微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法与流程

本发明涉及植物的有效成分提取的技术领域，尤其涉及一种微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法。

背景技术：

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷的叶子，我国大部分地区均有栽培，全年均可采收，其具有清肺止咳，降逆止呕的作用，是传统的常用中药。枇杷叶中的活性成分有挥发油、三萜酸类、黄酮类、皂甙类、有机酸类、多酚类等。药理研宄表明其主要活性成分为三萜酸类化合物，目前从枇杷叶中得到的三萜酸类化合物主要为熊果酸、齐墩果酸及其母体衍生物。

熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。熊果酸临床作用有显著而迅速降低谷丙转氨酶和血清转氨酶活性、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点。

齐墩果酸是从龙胆科植物獐牙菜属的青叶胆全草或女贞子的果实中分离提取而得的一种五环三萜类化合物，以游离体和配糖体存在于多种植物中。齐墩果酸在植物中存在很广泛，一般含量0.2％～2％。葫芦科植物罗锅底含量较高为1.5％～2％，女贞子果实含量0.6％～0.7％。齐墩果酸为白色针状结晶(乙醇)，无臭、无味，对酸、碱不稳定，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。齐墩果酸为广谱抗菌药，临床上用于护肝降酶，治疗支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎、牙周炎、菌痢、急性肠胃炎、泌尿系统感染。另外，临床上还用于治疗急性肝炎。

从枇杷叶中提取熊果酸和齐墩果酸的方法主要有冷浸法、回流提取法、超声辅助提取法、索氏提取法等，但提取率一般在92％-93.56％，且提取时间长，溶剂用量较大。因此，枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的提取纯度以及提取率仍有待提高，以保证提取效率。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法，有效提高熊果酸和齐墩果酸的纯度和提取率，操作省时，成本消耗降低。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法，包括：

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过30-50目筛，置于微波回流萃取装置内，加入质量浓度为50-95％的乙醇溶液，经微波辅助回流提取得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为40℃-90℃，微波提取时间5-60min；微波功率为200-800w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为50-95％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为50℃-95℃，提取时间为20-50min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至8-11，水浴加热10-15min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至2-4，之后用等体积的ph值为2-4的酸性水溶液进行稀释，水浴加热10-15min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度均在96％以上，熊果酸的得率在3.1mg/g以上，齐墩果酸的得率在0.48mg/g以上。

优选的是，步骤1中，乙醇溶液的质量浓度为95％，微波提取温度为60℃，微波提取时间为15min，微波功率300w。

优选的是，步骤2中，质量浓度为50-95％的所述乙醇溶液与所述第一过滤物的液固比为10-30：1ml/g。

优选的是，步骤1所述微波回流萃取装置包括：

壳体，其内侧设置夹层，所述夹层内设置微波发生器，所述壳体顶端设置开口。

萃取瓶，其以可转动的方式设置在所述壳体内，所述萃取瓶设置为螺旋状的中空结构管体，所述萃取瓶顶端的开口与所述壳体顶端的所述开口适配：

回流装置，其包括设置在所述壳体开口上端的导气管和冷凝管。

优选的是，所述萃取瓶可转动设置的方式为：所述壳体中部底端设置与所述萃取瓶底端适配的转盘，所述转盘外侧对称设置卡固装置，所述卡固装置包括支杆和设置在所述支杆顶端的卡凸，所述卡凸适配所述萃取瓶螺旋状结构之间的间隙。

优选的是，所述萃取瓶螺旋结构管的内径设置为0.8-1.2厘米，所述萃取瓶螺旋状中空结构相邻管体之间的空隙设置为0.5-0.8厘米。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过将粉碎后的枇杷叶原料置于微波回流萃取装置内，并与作为溶剂的质量浓度为50-95％的乙醇溶液混合提取枇杷叶内的熊果酸和齐墩果酸，利用微波辅助萃取熊果酸和齐墩果酸的同时，结合回流提取，从而提高提取熊果酸和齐墩果酸的效率，并通过对微波回流提取后的过滤物进行二次回流的方式，保证熊果酸和齐墩果酸提取的充分性和溶出率，且通过将第一提取液和第二提取液合并的方式，对其混合液进行相应的处理，以保证对熊果酸和齐墩果酸得率的有效准确性；并通过在混合提取液内加入氢氧化钠，将所得溶液调整ph值至8-11，能有效地去除生物碱和多酚类，以提高熊果酸和齐墩果酸粗提取物的纯度；然后在所述第一过滤液内加硫酸溶液，并将溶液的ph值调整至2-4，有效保留熊果酸和齐墩果酸，去除溶液中的杂质，从而最大化的提取枇杷叶成分中的熊果酸和齐墩果酸，并保持其纯度，使得经高效液相色谱法进行测定的所述熊果酸和齐墩果酸的纯度均在96％以上，熊果酸的得率在3.1mg/g以上，齐墩果酸的得率在0.48mg/g以上，有效提高了熊果酸和齐墩果酸的提取率，减少了提取溶剂的用量，成本消耗降低。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法的结构框图；

图2为本发明中所述微波回流萃取装置的结构示意图；

图3为本发明中所述萃取瓶的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本发明提供一种微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法，包括：

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过30-50目筛，置于微波回流萃取装置内，加入质量浓度为50-95％的乙醇溶液，经微波辅助回流提取得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为40℃-90℃，微波提取时间5-60min；微波功率为200-800w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为50-95％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为50℃-95℃，提取时间为20-50min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至8-11，水浴加热10-15min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至2-4，之后用等体积的ph值为2-4的酸性水溶液进行稀释，水浴加热10-15min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度均在96％以上，熊果酸的得率在3.1mg/g以上，齐墩果酸的得率在0.48mg/g以上。

在上述方案中，通过将粉碎后的枇杷叶原料置于微波回流萃取装置内，并与作为溶剂的质量浓度为50-95％的乙醇溶液混合提取枇杷叶内的熊果酸和齐墩果酸，利用微波辅助萃取熊果酸和齐墩果酸的同时，结合回流提取，从而提高提取熊果酸和齐墩果酸的效率，并通过对微波回流提取后的过滤物进行二次回流的方式，保证熊果酸和齐墩果酸提取的充分性和溶出率，且通过将第一提取液和第二提取液合并的方式，对其混合液进行相应的处理，以保证对熊果酸和齐墩果酸得率的有效准确性；并通过在混合提取液内加入氢氧化钠，将所得溶液调整ph值至8-11，能有效地去除生物碱和多酚类，以提高熊果酸和齐墩果酸粗提取物的纯度；然后在所述第一过滤液内加硫酸溶液，并将溶液的ph值调整至2-4，有效保留熊果酸和齐墩果酸，去除溶液中的杂质，从而最大化的提取枇杷叶成分中的熊果酸和齐墩果酸，并保持其纯度，使得经高效液相色谱法进行测定的所述熊果酸和齐墩果酸的纯度均在96％以上，熊果酸的得率在3.1mg/g以上，齐墩果酸的得率在0.48mg/g以上，有效提高了熊果酸和齐墩果酸的提取率，减少了提取溶剂的用量，成本消耗降低。

一个优选方案中，步骤1中，乙醇溶液的质量浓度为95％，微波提取温度为50℃，微波提取时间为30min，微波功率300w。

在上述方案中，果酸为弱极性分子，乙醇体积增大有利于果酸的溶出，乙醇质量浓度达到95％时，熊果酸和齐墩果酸的溶出量较大，质量浓度高于95％，熊果酸和齐墩果酸的提取量反而下降，因为高浓度的乙醇使蛋白质变性加快，在一定程度上抑制了乙醇向细胞内的渗透，妨碍了熊果酸和齐墩果酸的溶出；在微波提取温度较低条件下，提取量随温度的升高而增加，当微波提取温度达到60℃时，提取量达到峰值，微波提取温度超过60℃后，熊果酸和齐墩果酸的提取量反而下降，因为温度过高会加速乙醇的挥发，降低提取液中乙醇的体积分数，从而降低了提取量；微波提取时间为15min时，提取量达到最大，微波提取时间超过15min时，提取量有轻微的下降，因为提取时间过长对熊果酸和齐墩果酸的结构造成破坏，引起提取量的下降；而且时间长杂质溶出量增多，给后续分离精制带来困难，微波功率为300w，提取量达到最大值，微波功率大于300w时，提取量接近平衡并缓慢下降，因为升温速度过快，造成了提取液的爆沸，从而导致了提取液的损失，而且功率增加会增加能耗；因此，优选乙醇溶液的质量浓度为95％，微波提取温度为60℃，微波提取时间为15min，微波功率300w。

一个优选方案中，步骤2中，质量浓度为50-95％的所述乙醇溶液与所述第一过滤物的液固比为10-30：1ml/g。

在上述方案中，在液固比达到15：1ml/g，熊果酸和齐墩果酸的提取量达到最大值，液固比继续增加，熊果酸和齐墩果酸的提取量反而下降，因为提取溶剂达到一定比例后，熊果酸和齐墩果酸达到溶解平衡，增加用量会增加细胞内其他杂质的溶出，浪费溶剂，而且会使浓缩时间过长，增加能耗，降低回收率。

一个优选方案中，步骤1所述微波回流萃取装置包括：

壳体，其内侧设置夹层，所述夹层内设置微波发生器，所述壳体顶端设置开口。

萃取瓶，其以可转动的方式设置在所述壳体内，所述萃取瓶设置为螺旋状的中空结构管体，所述萃取瓶顶端的开口与所述壳体顶端的所述开口适配：

回流装置，其包括设置在所述壳体开口上端的导气管和冷凝管。

在上述方案中，如图2-3所示，通过在所述壳体夹层内设置微波发生器，以通过微波发生器发出的微波对所述萃取瓶内的溶液进行微波辅助提取，同时结合回流提取的方式，以弥补微波提取的不足，同时利用微波提取快速、节能的优势。所述回流提取的方式，通过回流装置，即导气管以及冷凝管对接于壳体顶端开口的方式，与萃取瓶内的溶液相通，从而使得微波辅助提取与回流提取同时进行，以相对互补的方式，实现对熊果酸和齐墩果酸的高效提取。

一个优选方案中，所述萃取瓶可转动设置的方式为：所述壳体中部底端设置与所述萃取瓶底端适配的转盘，所述转盘外侧对称设置卡固装置，所述卡固装置包括支杆和设置在所述支杆顶端的卡凸，所述卡凸适配所述萃取瓶螺旋状结构之间的间隙。

在上述方案中，壳体前端设置有盖体，便于从所述盖体处放置萃取瓶至转盘上，通过所述转盘的转动，带动所述萃取瓶转动，所述萃取瓶螺旋状的中空结构设置，使得大体积混合在一起的溶液，可以均匀分散在每层的螺旋中空结构内，从而将溶液均匀有效的分散在壳体空间内，便于微波投射并在同一时间内，均匀的作用于溶液内的每一部分，避免微波投射作用不均匀造成局部过热的现象；所述转盘外的卡固装置，通过支杆对萃取瓶的瓶身底端进行固定，防止其歪斜，再利用卡凸，固定于所述螺旋状中空结构的层隙内，以对瓶身进行加固，使得萃取瓶在转动中更加平稳。

一个优选方案中，所述萃取瓶螺旋结构管的内径设置为0.8-1.2厘米，所述萃取瓶螺旋状中空结构相邻管体之间的空隙设置为0.5-0.8厘米。

在上述方案中，通过将所述内径设置为0.8-1.2厘米，使得溶液的分布更为均匀，以保证微波投射作用的均匀性；通过将所述层隙即每层螺旋管之间的间隙设置0.5-0.8厘米，以保证在壳体内的整个萃取瓶的容量。

实施例1

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过30目筛，置于微波回流萃取装置内，加入质量浓度为50％的乙醇溶液，经微波辅助回流提取得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为40℃，微波提取时间60min；微波功率为200w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为50％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为50℃，提取时间为50min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至8，水浴加热10min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至2，之后用等体积的ph值为2的酸性水溶液进行稀释，水浴加热10min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别在96.1％和96.5％，熊果酸的得率在3.11mg/g，齐墩果酸的得率在0.481mg/g。

实施例2

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过40目筛，置于微波回流萃取装置内，加入质量浓度为85％的乙醇溶液，经微波辅助回流提取得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为90℃，微波提取时间15min；微波功率为500w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为85％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为95℃，提取时间为20min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至9，水浴加热12min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至3，之后用等体积的ph值为3的酸性水溶液进行稀释，水浴加热12min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别为96.3％和96.7％以上，熊果酸的得率在3.15mg/g以上，齐墩果酸的得率在0.483mg/g以上。

实施例3

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过50目筛，置于微波回流萃取装置内，加入质量浓度为95％的乙醇溶液，经微波辅助回流提取得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为60℃，微波提取时间15min；微波功率为300w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为95％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为70℃，提取时间为40min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至11，水浴加热15min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至4，之后用等体积的ph值为4的酸性水溶液进行稀释，水浴加热15min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别在97％和97.3％以上，熊果酸的得率在3.3mg/g，齐墩果酸的得率在0.49mg/g。

实施例4

步骤1、将枇杷叶干燥粉碎，过50目筛，置于微波合成萃取仪内进行提取，加入质量浓度为95％的乙醇溶液，提取并过滤得第一提取液和第一过滤物；微波提取温度为60℃，微波提取时间15min；微波功率为300w。

步骤2、取第一过滤物再次加入质量浓度为95％的乙醇溶液，进行回流提取，得第二提取液；提取温度为70℃，提取时间为40min。

步骤3、将第一提取液和第二提取液合并后得混合提取液，加入质量浓度为5％的氢氧化钠溶液，将混合提取液的ph值调整至11，水浴加热15min，过滤得第一过滤液。

步骤4、在第一过滤液内加质量浓度为5％的硫酸溶液，并将ph值调整至4，之后用等体积的ph值为4的酸性水溶液进行稀释，水浴加热15min，之后冷藏、过滤、冲洗，得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物。

步骤5、将步骤4所得熊果酸和齐墩果酸的粗提取物用硅胶柱层析分离，分别得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品。

步骤6、将步骤5所得高纯度熊果酸样品和高纯度齐墩果酸样品干燥，并采用高效液相色谱法进行含量测定，得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别在93％和93.2％以上，熊果酸的得率在2.5mg/g，齐墩果酸的得率在0.36mg/g。

由实施例1-4可看出，实施例1-3中，实施例3为本申请最优方案，其所提取得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别在97％和97.3％以上，熊果酸的得率在3.3mg/g，齐墩果酸的得率在0.49mg/g，实施例4中采用本申请最优方案，但采用的是普通的微波合成萃取仪进行微波辅助提取，得熊果酸和齐墩果酸的纯度分别在923％和93.2％以上，熊果酸的得率在2.5mg/g，齐墩果酸的得率在0.36mg/g，较实施例1-3，其提取的纯度以及提取率明显降低，可见，本申请要求保护的微波萃取枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸的方法，不仅有效提高熊果酸和齐墩果酸的纯度，同时大大的提高了熊果酸和齐墩果酸的提取率，且步骤相对简单，操作省时，成本消耗降低。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。