本发明属于益生菌健康食品领域，具体涉及鼠李糖乳杆菌pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09、其益生菌组方及该组方的制备方法和应用。
背景技术：
细菌性阴道炎(bacterialvaginosis，简称bv)是生育年龄妇女最常见的阴道感染性疾病，在我国其感染率约为15％～50％，其中约10％～40％为无症状性bv。bv的主要特征是阴道乳杆菌数目减少，而其他阴道微生物如加德纳菌，或混合性厌氧菌如革兰氏阳性厌氧球菌消化球菌属(peptococcus)、消化链球菌属(peptostreptococcus)、革兰氏阴性厌氧杆菌拟杆菌属(bacteroides)等细菌大量繁殖而造成阴道菌群失调。
外阴阴道假丝酵母菌感染，俗称霉菌性阴道炎(vulvovaginalcandidiasis，简称vvc)也是女性常见的阴道感染性疾病，最常见的致病菌如白假丝酵母菌(白色念珠菌，candidaalbicans)。vvc居女性生殖道感染疾病的第2位，仅次于bv，并且复发率高。
目前，采用抗生素和抗真菌药物是治疗细菌性阴道炎(bv)、霉菌性阴道炎(vvc)的主要手段，然而采用抗生素和抗真菌药物在杀灭阴道致病菌的同时，也抑制了阴道正常有益菌的生长，会引起阴道菌群失调，造成致病菌占优势。
维持阴道正常菌群平衡，用以预防和辅助治疗阴道炎。20世纪80年代开始有采用乳杆菌制剂辅助治疗bv、vvc的报道，但并非所有的乳杆菌都具有同样的生物学活性，因此，使用效果并不显著。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供鼠李糖乳杆菌pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09、其益生菌组方及该组方的制备方法和应用。
乳杆菌在健康女性阴道分泌物标本中的分离率高达80％～100％。调查研究显示，女性阴道内有多种菌群存在，优势菌为乳杆菌；阴道内乳杆菌的数量与宿主、环境保持着协调的、动态的平衡。研究发现，口服摄入的乳杆菌菌株能以活菌形式进入胃肠道，经过直肠进入阴道，并在阴道内定殖而发挥其生物学作用。因此，通过补充乳杆菌有助于恢复阴道的微生态平衡，从而抑制致病菌的生长繁殖起到“以菌治菌”的作用。乳杆菌在阴道内抑制致病菌，其作用主要是通过产生乳酸、过氧化氢以及细菌素等抑菌物质，这些抑菌物质通常只选择性地作用于少数致病菌而不会破坏整个阴道菌群的平衡。
据于以上原理，本发明涉及一种用于改善女性阴道炎的益生菌组方及其应用，该益生菌组方中包含优选获得的一株鼠李糖乳杆菌pb-lr76(lactobacillusrhamnosus)，菌株号为pb-lr76，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018887；一株罗伊氏乳杆菌pb-lr09(lactobacillusreuteri)，菌株号为pb-lr09，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018888。两株优选菌种与乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，菌株号为hh-ba68，共同组成一种改善女性阴道炎的益生菌组方，用于改善女性细菌性阴道炎(bv)和霉菌性阴道炎(vvc)。
本发明所采用的技术方案为：
本发明提供一种鼠李糖乳杆菌pb-lr76，名称为lactobacillusrhamnosus，菌株号为pb-lr76，所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，保藏日期为2018年12月12号，保藏号为cctccno：m2018887。
本发明还提供一种罗伊氏乳杆菌pb-lr09，名称为lactobacillusreuteri，菌株号为pb-lr09，所述罗伊氏乳杆菌pb-lr09保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，保藏日期为2018年12月12号，保藏号为cctccno：m2018888。
本发明还提供一种益生菌组方，包括以下质量份数的菌粉：如上述鼠李糖乳杆菌pb-lr76的菌粉10-80份，如上述罗伊氏乳杆菌pb-lr09的菌粉10-80份，以及乳双歧杆菌的菌粉10-60份。
进一步限定，所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76的菌粉中活菌数为1.0×109-1.0×1012cfu/g，所述罗伊氏乳杆菌pb-lr09的菌粉中活菌数为1.0×109-1.0×1012cfu/g，所述乳双歧杆菌的菌粉中活菌数为1.0×109-1.0×1012cfu/g。
本发明还提供上述益生菌组方的制备方法，包括以下步骤：
s1、将所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09以及乳双歧杆菌分别接种培养，发酵，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76发酵菌液、罗伊氏乳杆菌pb-lr09发酵菌液、乳双歧杆菌发酵菌液；
s2、将步骤s1中的所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09、乳双歧杆菌的发酵菌液分别离心，收集沉淀物，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌泥、罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌泥以及乳双歧杆菌菌泥；
s3、将步骤s2中的所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌泥、罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌泥以及乳双歧杆菌菌泥，分别添加冻干保护剂进行乳化处理得到乳化液，将乳化液进行真空冷冻干燥处理24-72h，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌粉以及乳双歧杆菌菌粉；
s4、将步骤s3中的所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌粉以及乳双歧杆菌菌粉，按权利要求3的配比进行充分均匀混合，即得到该益生菌组方产品。
进一步限定，步骤s1中鼠李糖乳杆菌pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09以及乳双歧杆菌的发酵温度为36～38℃，发酵时间为6～36h，所用培养基为mrs培养基。
进一步限定，步骤s2中，离心条件为10000-15000rpm。
进一步限定，步骤s3中，所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、低聚糖、甘油以及乳糖中的一种或多种；乳化条件为：60-200rpm搅拌5-15min；真空冷冻干燥条件为：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28℃-30℃。
进一步限定，步骤s4中还包括以下过程：向所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌粉以及乳双歧杆菌菌粉的混合物中添加辅料进行充分均匀混合，所述辅料包括淀粉、麦芽糊精、葡萄糖以及膳食纤维中的一种或多种。
本发明还提供上述益生菌组方在改善女性阴道炎症中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的鼠李糖乳杆菌pb-lr76和罗伊氏乳杆菌pb-lr09，两菌株其发酵菌液经hplc测定产乳酸含量≥5％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力≥80u/ml，经琼脂平板打孔法测定产细菌素抑菌效价≥800au/ml(指示菌为黑色消化球菌peptococcusniger、厌氧消化链球菌peptostreptococcusanaerobius、脆弱拟杆菌bacteroidesfragilis、产黑色素拟杆菌bacteroidesmelaninogenicum、白假丝酵母菌candidaalbicans)。
两菌种与乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，菌株号为hh-ba68，共同组成一种用于改善女性阴道炎的益生菌组方，该益生菌组方产品作为益生菌健康食品，应用于改善女性细菌性阴道炎(bv)和霉菌性阴道炎(vvc)，对细菌性阴道炎(bv)有改善影响≥70％，对霉菌性阴道炎(vvc)有改善影响≥60％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的目的在于提供优选的鼠李糖乳杆菌pb-lr76和罗伊氏乳杆菌pb-lr09。
1、乳杆菌菌株的优选方法
1.1乳杆菌产乳酸的测定方法
1.1.1乳杆菌发酵液的制备
将待测乳杆菌菌种接种于mrs液体培养基(葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-801ml，水1l，ph6.5)中，36℃～38℃温度下恒温静止培养，不同培养时间取菌液测定菌液中乳酸含量。
1.1.2高效液相色谱法测定乳酸
1)高效液相色谱的条件
色谱柱(zorbaxsb-aq)：柱温35℃：流速＝1.000ml/min；紫外线检测波长＝210nm；流动相：pbs(ph2.0)、乙腈、超净水(pbs：乙腈＝95:5)、10％异丙醇。
2)标准曲线的测定
将乳酸标准品用超净水稀释5个浓度梯度，0.75、1.5、3.0、6.0、9.0μl/ml。精密吸取乳酸标准溶液20μl，分别进行hplc测定，重复2次进样。根据乳酸浓度x和峰面积y绘制乳酸标准曲线。
3)乳杆菌菌液中乳酸的测定
从培养乳杆菌菌液2h开始，12h、15h、18h、20h、24h，分别取样，1500r/min离心5min，取上清液，上清液加入等比例乙腈沉淀蛋白，取上清经过0.22μm的微孔膜过滤。
1.2乳杆菌产过氧化氢酶的测定方法
1.2.1乳杆菌发酵液的制备
将待测乳杆菌菌种接种于mrs液体培养基(葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-801ml，水1l，ph6.5)中，36℃～38℃温度下恒温静止培养，不同培养时间取菌液测定菌液中过氧化氢酶活力。
1.2.2碘量法测定过氧化氢酶活力
1)粗酶液的制取
发酵液定时取样，7000rpm离心发酵液，取上清液即为粗酶液。将粗酶液置100℃沸水浴中5min，即得失活酶液。
2)酶活力的测定
在100ml碘量瓶中加入5ml用10mmol/l、ph6.8的磷酸缓冲液配制的8.8mmol/l的过氧化氢溶液，在25℃水浴中预热3min，加1ml粗酶液，保温1min，迅速加入0.5ml10％ki和1滴1％钼酸铵，放置3min以上，用0.01mol/lna2s2o3滴定，接近终点时加两滴淀粉指示剂，记下所消耗的na2s2o3毫升数，用失活酶作对照。酶活力单位(u/ml)定义：在上述反应条件下，每分钟催化分解1μmol的过氧化氢所需的酶量定为一个酶活力单位。
1.3乳杆菌产细菌素的测定方法
1.3.1乳杆菌发酵液的制备
将待测乳杆菌菌种接种于mrs液体培养基(葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-801ml，水1l，ph6.5)中，36℃～38℃温度下恒温静止培养，不同培养时间取菌液测定菌液抑菌效价。
1.3.2指示菌
1)革兰氏阳性厌氧球菌：黑色消化球菌(peptococcusniger)、厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)；
2)革兰氏阴性厌氧杆菌：脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)；
3)假丝酵母菌：白假丝酵母菌(candidaalbicans)。
1.3.3指示菌菌液制备
1)革兰氏阳性厌氧球菌菌液制备
将黑色消化球菌(peptococcusniger)、厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)从刚培养好的新鲜试管斜面培养基上刮一环菌苔，转接于装有强化bap液体培养基(蛋白胨10g、酪蛋白胨10g、氯化钠5g、酵母膏7g、葡萄糖1g、50ml脱纤维羊血、5mg氯化血红素、100μg维生素k1、去离子水1000ml，ph6.8～7.2)量为40ml的50ml三角烧瓶中，36℃～38℃厌氧培养48h；将上述培养好菌液用无菌生理盐水稀释，调整菌悬液吸光值od600nm为1.0(用紫外分光光度计测定)；同时用空白强化bap液体培养基做对照。
2)革兰氏阴性厌氧杆菌菌液制备
将脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)从刚培养好的新鲜试管斜面培养基上刮一环菌苔，转接于装有改良gam液体培养基(
3)假丝酵母菌菌液制备
将白假丝酵母菌(candidaalbicans)从刚培养好的新鲜试管斜面培养基上刮一环菌苔，转接于装有ypd液体培养基(葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、去离子水1000ml，ph5.6)量为50ml的250ml三角烧瓶中，36℃～38℃，160rpm培养24h；将上述培养好菌液用无菌生理盐水稀释，调整菌悬液吸光值od600nm为1.0(用紫外分光光度计测定)；同时用空白ypd液体培养基做对照。1.3.4指示菌检测培养基制备
1)革兰氏阳性厌氧球菌检测培养基制备
在强化bap液体培养基中加入1.5％纯琼脂粉，制备成固体培养基。将已灭菌的强化bap固体培养基置室温待其冷却至48-50℃时，按100ml强化bap固体培养基加入100μl上述指示菌菌悬液(od600nm＝1.0)，迅速摇匀；吸取含菌强化bap固体培养基10ml，迅速移至φ90mm培养皿中，使其在φ90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
2)革兰氏阴性厌氧杆菌检测培养基制备
在改良gam液体培养基中加入1.5％纯琼脂粉，制备成固体培养基。将已灭菌的改良gam固体培养基置室温待其冷却至48-50℃时，按100ml改良gam固体培养基加入100μl上述指示菌菌悬液(od600nm＝1.0)，迅速摇匀；吸取含菌改良gam固体培养基10ml，迅速移至φ90mm培养皿中，使其在φ90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
3)假丝酵母菌检测培养基制备
在ypd液体培养基中加入1.5％纯琼脂粉，制备成固体培养基。将已灭菌的ypd固体培养基置室温待其冷却至48-50℃时，按100mlypd固体培养基加入100μl上述指示菌菌悬液(od600nm＝1.0)，迅速摇匀；吸取含菌ypd固体培养基10ml，迅速移至φ90mm培养皿中，使其在φ90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
1.3.5待测乳杆菌样品处理
1)除菌处理
吸取约100ml左右乳杆菌培养液，将其移入离心管中，10000rpm/min离心15分钟，倒出上清液，用无菌针筒吸取上清液，过0.22μm细菌过滤器，作除菌处理。
2)浓缩处理
精确吸取100ml上述已作除菌处理的乳杆菌培养液上清液于冻干托盘中，放置实验室小型冻干机中作冻干处理(冻干条件为：预冻温度-40℃，真空度<10pa)，冻干后加入适量无菌去离子水复溶，溶液即为待测样品。
1.3.6乳杆菌发酵液抑菌效价测定
将上述制备好的指示菌检测培养基，用已经灭菌处理过的打孔器(孔径φ2.7mm)打孔，取3个平板每板至少打1孔，重复3板；每孔中分别加入5ul待测样品溶液，置于37℃培养箱中，培养24～48小时后，用游标卡尺测定抑菌圈直径大小，计算平均值。计算公式如下：抑菌效价(u/ml)＝2x×1000×稀释倍数，x＝(y-2.7)/2.1。其中：y——抑菌圈直径(φmm)，取平均值；2.7——孔穴直径(φmm)；2.1——培养液浓度与抑菌圈直径的比值常数。
2、优选的乳杆菌菌株
2.1优选的鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌株
2.1.1菌株来源
分离自健康女性肠道，在mrs固体培养基上，36℃～38℃培养24～48h，多次划线分离获得单菌落，该菌菌落白色、表面光滑、中央有凸起或扁平、不透明、有光泽、质地软，菌体形态呈规则性杆状、有长杆或短杆状、呈链状排列；液体培养获得发酵菌液。
2.1.2产乳酸、产过氧化氢酶、产细菌素的测定
发酵菌液经hplc测定产乳酸含量≥5％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力≥80u/ml，经琼脂平板打孔法测定产细菌素抑菌效价≥800au/ml(指示菌为黑色消化球菌peptococcusniger、厌氧消化链球菌peptostreptococcusanaerobius、脆弱拟杆菌bacteroidesfragilis、产黑色素拟杆菌bacteroidesmelaninogenicum、白假丝酵母菌candidaalbicans)。
2.1.3菌种鉴定
分离、纯化菌种，经16srrna基因作为marker片段，通用引物扩增出基因中16srrna序列，再进行电泳检测，使用3730xl测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与nt数据库进行比对，获得近源物信息，为鼠李糖乳杆菌pb-lr76，菌株编号为pb-lr76，其16srrna特征序列如seqidno.1所示：
2.1.4菌种保藏
鼠李糖乳杆菌pb-lr76(lactobacillusrhamnosus)pb-lr76，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018887。
2.2优选的罗伊氏乳杆菌pb-lr09菌株
2.2.1菌株来源
分离自健康女性肠道，在mrs固体培养基上，36℃～38℃培养24～48h，多次划线分离获得单菌落，该菌菌落白色、圆形、不透明，菌体形态呈短杆或长杆状、端部呈方形；液体培养获得发酵菌液。
2.2.2产乳酸、产过氧化氢酶、产细菌素的测定
发酵菌液经hplc测定产乳酸含量≥5％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力≥80u/ml，经琼脂平板打孔法测定产细菌素抑菌效价≥800au/ml(指示菌为黑色消化球菌peptococcusniger、厌氧消化链球菌peptostreptococcusanaerobius、脆弱拟杆菌bacteroidesfragilis、产黑色素拟杆菌bacteroidesmelaninogenicum、白假丝酵母菌candidaalbicans)。
2.2.3菌种鉴定
分离、纯化菌种，经16srrna基因作为marker片段，通用引物扩增出基因中16srrna序列，再进行电泳检测，使用3730xl测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与nt数据库进行比对，获得近源物信息，为罗伊氏乳杆菌pb-lr09，菌株编号为pb-lr09，其16srrna特征序列seqidno.2所示：
2.2.4菌种保藏
罗伊氏乳杆菌pb-lr09(lactobacillusreuteri)pb-lr09，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018888。
实施例2
本实施例的目的在于利用实施例1中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76和罗伊氏乳杆菌pb-lr09提供一种益生菌组方。
其中，鼠李糖乳杆菌pb-lr76(lactobacillusrhamnosus)，菌株号为pb-lr76，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018887；该菌株发酵菌液经hplc测定产乳酸含量为5.8％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力为97u/ml，经琼脂平板打孔法测定其发酵菌液对黑色消化球菌(peptococcusniger)的抑菌效价为1205au/ml、对厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)的抑菌效价为821au/ml、对脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的抑菌效价为935au/ml、对产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)的抑菌效价为1112au/ml、对白假丝酵母菌(candidaalbicans)的抑菌效价为802au/ml。
罗伊氏乳杆菌pb-lr09(lactobacillusreuteri)，菌株号为pb-lr09，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018888；该菌株发酵菌液经hplc测定产乳酸含量为5.4％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力为86u/ml，经琼脂平板打孔法测定其发酵菌液对黑色消化球菌(peptococcusniger)的抑菌效价为876au/ml、对厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)的抑菌效价为978au/ml、对脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的抑菌效价为1020au/ml、对产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)的抑菌效价为858au/ml、对白假丝酵母菌(candidaalbicans)的抑菌效价为923au/ml。
上述两菌种与乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，菌株号为hh-ba68，共同组成一种用于改善女性阴道炎的益生菌组方，该组方中包括如下重量份的组分：鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉30份，罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉20份，乳双歧杆菌hh-ba68菌粉10份，麦芽糊精30份，乳糖10份。所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉的活菌数为2.0×1011cfu/g，罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉的活菌数为1.0×1011cfu/g，乳双歧杆菌hh-ba68菌粉的活菌数为3.0×1011cfu/g。
本实施例中的益生菌组方，制备方法包括如下步骤：
1)将所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09、乳双歧杆菌hh-ba68分别接种在mrs液体培养基中，在36～38℃下分别发酵18、16、20h，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76发酵菌液、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09发酵菌液、乳双歧杆菌hh-ba68发酵菌液。
2)将上述步骤1)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09、乳双歧杆菌hh-ba68发酵菌液分别以11000、12000、10000rpm离心，收集沉淀物，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌泥、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌泥、乳双歧杆菌hh-ba68菌泥。
3)将上述步骤2)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌泥、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌泥、乳双歧杆菌hh-ba68菌泥，分别添加冻干保护剂(按照固含量百分比即脱脂奶粉50％、麦芽糊精30％、乳糖20％，80rpm搅拌8min乳化，并进行真空冷冻干燥处理42h(冷冻干燥条件：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28℃～30℃)，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉。
4)将上述步骤3)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉，添加麦芽糊精、乳糖，进行充分均匀混合，即得到该益生菌组方产品。
经上述制备方法所制得的该益生菌组方产品作为益生菌健康食品，应用于改善女性细菌性阴道炎(bv)和霉菌性阴道炎(vvc)，对细菌性阴道炎(bv)有改善影响达78％，对霉菌性阴道炎(vvc)有改善影响达63％。
实施例3
本实施例的目的在于利用实施例1中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76和罗伊氏乳杆菌pb-lr09提供一种益生菌组方。
其中，鼠李糖乳杆菌pb-lr76(lactobacillusrhamnosus)，菌株号为pb-lr76，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018887；该菌株发酵菌液经hplc测定产乳酸含量为6.1％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力为89u/ml，经琼脂平板打孔法测定其发酵菌液对黑色消化球菌(peptococcusniger)的抑菌效价为1123au/ml、对厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)的抑菌效价为1021au/ml、对脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的抑菌效价为812au/ml、对产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)的抑菌效价为903au/ml、对白假丝酵母菌(candidaalbicans)的抑菌效价为896au/ml。
罗伊氏乳杆菌pb-lr09(lactobacillusreuteri)，菌株号为pb-lr09，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018888；该菌株发酵菌液经hplc测定产乳酸含量为5.5％(w/v)，经碘量法测定产过氧化氢酶活力为91u/ml，经琼脂平板打孔法测定其发酵菌液对黑色消化球菌(peptococcusniger)的抑菌效价为899au/ml、对厌氧消化链球菌(peptostreptococcusanaerobius)的抑菌效价为1021au/ml、对脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的抑菌效价为1011au/ml、对产黑色素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicum)的抑菌效价为901au/ml、对白假丝酵母菌(candidaalbicans)的抑菌效价为893au/ml。
上述两菌种与乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，菌株号为hh-ba68，共同组成一种用于改善女性阴道炎的益生菌组方，该组方中包括如下重量份的组分：鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉30份，罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉30份，乳双歧杆菌hh-ba68菌粉20份，淀粉20份。所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉的活菌数为1.5×1011cfu/g，罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉的活菌数为1.0×1011cfu/g，乳双歧杆菌hh-ba68菌粉的活菌数为3.5×1011cfu/g。
本实施例中的益生菌组方，其制备方法包括如下步骤：
1)将所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09、乳双歧杆菌hh-ba68分别接种在mrs液体培养基中，在36～38℃下分别发酵16、15、18h，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76发酵菌液、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09发酵菌液、乳双歧杆菌hh-ba68发酵菌液。
2)将上述步骤1)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09、乳双歧杆菌hh-ba68发酵菌液分别以15000、13000、14000rpm离心，收集沉淀物，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌泥、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌泥、乳双歧杆菌hh-ba68菌泥。
3)将上述步骤2)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌泥添加冻干保护剂(按照固含量百分比即脱脂奶粉60％、麦芽糊精20％、蔗糖10％、10％吐温-80)、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌泥添加冻干保护剂(按照固含量百分比即脱脂奶粉40％、麦芽糊精20％、海藻糖20％、葡萄糖10％、10％吐温-80)、乳双歧杆菌hh-ba68菌泥添加冻干保护剂(按照固含量百分比即脱脂奶粉45％、麦芽糊精30％、乳糖20％、甘油5％)，120rpm搅拌10min乳化，并进行真空冷冻干燥处理38h(冷冻干燥条件：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28℃～30℃)，得到鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉。
4)将上述步骤3)中的鼠李糖乳杆菌pb-lr76pb-lr76菌粉、罗伊氏乳杆菌pb-lr09pb-lr09菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉，添加淀粉，进行充分均匀混合，即得到该益生菌组方产品。
经上述制备方法所制得的该益生菌组方产品作为益生菌健康食品，应用于改善女性细菌性阴道炎(bv)和霉菌性阴道炎(vvc)，对细菌性阴道炎(bv)有改善影响达81％，对霉菌性阴道炎(vvc)有改善影响达73％。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>郑州和合生物工程技术有限公司
<120>鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、其益生菌组方及该组方的制备方法和应用
<160>2
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<213>鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)
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