag-3’；seqidno.40；

引物对21：

sc62-f：5’-catgcgctttgagtttgag-3’；seqidno.41；

sc62-r：5’-aacaccacaacgaccttcg-3’；seqidno.42；

引物对22：

sc63-f：5’-tccgttgcctatacggttg-3’；seqidno.43；

sc63-r：5’-ggaaccgataatcactcca-3’；seqidno.44；

进一步的：一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法，包括以下步骤：

1)提取原始群体狗牙根样本基因组dna，用上述引物进行ssr-pcr扩增，得到狗牙根ssr分子标记数据；

2)在所述原始群体狗牙根样本基于地域分组的情况下，基于所述ssr分子标记数据，采用多次聚类优先取样法取样，总体取样比例20％，组内取样比例为平方根比例，遗传距离用nei&li遗传距离，聚类方法用重心法构建狗牙根核心种质。

优选的：所述原始群体狗牙根样本的数量为544个。

优选的：狗牙根ssr分子标记数据为将ssr-pcr扩增产物的电泳图中迁移至同一位置的条带记作一个位点，在该位点上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，对所有位点进行统计，得到的0-1原始数据矩阵为狗牙根ssr分子标记数据。

具体的，扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电压140v，电泳时间2h。电泳完成后快速银染检测，在白光灯下对电泳图进行拍照记录结果。再对狗牙根ssr分子标记数据统计分析，将电泳图中迁移至同一位置的条带记作一个位点，在该位点上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，对所有位点进行统计，即构成狗牙根ssr-pcr扩增的0-1原始数据矩阵。用popgene32软件对平均观测等位基因数(na)、平均有效等位基因数(ne)、平均nei’s遗传多样性指数(h)、平均shannon-weaver指数(i)和多态性位点百分率(p)5个参数进行计算，用以分析狗牙根ssr分子标记的遗传多样性。

优选的：原始群体狗牙根样本分组的方法为分11组：狗牙根-华南172份、狗牙根-华东139份、狗牙根-华中38份、狗牙根-华北5份、狗牙根-西南50份、狗牙根-西北29份、狗牙根-国外51份、弯穗狗牙根-国内54份、弯穗狗牙根-国外4份、双花狗牙根-西南1份和非洲狗牙根-南美洲1份。

优选的：ssr-pcr的扩增体系为总体积20μl，包含0.5utaq酶、2mmol/lmg²⁺、0.4μmol/l引物、0.2mmol/ldntps，30～60ng的dna模板，2μl10×pcrbuffer，其余用ddh2o补足。

优选的：ssr-pcr的扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环36次；72℃延伸7min，4℃保存。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法。其中，取样方法、总体取样比例和组内取样比例可以延用构建表型核心种质时筛选的结果，分别是取样方法为多次聚类优先取样法，总体取样比例为20％，以及组内取样比例为平方根据比例。然而,分子数据是间断性数据，现有研究表型数据是连续性数据，间断性数据和连续性数据的遗传距离存在很大差异，而且同一聚类方法不同遗传距离间的聚类结果也存在一定差异，因此，需要对构建核心种质过程中适用于分子数据的遗传距离和聚类方法进行筛选。

取得的技术效果为ssrcore近似地保持了原始种质的遗传结构。原始种质主成分2维分布图存在较重的相互重叠，表明原始种质中存在大量的遗传相似的种质材料；而ssrcore的重叠程度比较低，说明ssrcore去除遗传冗余效果明显。综上表明，狗牙根ssrcore总体上保持了原始种群的遗传结构，而且有效地去除了冗余材料，是一个合格的核心种质，对原始种质具有代表性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的部分狗牙根dna琼脂糖凝胶电泳示意图。

图2附图为本发明提供的部分狗牙根ssr引物筛选电泳图示意图，m是100bpmarker，引物依次是sc01，sc02，sc03，sc04，sc05，sc06，sc07，sc08，sc09，sc10，sc11，sc12。

图3附图为本发明提供的原始种质基于ssr数据的主成分分布示意图。

图4附图为本发明提供的ssrcore基于ssr数据的主成分分布示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所保藏有544份野生狗牙根，采集时间为2006至2014年间采集，地点为国内外22个国家和地区。

原理和步骤如下：

狗牙根dna提取与检测

取狗牙根幼叶，采用改良的ctab法提取544份狗牙根材料的基因组dna。

狗牙根ssr-pcr引物筛选

试验合成63对ssr引物，选取3个具有代表性的狗牙根材料的dna为模板，即b95、b311和b512，对这63对ssr引物进行筛选，引物筛选的标准是主带清晰明亮、多态性丰富、杂带少以及重复性好。最终筛选出22对引物如下表1：

表122对ssr引物序列

狗牙根ssr-pcr扩增产物的检测

狗牙根ssr-pcr扩增体系

20μl体系中包含0.5utaq酶、2mmol/lmg²⁺、0.4μmol/l引物、0.2mmol/ldntps，此外每管还加入1μl(30～60ng)的dna模板，2μl10×pcrbuffer，其余用ddh2o补足。

狗牙根ssr-pcr扩增程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环36次；72℃延伸7min，4℃保存。

扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电压140v，电泳时间2h。电泳完成后快速银染检测，在白光灯下对电泳图进行拍照记录结果。

狗牙根ssr分子标记数据统计分析

将电泳图中迁移至同一位置的条带记作一个位点，在该位点上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，对所有位点进行统计，即构成狗牙根ssr-pcr扩增的0-1原始数据矩阵。用popgene32软件对平均观测等位基因数(na)、平均有效等位基因数(ne)、平均nei’s遗传多样性指数(h)、平均shannon-weaver指数(i)和多态性位点百分率(p)5个参数进行计算，用以分析狗牙根ssr分子标记的遗传多样性。

狗牙根ssr核心种质构建

将基于狗牙根ssr分子标记数据构建的核心种质称为ssr核心种质(ssrcorecollection)，简称为ssrcore。取样方法、总体取样比例和组内取样比例延用构建表型核心种质时筛选的结果。然而，分子数据是间断性数据，表型数据是连续性数据，间断性数据和连续性数据的遗传距离存在很大差异，而且同一聚类方法不同遗传距离间的聚类结果也存在一定差异，因此需要对构建核心种质过程中适用于分子数据的遗传距离和聚类方法进行筛选。

分子数据遗传距离与聚类方法筛选

在原始群体不分组的情况下筛选适用于分子数据的遗传距离和聚类方法。适用于分子数据的遗传距离设定为简单匹配系数(sm)、杰卡德系数(jaccard)、nei&li遗传距离(nei&li)和主成分距离4种；聚类方法设定为最短距离法、最长距离法、中间距离法、不加权类平均法、离差平方和法和重心法6种。将遗传距离和聚类方法2个因素的各水平进行两两组合，形成24种组合方式。分别用这24种方式构建核心子集，并计算它们的评价参数，用spss22.0对评价参数进行方差分析，筛选出最适合分子数据的遗传距离与聚类方法。

ssr核心种质构建

将544份狗牙根材料按表2的分组方式分为11组，分别在各组内利用上面筛选出的遗传距离和聚类方法对ssr数据进行聚类，用与构建表型核心种质相同的取样方法和取样比例抽取核心材料，将各组核心材料聚合在一起就构成了狗牙根基于ssr分子标记数据的ssr核心种质(ssrcore)。

表2

ssr核心种质评价

选择平均观测等位基因数(na)、平均有效等位基因数(ne)、平均nei’s遗传多样性指数(h)、平均shannon-weaver指数(i)和多态性位点百分率(p)5个参数对ssr核心种质(ssrcore)进行遗传多样性评价。核心种质与原始种质在遗传多样性参数上的比值，可以体现核心种质对原始种质在遗传多样性上的保有量，将这种比值称为保留比例(retainingratio,rr)。保留比例＝核心种质的性状(参数)/原始种质群体的性状。计算ssrcore在这5个参数上保留比例，看它是否良好地保留了狗牙根原始种质的分子遗传多样性。评价参数通过popgene32软件进行计算。

本发明分别对原始种质和ssr核心种质的ssr分子标记数据进行了主成分分析，根据各种质材料在第一和第二主成分上的得分绘制了二维散点图，以便直观展示ssr核心种质对原始种质的分子标记遗传结构的保留情况。

实施例1

狗牙根dna提取与检测

对部分野生狗牙根提取dna进行琼脂糖凝胶电泳检测(参见图1)。由图1可知，本试验提取的dna条带明亮清晰、不托带、点样孔亮度低，说明dna含量高、无降解现象、蛋白等杂质残留少。此外，核酸蛋白含量测定仪的检测结果显示，dna的od260/od280均在1.8～2.0之间，浓度ρ≥300ng/μl。这2项检测结果表明，所用dna质量与浓度都合乎要求。

实施例2

根据狗牙根样本设计63对扩增引物，利用ssr-pcr反应体系，从63对ssr引物中筛选出了22对多态性好、条带清晰、主带明显的引物，部分ssr引物(sc01，sc02，sc03，sc04，sc05，sc06，sc07，sc08，sc09，sc10，sc11，sc12)的筛选见附图2。

实施例3

狗牙根ssr扩增条带统计

表3列出了22对ssr引物对544份狗牙根的扩增多样性结果，22对引物一共扩增出了135个位点，其中多态性位点占134个，多态性位点百分率为99.26％，平均每条引物扩增出了6.14个位点。扩增位点数最多的引物是sc18和sc12，分别扩增了13和12个位点；扩增位点数最少的引物是sc51、sc56、sc58，都扩增了3个位点。22对引物的平均多态性位点百分率、平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均nei’s遗传多样性指数和平均shannon-weaver指数分别为99.26％、1.99、1.32、0.20、0.32。不同引物在各个参数上的值各不相同，其中sc51在这几个参数上最低，分别为66.67％、1.67、1.02、0.02和0.04；引物sc59在这几个参数上最高，分别为100％、2.00、1.66、0.35、0.51。总体而言，狗牙根原始种质的多态性位点百分率较高，平均nei’s遗传多样性指数和平均shannon-weaver指数较高，具有丰富的遗传多样性，适合构建核心种质。

表322对ssr引物扩增狗牙根的遗传多样性分析结果

注：p、na、ne、h和i分别表示平均多态性位点百分率、平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均nei’s遗传多样性指数和平均shannon-weaver指数。

实施例4

狗牙根ssr核心种质(ssrcore)的构建

取样方法选择多次聚类优先取样法，总体取样比例为20％，组内取样比例为平方根比例。

适合分子数据的遗传距离与聚类方法筛选

在原始群体不分组的情况下，将4种遗传距离与6种聚类方法进行完全组合形成24种核心种质构建方式，用这24种方式构建出24份核心子集。计算其评价参数并进行方差分析，见表4、5。

适合分子数据的聚类方法筛选

将核心子集在平均观测等位基因数(na)、平均有效等位基因数(ne)、平均nei’s遗传多样性指数(h)、平均shannon-weaver指数(i)和多态性位点百分率(p)5个参数上相对于原始种质的保留比例作为衡量核心子集对原始种群分子标记遗传多样性保有量的标准，保留比例越大，表明核心子集对原始种群分子标记遗传多样性保留得越好。

由表4可知6种聚类方法构建的核心子集在p、h、i三个参数上的保留比例都大于95％，说明6种聚类方法构建的核心子集对原始种群分子标记遗传多样性都保留得很好。但是ne的保留比例都不高，只有50％左右。

在多态性位点百分率(p)保留比例上，重心法、最长距离法和最短距离法构建的核心子集保留比例最高，为97.57％～98.13％，三者相互之间差异不显著；离差平方和法和中间距离法最低，分别为95.90％、95.15％，两者差异不显著；处于中间位置的是不加权类平均法，为96.08％，显著低于重心法，但显著高于中间距离法，与离差平方和法、最长距离法和最短距离差异不显著。

对于平均shannon-weaver指数(i)的保留比例，数值最大的是最长距离法、重心法、不加权类平均法和离差平方和法，为102.90％～105.49％，四者相互之间差异不显著；数值最小的是中间距离法，为96.90％，显著低于其他5种聚类方法；处于中间位置的是最短距离法，为101.89％，显著低于最长距离法，但显著高于中间距离法，与重心法、不加权类平均法、离差平方和法差异不显著。

6种聚类方法的平均nei’s遗传多样性指数(h)的保留比例与平均shannon-weaver保留比例在数值上不同，但差异显著性完全一致。说明nei’s遗传多样性指数和shannon-weaver指数有很大程度的内在关联。

6种聚类方法在平均有效等位基因数(ne)的保留比例上差异均不显著，取值范围为51.46％～53.71％。

综合分析发现，重心法和最长距离法最优，在3/4参数的保留比例中都最大，且两者之间差异不显著；不加权类平均法、最短距离法和离差平方和次之，三者之间差异不显著；中间距离法效果最差，在所有评价参数保留比例上都最低。

综上，6种聚类方法中最适合用于构建狗牙根分子数据核心种质的聚类方法为重心法和最长距离法。本试验最终选择重心法进行后续数据分析。

表46种聚类方法构建的核心子集分子标记多样性分析

注：pc/pi、ic/ii、hc/hi、nec/nei分别是核心子集与原始种质群体间的多态性位点百分率、平均shannon-weaver指数、平均nei’s遗传多样性指数比值、平均有效等位基因数的比值。

适合分子数据的遗传距离筛选

由表5可知，由4种遗传距离构建的核心子集在多态性位点百分率、平均shannon-weaver指数和平均nei’s遗传多样性指数3个参数上的保留比例都大于96％，但4者在平均有效等位基因保留比例上都只略高于50％。

对4种遗传距离进行方差分析，发现四者相互差异不显著。因此选择任何一种遗传距离均可，本试验最终选择nei&li遗传距离。

表54种遗传距离构建的核心子集分子标记多样性分析

注：pc/pi、ic/ii、hc/hi、nec/nei分别是核心子集与原始种质群体间的多态性位点百分率比值、平均shannon-weaver指数比值、平均nei’s遗传多样性指数比值、平均有效等位基因数比值。

结论：

在原始群体分组的情况下，用前面筛选出的核心种质构建策略对544份狗牙根种质的ssr分子标记数据进行处理从而抽取核心材料构建核心种质，即，取样方法使用多次聚类优先取样法，总体取样比例为20％，组内取样比例为平方根比例，聚类方法使用重心法，遗传距离为nei&li距离。利用mcore软件构建了包含了110份狗牙根种质的核心种质库。

实施例5

狗牙根ssr核心种质(ssrcore)的评价

遗传多样性参数评价

由表6可知，ssrcore在参数na、p上的保留比例都超过了97％，在参数ne、h和i上的保留比例都超过了100％。说明ssrcore良好得保留了原始种质的ssr分子标记遗传多样性，是优良的核心种质。

表6基于狗牙根ssr分子标记数据构建的核心种质ssrcore的评价

实施例6

主成分分析

为了检验ssrcore是否保留了原始种群的群体遗传结构，对ssrcore和原始种群分别进行了主成分分析，表7为主成分分析结果，以特征值大于1为标准，分别入选了8(核心种质)、6(原始种质)个主成分。由表7可知，ssrcore与原始种质在各个主成分的特征值、比例和累积贡献率上大体相似，但也存在一些差异。这些差异主要是由于ssrcore的第2主成分的特征值和比例比原始种质低造成的。原始种质的第1、第2主成分累积贡献率达81.09％，ssrcore的第1、第2主成分的累积贡献率达77.29％，因此用第1、第2主成分绘制的2维种质分布图，能近似地表现群体的遗传结构。可以直观地看出ssrcore(参见图4)与原始种质(参见图3)的主成分2维分布图略有差异，但是ssrcore保持了与原始种质相似的几何形状以及大部分特征，说明ssrcore近似地保持了原始种质的遗传结构。原始种质主成分2维分布图存在较重的相互重叠，表明原始种质中存在大量的遗传相似的种质材料；而ssrcore的重叠程度比较低，说明ssrcore去除遗传冗余效果明显。综上表明，狗牙根ssrcore总体上保持了原始种群的遗传结构，而且有效地去除了冗余材料，是一个合格的核心种质，对原始种质具有代表性。

表7原始种质与ssrcore主成分分析的特征值与累积贡献率比较

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120>一种利用ssr标记构建狗牙根核心种质的方法

<160>44

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcagctgaaaacctccagat20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggccacttgatcacacactc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgagaacggagacggagac20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtactggacgaaggatcggt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atggaaggagtcttcgctgt20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggaaaccatggtgctctctt20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atggtcaggagtggaaggag20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gactgatgatcgccttgttg20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gctccagcagatagaaggct20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cacgagcatggacttgaact20

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tcaccagaccaccagcttc19

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gagaacgggccaaggtact19

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gagggcgtacaggaagaaca20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ccgagaaggacttggtgaag20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

ctgtatcttatgctggtttg20

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

cgtgctctgcctctgcta18

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

tacgactccgtcaccaac18

<210>18

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

ggccatcgctaatcaatc18

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

gggtagtagtagcaggttgg20

<210>20

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

gtgcgtttcatcgttgtt18

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

ggactcaaaaatgctcagaaa21

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

tttgcagagcccgtaactct20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

caaggaccacatcaccatca20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

cggccattgattatctgtga20

<210>25

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

tcctgaggggttctcactg19

<210>26

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

ggagtaggtgctgctgatt19

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

tgacgtcgttggtgtagagc20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

cgactccatctggtccaact20

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

agatcggggtggggaaga18

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gtacatctccagcagcgaca20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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atccaatgagtgggactcca20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

ccagcttgcttgggattaaa20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgatggtgatgcaatggact20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gctgtcttgggttcagcttc20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ggcagctcctctctccttaaa21

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<211>20

<212>dna

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>43

tccgttgcctatacggttg19

<210>44

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>44

ggaaccgataatcactcca19