一种利用虎奶菇生物合成纳米硒的方法与流程

本发明涉及一种利用虎奶菇生物合成纳米硒的方法，属于生物纳米技术领域

背景技术：

硒(selenium，se)是人和动物维持正常生理活动所必须的一种微量元素，是体内抗氧化酶———谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的重要组成部分，具有增强免疫力、抗癌、抗氧化等多种功能。硒的缺乏会导致多种疾病，如克山病、心血管疾病、高血压、肝硬化等。我国硒的分布极不均衡，开发安全高效的补硒途径是我国亟待解决的问题。

自然界中的硒有多种形态，包括负二价、零价、正四价、正六价等。硒的形态不同，其生物活性和毒性差异很大。其中，纳米硒有别于灰色单质硒(零价)、无机硒(负二价、正四价、正六价)和有机硒等，是一种具有纳米尺寸的砖红色单质硒，其毒性远低于无机硒和有机硒，却比有机硒(如硒代蛋氨酸等)具有更高的生物活性。因此，纳米硒是一种更为安全有效的补硒途径。

近年来，研究人员发现包括藻类、细菌、真菌、放线菌等在内的多种微生物具有将无机硒转化为砖红色纳米硒的能力。生物转化法具有比化学/物理制备方法更为环保、节能的特点，因此受到广泛关注。其中，大型食药用真菌因本身独特的生理活性及代谢过程，在纳米硒生物合成方面具有更为独特的优势，但相关研究还处于起步阶段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物合成纳米硒及纯化方法，通过虎奶菇(pleurotustuber-regium)菌丝体液态发酵，获得富含纳米硒的虎奶菇菌丝体，该方法制备条件温和、操作简便，在生物合成硒纳米材料领域具有潜在的应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种生产纳米硒的方法，所述方法是在含四价无机硒盐的环境中利用虎奶菇(pleurotustuber-regium)发酵，生产纳米硒。

在一种实施方式中，所述方法收集发酵产物中的纳米硒；所述发酵产物包括但不限于虎奶菇菌丝体、发酵液、发酵液离心后的沉淀物、虎奶菇菌体裂解液。

在一种实施方式中，所述方法在接种后发酵至4-6d时分别加入浓度为0.1-20mm的na2seo3溶液，继续发酵至总时间7-9d。

在一种实施方式中，收集发酵产物，并从中分离和/或纯化纳米硒。

在一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

(1)采用pda培养基对虎奶菇菌种进行活化；

(2)将步骤(1)活化获得的虎奶菇菌丝转接至种子培养基中，于26-32℃培养3-5d；

(3)将步骤(2)培养的种子液按10⁵个孢子/ml发酵液转接至发酵培养基中，26-32℃，150-200rpm发酵7～9d。

在一种实施方式中，所述种子培养基含有葡萄糖20-40g/l，酵母浸粉2-8g/l，磷酸二氢钾(kh2po4)0.2-2g/l，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.1-2g/l。

在一种实施方式中，所述发酵培养基含有葡萄糖20-40g/l，酵母浸粉2-8g/l，磷酸二氢钾(kh2po4)0.2-2g/l，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.1-2g/l。

在一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：

(1)用pda培养基对菌株进行活化培养，pda培养基配方为：200g去皮土豆切丁后加1l去离子水100℃煮30-40min，滤出汁加20g葡萄糖，20g琼脂，加热溶解，补水至总体积1l，121℃高压灭菌20min，冷却倒平板，凝固后将虎奶菇菌株接种于pda平板上，30℃培养7d；

(2)将长满虎奶菇菌丝的pda固体培养基在超净台中切成约1cm²/片，挑取5-15片加入种子培养液，培养基为：葡萄糖20-40g/l，酵母浸粉2-8g/l，磷酸二氢钾(kh2po4)0.2-2g/l，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.1-2g/l。接种后以160-200rpm的转速，于26-32℃摇床2-5d；

(3)将种子培养液接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，所述的液态发酵接种量为1-15％，发酵温度26-32℃，摇床转速150-200rpm，所述的液态发酵培养基与种子培养基一致。接种后发酵至4-6d时分别加入浓度为0.1-20mm的na2seo3溶液，继续发酵至总时间7-9d；

(4)发酵结束后，离心、过滤、洗涤菌体/沉淀发酵液、冷冻干燥、粉碎、获得纳米硒干粉。

在一种实施方式中，步骤(4)的具体步骤为：将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，对菌体细胞进行破碎，收集菌体裂解液；将菌体裂解液于5000-8000rpm离心10-20min，收集沉淀并以无菌生理盐水分散清洗，于5000-8000rpm离心20-30min，清洗过程重复3遍；将沉淀重悬于20ml去离子水中，经截留分子量3000da透析袋透析后，冷冻干燥，得纳米硒干粉。

在一种实施方式中，步骤(4)的具体步骤为：将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，菌体冷冻干燥，磨粉过80目筛，得纳米硒干粉。

在一种实施方式中，步骤(4)的具体步骤为：将发酵液过30目筛，去除菌体后，再将发酵液由定量滤纸过滤除去固形物，经1万分子量的超滤膜超滤后收集回流液，冷冻干燥，即得纳米硒干粉。

本发明的第二个目是提供应用上述任一所述方法制备的纳米硒粉。

本发明还要求保护应用所述方法发酵获得的虎奶菇子实体、菌柄、菌核或菌丝体。

有益效果：本发明利用虎奶菇(pleurotustuber-regium)菌丝体生物合成纳米硒，产率达2.60％(即2.60g/100g菌体干重)，转化率达81.45％。该方法采用微生物发酵工艺，具有条件温和，环境友好，操作简便，安全高效等特点，所制备纳米硒在富硒功能食品、富硒材料、及医药产品领域均具有潜在的工业化应用前景。

附图说明

图1为不同无机硒浓度条件下虎奶菇菌丝体富硒效果(实际为砖红色)。

图2为虎奶菇菌丝体在不同na2seo3浓度下的纳米硒产量及转化率。

图3为虎奶菇菌丝体胞内合成纳米硒的透射电镜(tem)切片图。

图4为se(iv)添加时间对菌体生长状况的影响。

具体实施方式

产率、纳米硒转化率的计算方法：

产率＝菌体中纳米硒总质量(g)/发酵后得到菌体干重(g)×100％

纳米硒转化率＝菌体中纳米硒总摩尔数(mol)/加入4价硒摩尔数(mol,以na2seo3摩尔数计)×100％

实施例1：

将长满虎奶菇菌丝的pda固体培养基在超净台中切成约1cm²/片，挑取10片加入种子培养液，培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，磷酸二氢钾(kh2po4)1g/l，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.6g/l。接种后以180rpm的转速，于30℃摇床3d。

将种子培养液接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，所述的液态发酵接种量为10⁵个孢子/ml发酵液，发酵温度30℃，摇床转速180rpm，所述的液态发酵培养基与种子培养基一致。接种后发酵至6d时，向200ml发酵体系中加入0.208gna2seo3(即发酵液中无机硒浓度为6mm)继续发酵至总时间9d，获得呈砖红色的虎奶菇菌体和橘黄色发酵液。

发酵结束后，将发酵液过30目筛，收集虎奶菇菌体，用去离子水清洗5遍，采用组织匀浆机破坏菌体细胞结构，得到菌体裂解液；菌体裂解液于8000rpm离心15min，所得沉淀以无菌生理盐水分散清洗，于8000rpm离心20min，清洗过程重复3遍；将沉淀重悬于20ml去离子水中，经截留分子量为3000da的透析袋透析后，冷冻干燥，得18mg纳米硒干粉，其中纳米硒含量为3.72％。

实施例2：

在实施例1的基础上，调整发酵液中na2seo3的终浓度分别为0.1,0.3,0.6,0.9,1.2,2.4,3.6,4.8mm，虎奶菇菌丝体在不同浓度na2seo3的溶液中的纳米硒转化效果如图1和图2，硒添加量为3.6～6mm时，菌丝体中纳米硒含量达2.0-2.5％，添加量为2.4mm时，菌丝体产量最高，达5.24g/l，转化率为57.29％；添加量为1.2mm时，硒转化率最高，达81.45％。

实施例3：

在实施例1的基础上，调整na2seo3溶液的添加时间分别为第4，5，6d，自接种后第4d添加，菌体重量可达0.922g/l，纳米硒产率为1.03％；自第5d添加，菌体重量可达1.51g/l，纳米硒产率为1.89％；自第6d添加，菌体干重可达3.26g/l，纳米硒产率为2.60％。

实施例4：

将长满虎奶菇菌丝的pda固体培养基在超净台中切成约1cm²/片，挑取5片加入种子培养液，培养基为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉6g/l，磷酸二氢钾(kh2po4)1.2g/l，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.8g/l。接种后以180rpm的转速，于30℃摇床5d。

将种子培养液接入灭菌后的液态发酵培养基进行液态发酵，所述的液态发酵接种量为10％，发酵温度28℃，摇床转速180rpm，所述的液态发酵培养基与种子培养基一致。接种后发酵至第4d时加入na2seo3溶液使发酵液中na2seo3浓度为10mm，继续发酵至总时间8d。

发酵结束后，一方面直接从发酵瓶中获取菌体，0.1％戊二醛固定12h，0.1％锇酸继续固定12h，固定后丙酮梯度脱水，环氧树脂epon812:环氧丙烷＝1:2和2:1分别包埋24小时，室温下用pbs和去离子水分别洗两遍，再放置于镍网格自然烘干，烘干后用1％醋酸铀和柠檬酸分别染色10min，超薄切片后用于透射电子显微镜(tem)观察(图3)。由图可见，在细胞内含有大量的纳米硒颗粒，颗粒直径在15～50nm。另一方面将发酵液过30目筛，收集菌体，用去离子水清洗3-5遍，菌体冷冻干燥，磨粉过80目筛，得含纳米硒的菌粉。

实施例5：

在实施例2的基础上，发酵结束后，将发酵液过30目筛，收集菌体后，发酵液进一步由定量滤纸过滤除去固形物，经1万分子量的超滤膜超滤后收集回流液，冷冻干燥，即得纳米硒干粉。医疗中，利用纳米硒干粉配合中药药材用于治疗银屑病，硒含量达0.5％～5％，粒径低于20um。本发明所得纳米硒干粉具有复配应用于医药领域的潜力。

对比例1：

具体实施方式同实施例4，区别在于，向发酵体系中加入6价或2价硒，结果显示，虎奶菇菌体中均未检出纳米硒，菌体呈现正常的米白色，而非实施例中所呈现的砖红色(纳米硒特有颜色)。

对比例2：

具体实施方式同实施例3，区别在于，自接种当天添加(即第0天)四价硒，发酵结束后菌体干重仅为0.089g/l，纳米硒产率为0.05％；自第1d添加，菌体重量为0.118g/l，纳米硒产率为0.18％；自第2d添加，菌体重量为0.243g/l，纳米硒产率为0.47％；自第3d添加，菌体重量为0.461g/l，纳米硒产率为0.74％。添加无机硒时间过早，菌体生长受到明显抑制，产率均低于1％。因无机硒对菌体生长具有一定的毒性，在发酵初期添加对菌体生长抑制较强，添加后菌体生长情况如图4。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。